葉建新 林 航 穆軍山 崔曉萍

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 福建醫(yī)科大學福建總醫(yī)院臨床醫(yī)學院 福州 350025

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·論著·

大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)肽S的表達及對睡眠功能的影響

葉建新 林 航 穆軍山 崔曉萍

南京軍區(qū)福州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 福建醫(yī)科大學福建總醫(yī)院臨床醫(yī)學院 福州 350025

目的 研究剝奪睡眠大鼠的神經(jīng)肽S表達水平，探討其與睡眠的關(guān)系。方法 共對27只大鼠進行實驗，分別為CC組(正常對照組)、TC組(環(huán)境對照組)及SD組(睡眠對照組)，在相應的環(huán)境中飼養(yǎng)1 d、3 d和5 d，對大鼠下丘腦中神經(jīng)肽S的表達水平進行研究并比較。結(jié)果 大鼠睡眠剝奪后出現(xiàn)體質(zhì)量降低、皮毛蓬亂、潮濕無光滑。部分大鼠尾巴和爪子出現(xiàn)磨損，大鼠情緒煩躁不安，較容易發(fā)怒且具有較強的攻擊性，這些表現(xiàn)在睡眠剝奪5 d后表現(xiàn)得更加明顯；CC組和TC組在實驗第1天、第3天和第5天的下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SD組第3天和第5天下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平均高于第1天，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SD組第3天和第5天下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平均高于CC組和TC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 神經(jīng)肽S可能具有促進覺醒的作用，對人體的睡眠與覺醒產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用，可能與失眠等多種疾病的發(fā)生具有密切的相關(guān)性，值得更加深入的研究。

睡眠剝奪；神經(jīng)肽S；睡眠

人們在日常生活中約1/3的時間在睡眠當中，睡眠過程中人體也在進行著各種重要的生理活動[1]。但是也會由于各種原因而引起睡眠丟失的狀態(tài)，稱為睡眠剝奪，如果患者僅僅是部分的睡眠剝奪也被稱為睡眠不足[2]。隨著人們工作壓力的不斷增加和生活節(jié)奏的加快，睡眠剝奪已經(jīng)影響到人們的生活[3]。睡眠和覺醒是一個非常復雜的過程，涉及到許多復雜的神經(jīng)環(huán)路和多種神經(jīng)化學物質(zhì)。研究表明，在腦室注射了神經(jīng)肽S以后，小鼠的空間記憶能力明顯的增強，但神經(jīng)肽S對睡眠剝奪所引起的認知功能損害是否會產(chǎn)生一定的作用，并沒有明確的研究[4]。本文對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)肽S的表達對睡眠的影響進行了詳細研究，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1．1 實驗動物 本次研究所采用的實驗動物為14～16周齡的SD大鼠，所有大鼠的體質(zhì)量220～250 g，大鼠飼養(yǎng)在動物睡眠實驗室中，保持室內(nèi)12 h進行燈的明暗自動切換。大鼠可以自由進行水和食物的攝取，室內(nèi)的相對濕度在40%～70%，溫度保持在22～24 ℃。

1．2 實驗方法

1．2．1 實驗動物分組：共對27只大鼠進行實驗，對所有的大鼠進行編號，并用苦味酸進行標記，分別稱質(zhì)量。將所有的大鼠隨機分為3組，每組各9只，分別為CC組(正常對照組)、TC組(環(huán)境對照組)以及SD組(睡眠對照組)，各組內(nèi)再對大鼠按照時間進行分組，分別為第1天、第2天和第3天，每個小分組中各有3只大鼠。

1．2．2 睡眠剝奪模型的建立：對大鼠采用改良的多平臺睡眠剝奪法進行睡眠剝奪模型的建立。SD組：在水槽內(nèi)加入溫度保持在22～24 ℃的水，水槽的頂部有充足的食物和水供大鼠攝入。在水中放10個直徑為6.5 cm的平臺，大鼠可以在水槽中自由活動。但是大鼠在平臺上入睡的時候會由于身體失衡觸碰睡眠而導致驚醒，從而被剝奪了睡眠。TC組：水平放入直徑約為12.5 cm的大平臺，大鼠可以在平臺上入睡。CC組：CC組的大鼠與之前的飼養(yǎng)環(huán)境相同，仍然在睡眠實驗室中進行飼養(yǎng)。

1．2．3 下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平的檢測：①總RNA的提?。喝〕龃笫蟮南虑鹉X組織進行稱質(zhì)量，記錄質(zhì)量后放入玻璃研磨器中進行研磨，然后按照稱質(zhì)量的比例加入一定量的Trizol溶液在室溫的條件下放置15 min，進行預處理。然后再加入氯仿(0.2 mL/1 mL Trizol)靜置5 min后進行離心。再加入0.5 mL異丙醇靜置10 min后離心進行沉淀。然后對沉淀物采用75%的乙醇溶液進行洗脫。②逆轉(zhuǎn)錄：取出4 μL的RNA提取物，加入隨機引物、DEPC等溶液在65 ℃的條件下進行5 min的孵育，然后加入反轉(zhuǎn)錄的緩沖液，加熱到80 ℃，加入反轉(zhuǎn)錄酶后在冰上冷卻，終止反應。③PCR反應：設計引物→預變性→變性→退火→延伸，共進行30個循環(huán)。④瓊脂糖凝膠電泳：將PCR反應的產(chǎn)物放入到1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后溴化乙錠進行染色，采用照相用的計算機凸顯分析儀對PCR的反應產(chǎn)物進行定量分析。

2 結(jié)果

2．1 睡眠剝奪后大鼠的行為變化 大鼠進行睡眠剝奪后出現(xiàn)體質(zhì)量降低、皮毛蓬亂、潮濕無光滑。部分大鼠的尾巴和爪子出現(xiàn)磨損，大鼠的情緒煩躁不安，較容易發(fā)怒且具有較強的攻擊性，這些表現(xiàn)在睡眠剝奪5 d后表現(xiàn)得更加明顯。

2．2 大鼠下丘腦神經(jīng)肽S mRNA表達水平的變化 使用RT-OCR的方法對下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平進行定量檢測。CC組和TC組在實驗的第1天、第3天和第5天的下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SD組第3天和第5天下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平均高于第1天，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SD組第3天和第5天下丘腦神經(jīng)肽S mRNA的表達水平均高于CC組和TC組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 下丘腦神經(jīng)肽S mRNA表達

組別第1天第3天第5天CC2639±0892525±1262569±171TC2618±0592426±1262589±096SD2732±0695326±136abc5236±126abc

注：SD組第3天和第5天的表達水平與第1天比較，aP<0.05；SD組第2天的表達水平與CC組比較，bP<0.05；SD組第5天與TC組的表達水平比較，cP<0.05

3 討論

本文所采用的睡眠剝奪方式是較常用的睡眠剝奪方式，多平臺的方式克服了單平臺剝奪法對大鼠活動的阻礙等缺點，減少了諸多應激因素對剝奪結(jié)果的干擾[5]。從本次研究的結(jié)果可以看出，多平臺睡眠剝奪的方式的確可以有效對大鼠進行睡眠剝奪，睡眠剝奪的大鼠多表現(xiàn)出情緒上的暴躁、易怒和攻擊性，體征上的體質(zhì)量減小、皮毛質(zhì)量下降等各種特點，也說明了睡眠剝奪的確會對身體產(chǎn)生不良的影響[6]。

睡眠和覺醒是一個較復雜的神經(jīng)反應的過程，很多神經(jīng)遞質(zhì)都參與了這個過程，如乙酰膽堿、谷氨酸等[7]。近幾年，很多神經(jīng)肽類的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，學者們初步認為這些神經(jīng)肽類與人體的睡眠和覺醒的關(guān)系十分密切。神經(jīng)肽S是最新報道的一種參與人體睡眠調(diào)節(jié)的神經(jīng)肽類[8]。有學者[9]對小鼠進行了研究，注射神經(jīng)肽S 0.1 nmol可以使得小鼠1 d的覺醒時間增加到69%，如果提高神經(jīng)肽S的劑量到1.0 nmol，相應的小鼠1 d的覺醒時間高達87%，與正常注射生理鹽水的小鼠相比覺醒時間占比明顯增加[10]。對小鼠的睡眠進行檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠的慢波睡眠和動眼睡眠與注射生理鹽水的小鼠相比明顯減少[11]。充分說明了神經(jīng)肽S能夠在睡眠的過程中發(fā)揮促進喚醒的作用，而且對慢波睡眠和動眼睡眠都能夠發(fā)揮作用。注射神經(jīng)肽S后1 h之內(nèi)就會發(fā)生作用[12]。也有研究表明，神經(jīng)肽orexinA也具有促覺醒的作用，orexin對去甲腎上腺素產(chǎn)生刺激作用，然后激活單胺能系統(tǒng)從而起到促覺醒的作用[13]。也有學者[14]對神經(jīng)肽S的作用機制進行了研究，對失眠的患者進行基因型的檢測，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽S的基因突變可能會產(chǎn)生睡眠障礙，因此神經(jīng)肽SR的蛋白配體可能是一種促進睡眠的因子，而神經(jīng)肽S則可能促進覺醒，因此，神經(jīng)肽S的作用機制很可能是直接作用于腦內(nèi)的睡眠系統(tǒng)[15]。

從本次研究的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，剝奪睡眠后的大鼠體內(nèi)的神經(jīng)肽S表達量明顯升高，也充分說明了神經(jīng)肽S可能具有促進覺醒的作用。神經(jīng)肽S是由下丘腦產(chǎn)生的，下丘腦分泌神經(jīng)肽S后可以作用于腺垂體，產(chǎn)生一定的刺激作用，而神經(jīng)肽S的表達水平越高，這種刺激作用就越強烈，從而促覺醒的作用也越強烈。關(guān)于神經(jīng)肽S對睡眠的調(diào)節(jié)作用的機制可以進行更加深入的研究。

綜上所述，神經(jīng)肽S可能具有促進覺醒的作用，對人體的睡眠與覺醒產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用，可能與失眠等多種疾病的發(fā)生具有密切的相關(guān)性，值得進行更加深入的研究。

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(收稿2016-03-11)

The effect of expression level of neuropeptide S in central nervous system on sleep function in rats

Ye Jianxin，Lin Hang，Mu Junshan，Cui Xiaoping

Department of Neurology，the Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region，F(xiàn)uzhou 350025，China

Objective To investigate the relationship between the expression of neuropeptide S deprived from rats and sleep．Methods A total of 27 rats were divided into CC group(normal-control group)，TC group(environmental-control group) and SD group(sleepful-control group)．The expression level of neuropeptide S in hypothalamus was tested and compared after raising all rats for one，three and five days．Results Weight loss and no smooth，wet unkempt fur happened after sleep deprivation in rats．The tails and claws of some rats were worn-off，and the rats were prone to be angry and aggressive，all of which were more obvious on the fifth day after sleep deprivation．On the first，third and fifth days，no statistical differences were found between CC group and TC group as for the expression levels of neuropeptide S mRNA in hypothalamus(P>0.05)，however the expression levels in SD group on the third and fifth days were significantly higher than those on the first day(P<0.05) and in CC group and TC group(P<0.05)．Conclusion Neuropeptide S may play a role in promoting human bodies’ awakening and have a certain regulating effect on sleep and awakening，which may be related to many diseases such as insomnia and should be further studied．

Sleep deprivation；Neuropeptide S；Sleep

南京軍區(qū)醫(yī)學科技創(chuàng)新課題(編號：MS130)

R743.33

A

1673-5110(2016)21-0001-02