王 豐，于 倩，王 華

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥劑科，吉林 長春130033)

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洛鉑抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡機制的研究

王 豐，于 倩*，王 華*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥劑科，吉林 長春130033)

目的 研究洛鉑對人膀胱癌細(xì)胞的抑制作用，并揭示其可能的作用機制。方法 體外常規(guī)培養(yǎng)人膀胱癌細(xì)胞株5637。利用MTT細(xì)胞增殖法檢測洛鉑的細(xì)胞毒性；采用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測癌細(xì)胞的凋亡程度；通過傷口愈合實驗觀察細(xì)胞的遷移；通過Transwell小室測定評估洛鉑對5637細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響；利用蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)。結(jié)果 洛鉑抑制人膀胱癌細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡,下調(diào)膀胱癌5637細(xì)胞Survivin和Bcl-2的表達(dá)水平,上調(diào)其Bax和Caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)論 洛鉑的細(xì)胞毒性誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞凋亡，有利于洛鉑對膀胱癌治療的深入研究。

洛鉑；膀胱癌；細(xì)胞凋亡；侵襲和遷移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1634)

洛鉑是第三代鉑類抗腫瘤制劑的代表，在臨床前腫瘤模型的研究中有廣泛的活性，對于某些抗順鉑和卡鉑的腫瘤模型有較好的抑制作用[1]。研究表明，洛鉑對不同類型的腫瘤中都具有抗腫瘤活性，其中包括黑色素瘤、肝細(xì)胞癌、大腸癌、膽管癌、卵巢癌和宮頸癌等[2-7]。本實驗通過研究洛鉑對人源膀胱癌(5637)細(xì)胞株的影響及其作用機制，為洛鉑治療膀胱癌的臨床研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

洛鉑購自海南長安國際制藥有限公司；第一抗體Caspase-3、Survivin、Bax、Bcl-2、β-actin購自CST公司； 熒光第二抗體購自O(shè)dyssey公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、0.5%結(jié)晶紫染色液購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel基質(zhì)、RPMI-1640培養(yǎng)基購自Corning公司；無水甲醇、二甲基亞砜(DMSO)購自北京化工廠；吐溫20購自天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司；青霉素和鏈霉素(×100)、胰蛋白酶-EDTA購自Biosharp公司；胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自Amresco公司；蛋白測定試劑盒購自北京碧云天有限公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

人源膀胱癌(5736)細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞所。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖測定

通過顯微鏡計數(shù)，將細(xì)胞稀釋成濃度為1×105個/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。 棄去孔內(nèi)上清液，加入含不同濃度洛鉑的10%血清培養(yǎng)基，每組設(shè)5個平行樣本，對照組加入DMSO。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μl MTT (5 mg/mL),在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，將96孔板放于孔板振蕩器上振蕩20 min。酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測吸光度值(A)。計算抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡測定

用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒來分析不同濃度的洛鉑對人源膀胱癌(5637)細(xì)胞的凋亡作用。簡要步驟如下：將細(xì)胞(1×105個/孔)接種于6孔板中，加入含不同濃度洛鉑的10%血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入Annexin V和碘化丙啶，暗室反應(yīng)10 min。數(shù)據(jù)由流式細(xì)胞儀分析。

1.5 細(xì)胞愈合遷移

通過傷口愈合遷移的測定來評估細(xì)胞的遷移能力。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到80%-90%時，細(xì)胞單層用無菌的200 μl槍頭刮下，并加入含有不同濃度洛鉑的非血清培養(yǎng)基，孵育24小時后，固定并拍照。

1.6 Transwell小室遷移和侵襲

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報道[8]，用Transwell小室(8微米孔徑，Corning公司)測定細(xì)胞遷移，其中實驗設(shè)計有所改進(jìn)。人源膀胱癌(5637)細(xì)胞饑餓處理過夜，Transwell上室加入200 μl含有1×106個人源膀胱癌(5637)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。在小室底部加入600 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。上下小室都加入不同濃度的洛鉑。24小時后，用棉簽將上室未遷移的細(xì)胞擦去。遷移的細(xì)胞固定在甲醇中，用1%的結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野進(jìn)行計數(shù)并拍照。侵襲實驗按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[9]。將Matrigel基質(zhì)1∶30稀釋，加到Transwell上室膜上，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中放置2小時?；|(zhì)膠聚合后，Transwell上室加入200 μl含有1×106個人源膀胱癌(5637)細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。在小室底部加入600 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。上下小室都加入不同濃度的洛鉑。培養(yǎng)24小時后，用棉簽將上室Matrigel基質(zhì)和未遷移的細(xì)胞擦去，用1%的結(jié)晶紫染色，然后在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。

1.7 Western blot

Western blot的實驗操作在之前文獻(xiàn)基礎(chǔ)上有所改進(jìn)[10]。用含有不同濃度洛鉑的10%血清培養(yǎng)基處理人源膀胱癌(5637)細(xì)胞24小時，用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，加入200 μl RIPA 裂解液，最后離心收集上清液的蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。加入等量樣品的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(0.2 μ PVDF)膜上，然后將膜用5%的脫脂牛奶在室溫孵育2小時，并在4℃下與特定的第一抗體孵育過夜，PBS洗滌3次后，與相應(yīng)的熒光第二抗體避光孵育，反應(yīng)性條帶用Odyssey雙色紅外激光成像儀檢測結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,統(tǒng)計比較采用雙尾t檢驗 ,P的顯著性用以下標(biāo)示：*P<0.05;**P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 洛鉑誘導(dǎo)人源膀胱癌5637細(xì)胞增殖

通過MTT實驗來測定洛鉑對人源膀胱癌(5637)細(xì)胞的抑制增殖效果。將人源膀胱癌(5637)細(xì)胞用濃度為5,10,20,40 μg/ml的洛鉑分別處理24,48和72小時。結(jié)果如圖1所示，洛鉑對人源膀胱癌(5637)細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并呈濃度和時間依賴性。

圖1 洛鉑對細(xì)胞增殖的作用

2.2 洛鉑誘導(dǎo)人源膀胱癌5637細(xì)胞凋亡

通過Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒來評估洛鉑對人源膀胱癌(5637)細(xì)胞的增殖抑制作用是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)。如圖2A和2B所示，洛鉑處理人源膀胱癌(5637)細(xì)胞24小時后，可明顯觀察到人源膀胱癌(5637)細(xì)胞凋亡的顯著增加。當(dāng)洛鉑濃度為0 μg/mL時，凋亡率分別為1.5%、11.8%、27.6%、34.4%、45.8%(**P<0.01)。

用Western blot檢測5637細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白。在洛鉑給藥24小時后，提取蛋白，檢測Caspase-3、Survivin、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)。如圖2C所示，Caspase-3和Bax蛋白以濃度依賴性的方式增加，而Survivin和Bcl-2蛋白以濃度依賴性的方式降低。

圖2 洛鉑對細(xì)胞凋亡的作用

2.3 洛鉑抑制人源膀胱癌5637細(xì)胞遷移和侵襲

通過傷口愈合實驗和Transwell小室遷移測定實驗評估洛鉑能否抑制5637細(xì)胞遷移和侵襲的能力，如圖3A所示，孵育24小時后細(xì)胞遷移到傷口區(qū)域，從10 μg/ml的洛鉑濃度開始，抑制遷移的效果比較明顯。如圖3B所示，Transwell小室遷移的結(jié)果與傷口愈合實驗相吻合。通過Transwell小室侵襲實驗來評估人源膀胱癌(5637)細(xì)胞在不同洛鉑濃度時侵入膜屏障的能力。如圖3C所示，洛鉑處理組侵入的細(xì)胞明顯減少。

圖3 洛鉑對細(xì)胞遷移和侵襲的影響

3 討論

有研究表明，化學(xué)療法促進(jìn)細(xì)胞凋亡是殺傷癌細(xì)胞的關(guān)鍵機制，腫瘤細(xì)胞的敏感性可能影響到化學(xué)療法的效果[11]。因此，在本研究中，我們通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式來證實洛鉑抑制癌細(xì)胞增殖和降低癌細(xì)胞的生存率。MTT法的測定表明，洛鉑以劑量依賴性和時間依賴性的方式抑制5637細(xì)胞增殖和生長。通過組間兩兩的對比，可以發(fā)現(xiàn)72小時后給藥10 μg/ml,20 μg/ml,40 μg/ml的細(xì)胞抑制率逐漸趨于平緩，也就是說，當(dāng)藥物抑制率達(dá)到一定程度時，增加藥物濃度并不能再提高藥物的抑制率，反而會導(dǎo)致其他的副作用并降低患者的化療耐受性。Caspase-3和Bax以濃度依賴性的方式增加，而Survivin和Bcl-2以濃度依賴性的方式降低。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2參與凋亡的內(nèi)在誘導(dǎo)[12,13]。Caspase-3可通過線粒體依賴性凋亡途徑誘導(dǎo)凋亡[14]。抑制細(xì)胞凋亡(IAP)蛋白家族的最小成員Survivin參與抑制細(xì)胞凋亡的內(nèi)在和外在途徑[15]。因此，線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑可能部分的證實了洛鉑誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的最后凋亡。

遷移和侵襲是惡性腫瘤的主要特征之一，也是導(dǎo)致患者死亡的根本原因。因此，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲可以有效的防止腫瘤的轉(zhuǎn)移[16]。在本研究中，我們通過體外靶向腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲來證明洛鉑對膀胱癌的抗轉(zhuǎn)移能力。實驗結(jié)果表明，用洛鉑處理的5637細(xì)胞可以有效的抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，洛鉑能明顯的抑制膀胱癌細(xì)胞的體外生長，通過與線粒體相關(guān)Caspase-3，Bax蛋白上調(diào)和Survivin，Bcl-2蛋白下調(diào)的途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，為以后的臨床研究提供參考依據(jù)。

[1]Mckeage MJ.Lobaplatin:a new antitumour platinum drug[J].Expert Opin Investig Drugs,2001,10:119.

[2]Yang F,Yu Y,Lei Q，et al.Lobaplatin arrests cell cycle progression induces apoptosis and impairs migration and invasion in B16-F10 melanoma cell line in vitro[J].Biomedicine & phamacotheraphy,2015,69:402.

[3]Wu Q,Qin S,Teng F,et al.Lobaplatin arrests cell cycle progression in human hepatocellular carcinoma cells[J].J Hematol Oncol,2010,3:43.

[4]Dai H,Liu L,Qin S,et al.Lobaplatin suppresser proliferation and induces apoptosis in human colorectal carcinoma cell line LOVO in vitro[J].Biomed Pharmacother ,2011,65:137.

[5]Wang Z,Tang X,Zhang Y,et al.Lobaplatin induces apoptosis and arrests cell cycle progression in human cholangiocarcinoma cell line RBE[J].Biomed Pharmacother,2012,66:161.

[6]Gietema J A,de Vries E G,Sleijfer D T,et al.A phase I study of 1,2-diamminomethyl-cyclobutane-platinum (II)-lactate (D-19466;lobaplatin) administered daily for 5 days[J].Br J Cancer,1993,67:396.

[7]Li X,Ran L,Fang W,et al.Lobaplatin arrests cell cycle progression,induces apoptosis and alters the proteome in humancervical cancer cell line CaSki[J].Biomed Pharmacother,2014,68:291.

[8]Xu S,Cui L,Ma D,et al.Effect ofITGA5 down-regulation on the migration capacity of human dental pulp stem cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):14425.

[9]Kong L,Man D,Wang T,et al.Downregulation of LSD1 suppresses the proliferation,tumorigenicity and invasion of papillary thyroid carcinoma K1 cells[J].Oncol Lett,2016,11(4):2475.

[10]Ge Z,Wang Z,Yu T,et al.Morphine improved the antitumor effects on MCF-7 cells in combination with 5-Fluorouracil [J].Biomedicine & Pharmacotherapy,2014,68(3):299.

[11]Han Y,He H,Peng F,et al.SKLB70326,a novel small-molecule inhibitor of cell-cycle progression,induces G0G1 phase arrest and apoptosis in human hepatic carcinoma cells[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2012,421:684.

[12]Fontenay M,Cathelin S,Amiot M,et al.Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases[J].Oncogene,2006,25(34):4757.

[13]Fesik SW.Promoting apoptosis as a strategy for cancer drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2005,5:876.

[14]Wen X,Tang M,Qi D,et al.Butylphthalide Suppresses Neuronal Cells Apoptosis and Inhibits JNK-Caspase3 Signaling Pathway After Brain Ischemia /Reperfusion in Rats[J].Cellular & Molecular Neurobiology,2016(in press ).Eurb 2016 Mar 25.

[15]Tamm I,Wang Y,Sausville E,et al.IAP-family protein Survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95),Bax,caspases,and anticancer drugs[J].Cancer Res,1998,58(23):5315.

[16]Friedl P,Wolf K.Tumour-cell invasion and migration:diversity and escape mechanisms[J].Nat Rev Cancer,2003,3:362.

Inhibitory Effect of Lobaplatin on Cell Proliferation of Bladder Cancer and Possible Mechanism of Inducing Apoptosis

WANGFeng,YUQian,WANGHua.

(DepartmentofPharmacy,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To assess the inhibition effect of lobaplatin on human bladder cancer cells,and reveal the possible mechanisms.Methods Bladder cancer cell line 5637 was routinely cultured in vitro.The cytotoxic effect of lobaplatin was determined by MTT cell proliferation assay;Annexin V-FITC / PI KIT was used to detect the degree of apoptosis by flow cytometry;Wound healing assay was conducted to inspect the migration of cells;Transwell chamber assay was completed to assess the effect of lobaplatin on invasion and migration of the bladder cancer cells;western blot was performed to detect the expression of apoptotic gene.Results Lobaplatin can inhibit human bladder cancer cells and induce apoptosis.In addition,lobaplatin can decrease the expression of Survivin and Bcl-2and increase the expression of Bax and Caspase-3 in the cell line 5637.Conclusion Lobaplatin cytotoxicity can induce apoptosis of bladder cancer cells,which is helpful to in-depth study on the therapy of bladder cancer using lobaplatin.

Lobaplatin;Bladder cancer;Apoptosis;Invasion and migration

吉林省白求恩自然科學(xué)基金(20160101032JC)

1007-4287(2016)10-1634-04

R737.14

A

2015-08-28)

*通訊作者