基于截短表達的外膜蛋白P5的間接ELISA方法建立

李 淼李春玲宋 帥楊冬霞徐志宏

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，廣東廣州 510640；2.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東廣州 510640；3.廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

基于截短表達的外膜蛋白P5的間接ELISA方法建立

李 淼1，2，3李春玲1，2，3宋 帥1，2，3楊冬霞1，2，3徐志宏1，2，3

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，廣東廣州 510640；2.廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室，廣東廣州 510640；3.廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

為建立一種快速有效的檢測副豬嗜血桿菌(HPS)抗體的方法，本研究選取之前研究中已驗證具有良好抗原性和免疫原性的截短表達的重組外膜蛋白P5(P5F3)，將其純化后作為包被抗原，建立了檢測HPS抗體的間接ELISA 診斷方法。該診斷方法具有良好的敏感性、特異性和重復性，為HPS 的快速診斷、免疫豬群抗體監(jiān)測和HPS 流行病學調查提供了一種快速、簡便的血清學診斷方法。

副豬嗜血桿菌；截短表達OMP P5；間接ELISA

副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）作為一種常見菌類存在于豬的上呼吸道內，雖然只存在于上呼吸道內，但在一些特定的情況下可通過上呼吸道侵入機體，從而引起全身性疾病，而且病情嚴重，臨床表現(xiàn)以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、腦膜炎和關節(jié)炎為特征。在斷奶前后和仔豬成長期易感染該菌，5～8 周齡的仔豬最易感染，發(fā)病率較高，通常為 10%～15%，危害最重時，感染該病的仔豬死亡率在50% 以上。

目前，國內外學者主要采用IHA 和ELISA這兩項來HPS 抗體進行檢測，兩種方法唯一不同的是抗原的制備方法。但由于HPS抗原培養(yǎng)過程中存在散毒可能，對研究人員存在危險，且全菌體抗原的成分過于復雜，使其在臨床診斷中無法得到廣泛應用，因此，建立一種精準、無害、實用的檢測方法具有重要的意義。

本研究利用之前獲得的截短表達的 HPS 外膜蛋白（Outer membrane protein，OMP）P5 作為包被抗原建立了間接 ELISA 方法，并對 ELISA 的反應條件進行了優(yōu)化，為 HPS 診斷試劑盒的研制提供了有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株、血清及生化試劑

pET32a-P5F3 重組菌由本實驗室構建、保存。兔抗 HPS 陽性血清及豬抗 HPS 陽性血清用 HPS 標準菌株接種新西蘭大白兔或豬制得，由本實驗室 -80℃ 保存。兔抗 HPS 陰性血清為健康兔血清；豬抗 HPS 陰性血清為從本實驗室飼養(yǎng)的未進行 HPS 疫苗免疫的健康豬中采集；豬鏈球菌（SS）、豬染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）、豬多殺性巴氏桿菌（PM）陽性血清由蘭州獸醫(yī)研究所惠贈；豬大腸桿菌（E. coli）陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；豬偽狂犬病病毒（ADV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）陽性血清均為 IDEXX 試劑盒中的標準陽性血清。待檢血清為從廣東地區(qū)河源、增城、佛山等豬場采集的豬血清。

牛血清白蛋白（BSA）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗豬及羊抗兔 IgG 購自北京鼎國試劑公司，96 孔酶標板購自美國costar。

1.2 重組蛋白 P5F3 的純化

將陽性重組菌液 pET32a-P5F3 按照 1：50 的比例接種到含100 μg /ml氨芐青霉素的5 ml LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r /min振蕩過夜后，按 1：100 的接種量轉接到 500 ml新鮮 LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至 OD600nm值達到0.5～0.7時，加入誘導劑（IPTG）至終濃度為 0. 5 mmol / L，于 37 ℃ 誘導表達 4 h 后收集菌液。將培養(yǎng)物于 4 ℃，9 000 r /min 離心 10 min，棄上清，以適量 PBS 重懸沉淀，超聲裂解菌液，4℃，9 000 r /min離心10 min。

利用常規(guī)方法進行蛋白純化。

1.3 間接ELISA方法的操作程序

將重組蛋白抗原用碳酸鹽緩沖液稀釋到適當濃度，每孔100 μl加入到 96 孔酶標反應板中，4 ℃包被過夜。用 PBST 洗滌 3次，每孔 250 μl，每次 3 min；用 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）封閉反應孔，每孔 200 μl，于 37 ℃ 作用 2 h，洗滌 3 次。加入適當比例稀釋的血清，每孔 100 μl，于 37 ℃ 作用 30 min，洗滌 3次；加入適當比例稀釋的酶標二抗，每孔 100 μl，37 ℃ 作用 30 min，洗滌 3 次；加入 TMB 底物顯色液，每孔 100 μl，室溫避光反應 10 min。加入 2 mol/L H2SO4終止反應，每孔 100 μl。置酶標儀上測定每孔的 D450nm值。

1.4 抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

本研究中，重組蛋白抗原的最佳工作濃度和待檢血清的最佳稀釋度是采用了方陣滴定法進行的確定。

重組蛋白抗原的最佳工作濃度的確定方法：將純化的重組P5F3 蛋白用用碳酸鹽緩沖液進行倍比稀釋，比例分別為 1：20、1：40、1：80、1：160 和 1：320，每孔 100 μL 包被反應板，每個稀釋度設 8個重復操作孔。

待檢血清的最佳稀釋度的確定：對豬抗 HPS 陰、陽性血清進行倍比稀釋，比例分別為 1：20、1：40、1：80 和 1：160，每個血清稀釋度對應 5 個抗原包被濃度，將酶標山羊抗豬 IgG 按 1：5 000 稀釋。

按間接 ELISA 的操作程序，用酶標儀測定每孔的D450nm值，計算陽性血清孔的平均D450nm值（P）和陰性血清孔的平均D450nm值（N）之比值（P/N）。

1.5 酶標二抗最佳工作濃度的確定

將1.4中確定的最佳抗原包被濃度與血清稀釋倍數(shù)，將二抗分別作倍比稀釋，比例分別為1：2 000、1：4 000、1：6 000、1：8 000、l：10 000，每個稀釋度設兩個重復孔，進行間接ELISA測定。判定標準同上，確定酶標二抗的最佳工作濃度。

1.6 間接ELISA方法的優(yōu)化

應用方陣滴定法進一步對抗原包被條件、封閉條件、血清及酶標抗體作用時間和顯色條件等 ELISA 參數(shù)進行優(yōu)化。確定間接ELISA 的操作過程如下：將重組蛋白抗原用包被液稀釋至最佳濃度后包被 96 孔酶標板，100 μl/孔，4℃包被過夜；甩掉包被液，用PBST洗滌 3 次，每次 3 min；以 0.5% 的 BSA 封閉液 37℃ 封閉2 h，洗滌；將血清樣品稀釋至最佳稀釋度后，100 μl/孔，37℃溫育30 min，洗滌，拍干；將HRP標記的羊抗豬 IgG 按照1：6 000進行稀釋，每孔加入 100 μL，37℃ 溫育 30 min，洗滌，拍干；

再用 PBST 洗滌，拍干；加入 100 μl TMB 顯色液，避光顯色 8 min，最后加入 100 μl 終止液（2 mol/L H2SO4）終止反應，用酶標儀檢測D450nm值，計算D450nm，P/D450nm，N（陽性／陰性）值。

1.7 間接ELISA陰陽性臨界值的確定

選取 60 份 HPS 陰性血清進行間接 ELISA 檢測。計算平均D450nm（X）值以及標準差（SD），確定陰性血清臨界值 ≤ X + 2SD，陽性血清臨界值 ≥ X + 3SD。

1.8 特異性試驗

利用建立的 ELISA 方法分別對 HPS 血清型 4、5、12和13 型兔陽性血清（二抗為HRP 標記的羊抗兔 IgG）和其他病原，包括SS、 APP、 E.coli.、PM、CSFV、PRRSV 和 PCV-2等的陽性血清進行檢測，觀察是否存在交叉反應，驗證所建立 ELISA方法的特異性。

1.9 重復性試驗

批內重復性試驗：選取 8 份 HPS 抗體水平不同的血清，在相同試驗條件下，每份血清樣本平行做 8 個重復，用 ELISA 檢測，對檢測結果進行統(tǒng)計學分析。

批間重復性試驗：選取 8 份 HPS 抗體水平不同的血清，在相同試驗條件下，在 4 個不同時間用 ELISA 檢測，對檢測結果進行統(tǒng)計學分析；在相同試驗條件下，用 4 批不同時間純化的重組抗原進行 ELISA 檢測，對檢測結果進行統(tǒng)計學分析。

1.10 符合率實驗

選取經(jīng)間接血凝試驗（IHA）檢測結果為陽性和陰性的血清樣本共460份，進一步用所建立的間接 ELISA 方法檢測，以 IHA檢測結果為標準，計算間接 ELISA 相對于IHA的符合率。

1.11 臨床血清的檢測

采用建立的間接ELISA方法對從廣東地區(qū)河源、佛山、增城、惠州、廣良、朱村等豬場采集的豬血清進行 HPS 抗體的檢測。

2 結果

2.1 P5F3 的純化及鑒定

對純化的 P5F3 進行 SDS-PAGE 檢測，進一步利用 Western blot 分析其免疫原性，如圖1 所示，目的條帶所在的位置出現(xiàn)明顯的特異性條帶，大小與預期一致，證明純化的產(chǎn)物與 HPS 陽性血清發(fā)生特異性反應，具有良好的反應原性。

圖1 純化的 P5F3 的 Western blotting 分析

2.2 抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

方陣滴定的結果顯示，當血清稀釋度為1：120，抗原包被濃度為 2.5 μg/mL，每孔100 μL（即每孔包被抗原為250 ng），P/ N值相對較大，結合陰性、陽性血清的 D450nm值，確定 2.5 μg/mL為抗原最適包被濃度，1∶120為血清最適稀釋濃度（見表1）。

2.3 酶標二抗最佳工作濃度的確定

在最佳抗原和血清稀釋度反應條件下，將酶標二抗分別以1∶2 000、l∶4 000、1∶6 000、1∶8 000和 l∶10 000 倍稀釋，如表 2 所示，根據(jù) D450nm值讀數(shù)和 P/N 值判斷，酶標二抗的最佳工作濃度為 1∶6 000，此時 P/N 值最大。

表2 酶標二抗最佳工作濃度的確定

2.4 間接ELISA陰陽性臨界值的確定

根據(jù)對 60 份 HPS 陰性血清進行間接 ELISA 檢測的結果，得出陰性樣品平均 D450nm值（X）= 0.1127，標準差（S）為 0.0465。所以當樣品 D450nm≥ X + 3SD即 0.252 判為陽性；樣品 D450nm值 ≤X + 2SD 即 0.206 判為陰性；0.206 < 樣品 D450nm值 < 0.252 判為可疑，可疑樣品重新檢測，仍為可疑則判定為陽性。

表1 抗原最適包被濃度及血清最適稀釋度的方陣滴定結果（P/N值）

表3 間接ELISA的特異性試驗結果

表4 批內重復性試驗結果

表5 不同時間批間重復性試驗結果

表6 不同批次重組抗原批間重復性試驗結果

2.5 特異性試驗

以陰性血清作為對照，用 P5F3 作為抗原建立的間接 ELISA方法檢測抗原與 HPS 血清型 4、5、12 和 13 型交叉反應，結果顯示，P5F3 與各血清型陽性血清均呈陽性反應，表明建立的 ELISA方法能檢出我國主要流行的血清型的 HPS 抗體。而利用該方法檢測SS、APP、E.coli、PM、ADV、CSFV、PRRSV 和 PCV-2 陽性血清，被檢血清的 D450nm值均低于0.206，呈陰性反應（見表3），表明建立的 ELISA 方法具有良好的特異性。

2.6 重復性試驗

統(tǒng)計結果顯示，批內重復性試驗的變異系數(shù)小于 5 %（表4），不同時間、不同批次重組抗原的批間重復性試驗變異系數(shù)均小于 10 %（表5、表6）。說明所構建的 ELISA 方法具有良好的重復性。

2.7 符合性試驗

經(jīng) IHA 檢測結果為陽性的 297 份血清樣本，間接 ELISA 檢出陽性 291 份，陰性 6 份；IHA 檢測結果為陰性的 163 份血清樣本，間接 ELISA 檢出陰性 158 份，陽性5份。相對于HI 的符合率為 93.1 %。

2.8 臨床血清檢測應用

利用建立的間接 ELISA 檢測方法，對未進行 HPS 疫苗免疫的健康豬場采集的 1100 份豬血清樣品進行檢測，共有 162 份陽性樣品，陽性率為14.7%。

3 討論

近年來副豬嗜血桿菌病已成為生產(chǎn)上最常見以及造成經(jīng)濟損失最大的豬傳染病之一。為了有效地控制該病的流行，準確地診斷至關重要。目前，進口的 HPS ELISA 檢測試劑盒價格昂貴，因此，研制一種操作簡便、特異和敏感的檢測方法是十分必要的。

間接ELISA 方法操作快速簡單，對于疾病的診斷、檢疫及流行病學調查具有較高實用價值。選擇合適的包被抗原是建立間接ELISA 檢測方法的關鍵，有研究學者選用莢膜多糖、全菌體作為包被抗原分別建立的檢測抗體的間接 ELISA 方法，但檢測結果不穩(wěn)定且經(jīng)常出現(xiàn)假陰性。而免疫原性良好的菌體蛋白經(jīng)體外高效表達后，常被選為各種血清學診斷方法所用的抗原。Omp P5是革蘭氏陰性菌的一個主要外膜蛋白，具有宿主粘附結構區(qū)域和免疫原性。研究表明，HPS Omp P5 能夠參與細菌的定植，也是機體免疫應答反應的早期抗原，在自然感染或弱毒活疫苗免疫后的動物中都可以檢測到針對P5 蛋白的抗體，因此具有重要的診斷價值。

我們在之前的研究中選擇 pET32a 原核表達載體，分段表達了 HPS 的 OMP P5 蛋白，經(jīng)免疫印跡試驗證實所截短表達的 P5F3蛋白可與 HPS 陽性血清反應，表明重組 P5F3 蛋白具有良好的免疫反應反應性與特異性。因此，本研究中我們選取純化后的 P5F3作為包被抗原建立間接 ELISA方法。通過對抗原、血清包被濃度和作用時間、酶結合物稀釋濃度和作用時間、抗原抗體結合時間、封閉時間、底物顯色時間等條件的優(yōu)化，建立了 HPS 間接ELISA 抗體檢測方法。通過對血清樣品的檢測證實間接 ELISA 具有簡單，快速，敏感，穩(wěn)定性和重復性好的特點，可用于 HPS 的快速診斷。

[1] 魏子貢，蔡旭旺，金梅林，等.副豬嗜血桿菌抗體間接血凝檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫(yī)科學，2006，36（9）：713-718.

[2] 謝樂新，李淼，宋帥，等.副豬嗜血桿菌外膜蛋白P5的分段表達及免疫學性質分析[J].華北農(nóng)學報，2013，28（5）：48-52.

廣東省公益研究與能力建設專項資金項目（2014B070 706011）、廣東省科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才服務領域（2015A020 224022）、廣東省農(nóng)業(yè)科技重點項目（2015B020203004）

李淼（1982—），女，博士，助理研究員。

徐志宏（1965—），男，碩士，研究員。