肝素結(jié)合表皮生長因子的高表達與稽留流產(chǎn)病因的相關(guān)性研究

羅樹玲 鄭春艷 曹錦慧

【摘要】目的：肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF）在女性生殖系統(tǒng)中有非常重要的作用，它能促進子宮內(nèi)膜從增殖期向分泌期轉(zhuǎn)化，并且介導(dǎo)受精卵著床，促進胎盤的形成和生長，同時也有抑制凋亡的作用。本研究意在探討HB-EGF在稽留流產(chǎn)的病因中所起到的作用。方法：選取意外妊娠的患者12例作為對照組，稽留流產(chǎn)的患者13例為實驗組，采用人流術(shù)或刮宮術(shù)取得子宮蛻膜組織和胎盤組織，利用免疫組織化學染色的方法檢測實驗組和對照組的蛻膜組織與胎盤組織里的HB-EGF的水平。結(jié)果：稽留流產(chǎn)患者的蛻膜組織與胎盤組織內(nèi)的 HB-EGF表達均有上調(diào)[分別是（143.31±12.50）和（115.72±12.13）]，并且明顯高于對照組的蛻膜組織與胎盤組織內(nèi)的 HB-EGF表達[分別是（102.40±13.21）和（82.30±9.97）]。結(jié)論：研究數(shù)據(jù)表明HB-EGF的高表達在稽留流產(chǎn)中可能是導(dǎo)致死胎滯留腹中的原因。

【關(guān)鍵詞】肝素結(jié)合表皮生長因子；稽留流產(chǎn)

【Abstract】Objectives： Heparin-binding epidermal growth factor（HB-EGF）has important biologic functions in the female reproductive tract. It helps to promote the uterine from proliferation stage to secretory stage， and has functions in implantation， placenta development， and also inhibition of apoptosis. This research aims to explore the possible role of HB –EGF in missed abortion. Methods： Decidual and placental tissue samples were obtained from 12 women with unwanted pregnancy as the control group and from 15 women with missed abortions as the experiment group. Immunohistochemistry was used to compare HB- EGF expression in uterine decidual tissue and in placental villous stroma of the two groups. Results： HB-EGF expression in both uterine decidual tissue and placental villous stroma was up-regulated in the missed abortion group （143.31±12.50 and 115.72±12.13 respectively）， compared with the control group （102.40±13.21 and 82.30±9.97102.4， respectively）. Conclusion： The up-regulated expression of HB-EGF may inhibit the discharge of dead fetus in missed abortions.

【Key words】Heparin-binding epidermal growth factor； Missed abortions

【中圖分類號】R169.42【文獻標志碼】A

稽留流產(chǎn)又名過期流產(chǎn)，指宮內(nèi)胚胎或胎兒死亡后未及時排出者，它屬于一種特殊的自然流產(chǎn)[1]。近年來，稽留流產(chǎn)的發(fā)病率逐年增加[2]。造成稽留流產(chǎn)的原因較多，如染色體的數(shù)量或結(jié)構(gòu)等異常、子宮畸形、嚴重營養(yǎng)缺乏、環(huán)境不良因素及精神因素等[3]。前人在稽留流產(chǎn)的診斷及治療方面做了很多相關(guān)性研究，但對于稽留流產(chǎn)的病因研究卻較少，因此本文旨在對稽留流產(chǎn)的病因做一探討。

作為表皮結(jié)合因子（EGF）家族的一員，肝素結(jié)合表皮生長因子（HB-EGF）基因是位于人類第5號染色體長臂上，分子質(zhì)量為20～22ku， 由208個氨基酸構(gòu)成[4]。HB-EGF可由巨噬細胞、平滑肌細胞和血管內(nèi)皮細胞等分泌產(chǎn)生，其產(chǎn)物可在多種組織和器官（包括女性生殖系統(tǒng)）中廣泛表達，參與多種生物學活動，如胚泡著床、促進胎盤的形成和生長，同時也有抑制凋亡的作用[5]。HB-EGF是一種跨膜蛋白，由跨膜片段（proHB -EGF）和分泌片段（sHB -EGF）組成，其中sHB-EGF可與受體結(jié)合。HB-EGF有兩種受體，分別是HER/ErbB受體和硫酸乙酰肝素蛋白多糖 （HSPG），HB-EGF可在HSPG的輔助下激動HER1和HER4受體，而對HER2受體和HER3受體無激動作用[6]。

研究表明，HB-EGF在多種生理及病理過程中都發(fā)揮著作用，例如介導(dǎo)細胞黏附、趨化、細胞有絲分裂、抑制細胞凋亡等。它可以通過激動HER1和HER4受體介導(dǎo)細胞黏附，而通過HER3受體信號介導(dǎo)趨化和促進細胞有絲分裂[7]。

HB-EGF與女性的生殖內(nèi)分泌功能有著密不可分的關(guān)系。作為可介導(dǎo)胚泡著床的4種必需因子之一，其在眾多過程中都起著重要的作用，比如促進人類子宮內(nèi)膜的生長和分化、促進胎盤的生長和發(fā)育以及會介導(dǎo)胚泡的粘附、著床和植入子宮內(nèi)膜等[8]。Birdsall等[9]研究證明在女性月經(jīng)周期中的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和上皮細胞存在HB-EGF mRNA，且檢測了HB-EGF蛋白的表達量與子宮內(nèi)膜隨著卵巢甾體激素的變化同步。 Chobotova等[10]研究發(fā)現(xiàn)HB-EGF可通過EGF受體和 ErbB4 介導(dǎo)人類的子宮內(nèi)膜蛻膜化。HB-EGF在孕早期的絨毛膜絨毛、孕中期的絨毛以及足月胎盤中都是有明顯表達的[11]。在體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞時，HB-EGF能維持滋養(yǎng)細胞的存活，抑制其凋亡[12]。

HB-EGF在促進子宮內(nèi)膜的功能、促進受精卵著床、胎盤的形成與發(fā)育、維持妊娠等方面的作用都得到了大量的證實，但它在稽留流產(chǎn)病因中的研究報道極少，故本研究將對HB-EGF與稽留流產(chǎn)中引起死胎滯留原因的相關(guān)性做一探討。

1材料與方法

1.1標本來源

從我院2014年3月至2015年1月就診的病人里選取27例為研究對象，其中意外妊娠（孕5～10周）的患者12例作為對照組，稽留流產(chǎn)（孕6～12周）的患者13例為實驗組。對照組的平均年齡為26.12歲（22～33歲），實驗組的平均年齡為27.27歲（21～35歲）。通過經(jīng)陰道超聲診斷為流產(chǎn)，在獲得所有實驗對象的知情同意以后，在經(jīng)腹超聲的監(jiān)視下行人流術(shù)或刮宮術(shù)獲取子宮內(nèi)膜組織與胎盤組織。

1.2染色與制片

首先清洗子宮內(nèi)膜組織與胎盤組織，用10%甲醛固定，不同梯度的酒精脫水處理，接著石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4～5μm，將切片脫蠟處理并置水中漂洗；利用微波高檔將抗原修復(fù)液（250 mL蒸餾水中含5.25 g檸檬酸和7.35 g檸檬酸鈉） 加溫3 min，待其溫度升至約96℃，切片放入修復(fù)液中，低溫處理10 min以保溫，取出后冷卻至室溫；3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，用1%牛血清蛋白封閉其他無關(guān)的抗原，滴加一抗（山羊抗人HB-EGF多克隆抗體），室溫孵育2h，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，加入適量的生物素化二抗，在37℃孵育20 min，加入適量的辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37℃孵育20 min；用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5～10min，蘇木素染核，后封片觀察。標本均設(shè)陰性和陽性對照，陰性對照用PBS代替一抗進行染色。

1.3判定標準

免疫組化的著色強度評定參照H 指數(shù)[13]，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)淺黃色至棕黃色反應(yīng)者為陽性，著色強度高于背景非特異染色，無顯色或顯色不明顯者為陰性，其得分分別有0分（未染色），1分（著色弱，可分辨），2分（中度染色），3分（強染色）。對每一份標本均進行H得分評估，最后的計算公式為：

H得分=∑Pi（i+1）

其中i為著色強度，分別用0（未染色），1（著色弱，可分辨），2（中度染色），3（強染色）賦值，Pi為相應(yīng)染色強度的部分所占的百分比，取值范圍為0%到100% 。分別隨機選取5個中倍鏡視野下觀察。H得分評估采用雙盲的方式，最少要兩個觀察者分別完成。見表1。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均在SPSS19.0軟件上分析。兩組間通過t檢驗去比較，P<0.01時視為有顯著差異。見表2。

2結(jié)果

2.1免疫組化染色的結(jié)果

兩組的染色結(jié)果顯示均有HB-EGF陽性細胞的表達，稽留流產(chǎn)患者的蛻膜組織與胎盤組織內(nèi)HB-EGF的染色強度（見圖1中的c、d）明顯強于正常妊娠組（見圖1中的a、b），從染色結(jié)果可定性判斷稽留流產(chǎn)中HB-EGF的表達是上調(diào)的。

2.2數(shù)據(jù)分析的結(jié)果

通過統(tǒng)計分析，稽留流產(chǎn)患者的蛻膜組織與胎盤組織內(nèi)的 HB-EGF表達上調(diào)[分別是（143.31±12.50）和（115.72±12.13）]，并且明顯高于對照組[分別是（102.40±13.21）和（82.30±9.97）]。該結(jié)果有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計結(jié)果見表1，誤差線分析見圖2。

3討論

本論文探究了HB-EGF在正常妊娠和稽留流產(chǎn)的子宮蛻膜組織和胎盤組織中的表達，主要通過免疫組化染色的方法進行，結(jié)果表明在稽留流產(chǎn)中HB-EGF的表達是上調(diào)的，并且所得結(jié)果具有統(tǒng)計學意義，因而我們可以推測在稽留流產(chǎn)中HB-EGF的高表達可能是導(dǎo)致死胎滯留腹中的原因。

近些年來，HB-EGF在生殖內(nèi)分泌的研究領(lǐng)域吸引了極大的關(guān)注，在子宮內(nèi)膜、卵巢黃體、輸卵管、胎盤、絨毛蛻膜和胚泡中被實存在HB-EGF及其受體，并通過自分泌和旁分泌的方式與受體結(jié)合進而發(fā)揮了重要的生物學作用。

之前的研究證實HB-EGF可促進子宮內(nèi)膜的蛻膜化[14]，它還可以同時作為黏附因子和生長因子促進受精卵著床，并且在胎盤的形成與發(fā)育[10]、維持妊娠等方面也都有著重要作用。HB-EGF在胚胎植入過程中發(fā)揮多重作用：（1）通過蛋白水解的方式裂解為胚胎發(fā)育的誘導(dǎo)物，進而促進胚胎發(fā)育；（2）作為胞飲突表面的跨膜因子可以與滋養(yǎng)外胚層細胞上HB-EGF的特異受體結(jié)合，進而介導(dǎo)胚胎和子宮內(nèi)膜之間的黏附；（3）胚胎侵入子宮后受到其輔助修復(fù)其中的內(nèi)膜上皮。HB-EGF可以促進滋養(yǎng)細胞的遷移、侵襲，提高胚胎的存活率[14]。進一步研究發(fā)現(xiàn)HB-EGF可以通過基質(zhì)金屬蛋白酶2、9和金屬蛋白酶抑制物1、2的表達影響滋養(yǎng)細胞的侵襲能力[14]。Gonzalez等[15]發(fā)現(xiàn)蛻膜細胞是胚胎質(zhì)量和決定HB-EGF和IL-1β等關(guān)鍵因素反映的選擇性響應(yīng)之間的的生物傳感器。HB-EGF在細胞滋養(yǎng)、細胞發(fā)育和分化等過程中起到了重要的促進作用；Lala等[16]的研究表明，HB-EGF可以調(diào)節(jié)并滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移。HB-EGF表達量下降，滋養(yǎng)細胞則會出現(xiàn)遷移侵襲力的缺乏，從而造成了胎盤的病理變化，導(dǎo)致子癇前期和胎兒損傷。在人體正常、炎癥、妊娠輸卵管壺腹部黏膜上皮細胞均有HB-EGF的表達，較正常組來說，炎癥組和妊娠組其均有增強，且差異具有統(tǒng)計學的意義。

HB-EGF的低表達與某些妊娠并發(fā)癥的發(fā)生有關(guān)，如子癇前期和早期流產(chǎn)。我們的研究通過免疫組化染色的方法證明了HB-EGF在稽留流產(chǎn)的子宮蛻膜組織和胎盤組織中的表達是上調(diào)的，明顯高于正常妊娠組。

HB-EGF作為子宮蛻膜化因子、滋養(yǎng)細胞侵襲調(diào)節(jié)因子以及潛在的保護者，對于正常妊娠的維持必不可少。在稽留流產(chǎn)中該因子的高表達是否就是死胎滯留腹中的原因，以及它是如何調(diào)控這一過程的，還有待進一步研究與印證。

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（收稿日期：2015-07-29）