MiRNA-25在非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及其作用機(jī)制

周建英 劉震天 陳穎蘭

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·基礎(chǔ)研究·

MiRNA-25在非小細(xì)胞肺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及其作用機(jī)制

周建英 劉震天 陳穎蘭

目的 探討miRNA-25在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)吉非替尼耐藥細(xì)胞中的表達(dá)及其作用機(jī)制。方法 采用RT-PCR法檢測(cè)miRNA-25在NSCLC吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/G及親本細(xì)胞PC9中的表達(dá)；采用體外轉(zhuǎn)染法將miRNA-25模擬物或抑制物分別轉(zhuǎn)染PC9和PC9/G細(xì)胞，采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性的變化；并用Westem blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中Bim的表達(dá)變化。采用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA-25是否作用于Bim基因的3'-UTR區(qū)預(yù)測(cè)靶位。結(jié)果 miRNA-25在PC9/G細(xì)胞中的表達(dá)水平是PC9細(xì)胞的(7.15±1.26)倍(P<0.01)。PC9細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-25模擬物后，吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞增殖的抑制率較轉(zhuǎn)染前明顯下降(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)Bim表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染前明顯下降(P<0.05)。PC9/G細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miRNA-25抑制物后，吉非替尼對(duì)PC9/G細(xì)胞增殖的抑制率與轉(zhuǎn)染前比較明顯增加(P<0.01)，細(xì)胞內(nèi)Bim表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染前明顯增高(P<0.05)。經(jīng)雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證Bim是miRNA-25的靶基因。結(jié)論 miRNA-25在NSCLC耐藥細(xì)胞PC9/G中異常高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性，miRNA-25可能通過(guò)作用于Bim參與NSCLC細(xì)胞吉非替尼耐藥的發(fā)生和發(fā)展。

非小細(xì)胞肺癌；吉非替尼；耐藥；miRNA-25

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1567～1571)

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌的80%左右[1]。近年來(lái)，以吉非替尼和厄洛替尼為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs) 逐漸成為治療NSCLC的重要手段[2-3]。但由于存在原發(fā)或獲得耐藥問(wèn)題， EGFR-TKIs僅對(duì)部分NSCLC患者有效。目前這種耐藥機(jī)制尚未完全明確[4-5]。

MiRNA是一種廣泛存在于各種生物體中的小RNA分子，可在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)。大量的研究證實(shí)，miRNA參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在腫瘤細(xì)胞耐藥性形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[6-8]。近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-25參與了腫瘤細(xì)胞耐藥形成[9]，但是miRNA-25是否參與了NSCLC細(xì)胞EGFR-TKIs耐藥的調(diào)節(jié)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以吉非替尼敏感肺癌細(xì)胞株P(guān)C9與吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞株P(guān)C9/G為細(xì)胞模型，探討miRNA-25是否參與調(diào)節(jié)NSCLC吉非替尼耐藥及其可能的分子機(jī)制，為臨床NSCLC EGFR-TKIs耐藥的防治提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

NSCLC吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/G及親本細(xì)胞PC9由本實(shí)驗(yàn)室保存。吉非替尼為美國(guó)阿斯利康公司產(chǎn)品；胎牛血清及RPMI 1640為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；細(xì)胞蛋白裂解液為北京碧云天公司產(chǎn)品；兔抗人Bim抗體及β-actin抗體為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗為北京中杉金橋公司產(chǎn)品；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒為美國(guó)Pierce公司產(chǎn)品。轉(zhuǎn)染試劑盒為美國(guó)Life公司產(chǎn)品；Prime-scriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和miRNA熒光定量PCR試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；CCK-8試劑盒為南京凱基生物科技公司產(chǎn)品。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和pGL載體為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品。miRNA-25 模擬物(mimics)、抑制物(inhibitor)及相應(yīng)對(duì)照均由上海GenePharma公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/G及親本細(xì)胞PC9常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中， 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。為維持PC9/G細(xì)胞耐藥性，向PC9/G細(xì)胞培養(yǎng)液中將加入終濃度為2 μmol/L的吉非替尼。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(miRNA-25 mimics或miRNA-25 inhibitor)、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，miRNA-25 mimics或miRNA-25 inhibitor的轉(zhuǎn)染濃度為10 nM，操作步驟按照Lipofectmine 2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 RT-PCR法檢測(cè)miRNA-25的表達(dá) 采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，測(cè)量濃度后采用Prime-scriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以U6作為內(nèi)參，采用SYBR Green法檢測(cè)miRNA-25表達(dá)，反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s，95 ℃8 s，65 ℃10 s，70 ℃10 s，共40個(gè)循環(huán)。miRNA-25的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。

1.2.4 CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性變化 參照CCK8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染24 h后，以5×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種體積100 μl/孔，并設(shè)僅含培養(yǎng)基的空白對(duì)照。待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0.222、0.667、2、6、18、54 μmol/L及0.0056、0.0167、0.05、0.15、0.45、1.35 μmol/L的吉非替尼，每孔加入100 μl。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將CCK8試劑加入培養(yǎng)孔中，37 ℃條件下培養(yǎng)繼續(xù)孵育2 h，然后在酶標(biāo)儀上采用450 nm波長(zhǎng)測(cè)量每孔吸光度(OD)值。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線，并計(jì)算吉非替尼對(duì)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。抑制率計(jì)算公式為：生長(zhǎng)抑制率=(1-OD用藥組/OD對(duì)照組)×100%，以最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，得到IC50值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Westem blot檢測(cè)細(xì)胞中Bim的含量 轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗滌細(xì)胞，采用蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白含量，將樣本按20 μl/孔加入10%聚丙烯酰胺凝膠孔中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后采用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入鼠抗人β-actin抗體及兔抗人Bim抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗3次，每次10 min，分別加入羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗，孵育后顯影。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 合成包含有與相應(yīng)miRNA-25互補(bǔ)結(jié)合的靶基因Bim 3'-UTR序列片段和突變的Bim 3'-UTR序列片段，將含突變的Bim 3'-UTR(mutant)的片段和預(yù)測(cè)miRNA-25結(jié)合位點(diǎn)的Bim 3'-UTR克隆到pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點(diǎn)中。將PC9細(xì)胞以4×105個(gè)/mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后采用Lipofectmine 2000試劑共轉(zhuǎn)染miRNA-25 mimics以及包含Bim 3'-UTR或突變的Bim 3'-UTR的熒光素酶質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按照Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MiRNA-25在NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-25在吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/G中高表達(dá)，表達(dá)水平為(7.15±1.26)，與本細(xì)胞PC9(表達(dá)水平1.0)相比，表達(dá)水平增高7.15倍，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 轉(zhuǎn)染前后NSCLC細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性變化

我們進(jìn)一步檢測(cè)miRNA-25是否參與調(diào)節(jié)NSCLC吉非替尼耐藥。在PC9/G細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miRNA-25 inhibitor和對(duì)照序列；在PC9細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miRNA-25 mimics和對(duì)照序列，采用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞對(duì)吉非替尼敏感性變化。檢測(cè)結(jié)果顯示，吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的IC50為(0.010±0.004)μmol/L，轉(zhuǎn)染miRNA-25 mimics后吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的IC50為(0.042±0.007)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1A)。吉非替尼對(duì)PC9/G細(xì)胞的IC50為(8.74±1.65) μmol/L，轉(zhuǎn)染miRNA-25 inhibitor后吉非替尼對(duì)PC9/G細(xì)胞的IC50為(1.78±0.20)μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1B)。

圖1 PC9/G細(xì)胞和PC9細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-25 inhibitor和miRNA-25 mimics后吉非替尼對(duì)細(xì)胞的抑制率變化

2.3 Bim是miRNA-25調(diào)節(jié)的下游靶基因

利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNA-25下游調(diào)節(jié)靶基因，結(jié)果提示Bim可能是miRNA-25下游的靶基因。為了驗(yàn)證miRNA-25與Bim的表達(dá)關(guān)系，我們采用Western blot技術(shù)檢測(cè)NSCLC細(xì)胞中miRNA-25和Bim的表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，PC9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-25 mimics后，Bim表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)(圖2)；與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，PC9/G細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-25 inhibitor后，細(xì)胞內(nèi)Bim表達(dá)水平明顯升高 (P<0.05)。結(jié)果表明miRNA-25表達(dá)水平與Bim的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

我們進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)確認(rèn)Bim是否為miRNA-25靶基因，檢測(cè)結(jié)果提示，表達(dá)野生型Bim的3'-UTR序列的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miRNA-25 mimics組與對(duì)照組相比熒光素酶活性明顯下降(P<0.01)；轉(zhuǎn)染突變型Bim的3'-UTR序列的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miRNA-25 mimics組與對(duì)照組相比熒光素酶活性無(wú)明顯差異(P>0.05)，以上結(jié)果提示，Bim為miRNA-25下游靶基因(圖3)。

3 討論

EGFR-TKI靶向治療相對(duì)于傳統(tǒng)化療具有更大的優(yōu)勢(shì)，已成為晚期NSCLC的有效治療手段。吉非替尼可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖及侵襲等，在EGFR-TKI靶向治療得到廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，由于吉非替尼原發(fā)和獲得性耐藥導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到很大限制，因此，深入研究NSCLC細(xì)胞吉非替尼耐藥機(jī)制將有助于降低臨床上治療肺癌的難度。目前，越來(lái)越多的研究表明，miRNA在腫瘤細(xì)胞原發(fā)或獲得性耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[10]。

miRNA-25屬于miRNA 106b～25家族，在食管鱗癌、直腸癌和肝癌等惡性腫瘤中均有高表達(dá)[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-25參與了腫瘤細(xì)胞耐藥發(fā)生過(guò)程，如，Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞中miRNA-25的表達(dá)水平可顯著降低該細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性。目前研究證實(shí)miRNA-25在肺癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后顯著相關(guān)[12]，但尚未見(jiàn)有關(guān)miRNA-25是否參與肺癌細(xì)胞EGFR-TKIs耐藥的研究報(bào)道。

圖2 PC9細(xì)胞及PC9/G細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miRNA-25 mimics和miRNA-25 inhibitor后細(xì)胞中Bim的變化

注：A為Bim 3'-UTR熒光素酶質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；B為雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果，**P<0.01。

在本研究中，我們以NSCLC吉非替尼耐藥細(xì)胞PC9/G及親本細(xì)胞PC9為研究對(duì)象，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)這兩種細(xì)胞模型中miRNA-25的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-25在PC9/G細(xì)胞中表達(dá)顯著升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)PC9/G細(xì)胞中miRNA-25表達(dá)水平可顯著逆轉(zhuǎn)其吉非替尼耐藥性，而上調(diào)親本細(xì)胞PC9中miRNA-25表達(dá)水平則可顯著促進(jìn)其對(duì)吉非替尼的耐藥水平。由此證實(shí)，miRNA-25參與了NSCLC細(xì)胞吉非替尼耐藥形成。

我們采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Bim基因的3'-UTR含有能和miRNA-25成熟序列結(jié)合的位點(diǎn)，提示Bim可能是miRNA-25的潛在靶基因之一。Bim是Bcl-2家族中僅含一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，具有促凋亡活性，在NSCLC、前列腺癌及乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)[13]。最近，Zhang等[14]在人卵巢癌細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)Bim介導(dǎo)了miRNA-25對(duì)細(xì)胞侵襲和凋亡能力的調(diào)節(jié)。在肺癌研究中，有研究表明Bim的低表達(dá)與EGFR-TKIs不良反應(yīng)存在相關(guān)性[13]；在肺癌細(xì)胞中用沉默Bim的表達(dá)可降低吉非替尼誘導(dǎo)突變細(xì)胞凋亡的能力[15]。

為了深入研究miRNA-25和Bim基因之間的調(diào)控關(guān)系，我們采用Western blot技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾miRNA-25后Bim基因表達(dá)變化，研究結(jié)果顯示miRNA-25表達(dá)水平與Bim的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，過(guò)表達(dá)miRNA-25后可顯著降低Bim基因表達(dá)水平。我們進(jìn)一步采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA-25和Bim基因之間的靶向調(diào)控關(guān)系，研究證實(shí) miRNA-25可以直接調(diào)控Bim基因。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步研究在肺癌細(xì)胞中Bim作為miRNA-25的靶基因是否介導(dǎo)了miRNA-25對(duì)肺癌細(xì)胞耐藥的調(diào)節(jié)。

綜上所述，miRNA-25在肺癌吉非替尼耐藥細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，下調(diào)miRNA-25表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性，這為臨床上干預(yù)肺癌細(xì)胞EGFR-TKI耐藥提供了新靶點(diǎn)。

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(編輯：甘 艷)

Expressions of Micro RNA-25 in Gefitinib-resistant Non-small Cell Lung Cancer Cells and Its Mechanism

ZHOUJianying,LIUZhentian,CHENYinglan.

JiangxiCancerHospital,Nanchang,330029

Objective To investigate the expression of microRNA-25 (miRNA-25) in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer cells and its mechanism.Methods Real-time PCR (RT-PCR) was used to detect the expression of miRNA-25 in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer cells line PC9/G and its parent cells line PC9.miRNA-25 mimics and miRNA-25 inhibitor in vitro were transiently transferred into PC9 and PC9/G cells respectively.The expression level of miRNA-25 was detected by RT-PCR.Cell viability was analyzed by CCK8 assay.Expression of Bim protein was detected by western blot.Bioinformatics software predicted the potential target genes of miRNA-25 and dual luciferase reporter gene was used to analyze the binding between miRNA-25 and 3'-UTR of Bim.Results The expression level of miRNA-25 was up-regulated in PC9/G cells as compared with PC9 cells (P<0.01).Over-expression of miRNA-25 inhibited gefitinib chemosensitivity (P<0.01),and the up-regulation of miRNA-25 led to a significant decrease in the Bim protein levels (P<0.05).Low-expression of miRNA-25 promoted gefitinib chemosensitivity (P<0.01),and the down-regulation of miRNA-25 led to a significant increase in the Bim protein levels (P<0.05).Dual luciferase reporter gene assay indicated that miRNA-25 regulated Bim expression by binding to the 3'-UTR of Bim mRNA.Conclusion The expression of miRNA-25 is up-regulated in PC9/G cells.Down-regulation of the expression of miRNA-25 can partially reverse the gefitinib-resistance.miRNA-25 may play a vital role in drug resistance by targeting Bim.

Non-small cell lung cancer;Gefitinib;Drug resistance;MiRNA-25

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：20131206)

330029 江西省腫瘤醫(yī)院

劉震天

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.001

R734.2

A

1001-5930(2016)10-1567-05

2016-04-29

2016-06-22)