超高效液相色譜法測(cè)定蝦青素*

陳偉珠，張怡評(píng)，晉文慧，方華，洪專

(國(guó)家海洋局第三海洋研究所，國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用中心，福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門 361005)

超高效液相色譜法測(cè)定蝦青素*

陳偉珠，張怡評(píng)，晉文慧，方華，洪專

(國(guó)家海洋局第三海洋研究所，國(guó)家海洋局海洋生物資源綜合利用中心，福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門 361005)

建立超高效液相色譜法快速檢測(cè)蝦青素的方法。采用UPLC BEH C8色譜柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)，考察了流動(dòng)相、流量及柱溫對(duì)蝦青素樣品分離的影響，確定了最佳色譜條件：等度洗脫，流動(dòng)相為甲醇–水(體積比為75∶25)，流量為0.5 mL／min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為475 nm。蝦青素的質(zhì)量濃度在0.2～10.0 μg／mL范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r=0.998 8，檢出限(S／N=3)為0.1 μg／mL，定量限(S／N=10)為0.2 μg／mL。測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%(n=6)，加標(biāo)回收率為105.8%～110.3%。該方法快速、簡(jiǎn)單、可靠、靈敏、重復(fù)性好，可用于蝦青素有關(guān)樣品的快速檢測(cè)。

蝦青素；超高效液相色譜法；快速測(cè)定；雜質(zhì)分離

蝦青素(又名蝦黃素、蝦黃質(zhì))是蝦蟹外殼、牡蠣、鮭魚(yú)及某些藻類中含有的類胡蘿卜素含氧衍生物，是一種酮式類胡蘿卜素。經(jīng)動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，蝦青素具有較強(qiáng)的抗氧化、抗癌抑癌、增強(qiáng)免疫、預(yù)防心血管疾病等保健功能［1］，尤其抗氧化性比維生素E強(qiáng)100多倍，被稱為“超級(jí)維生素E”。蝦青素在食品添加劑、保健食品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖和化妝品等方面有廣泛的應(yīng)用［2–3］，美國(guó)等國(guó)家已允許其作為食品添加劑，市場(chǎng)前景廣闊［4］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)蝦青素的檢測(cè)方法主要有分光光度法［5–6］、高效液相色譜法［7–9］、高效液相色譜–質(zhì)譜法［10–11］、超高效合相色譜法［12］和超高效液相色譜法［13］。但是文獻(xiàn)方法只是針對(duì)蝦青素含量的檢測(cè)，而蝦青素由于其分子結(jié)構(gòu)存在共軛雙鍵鏈及其末端的不飽和酮基和羥基，性質(zhì)不穩(wěn)定，在儲(chǔ)藏過(guò)程中易與光、熱、氧化物發(fā)生作用，產(chǎn)生其它雜質(zhì)［4］。筆者對(duì)色譜柱、流動(dòng)相、柱溫和流量等色譜條件等進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)蝦青素及其雜質(zhì)進(jìn)行分離，建立了超高效液相色譜測(cè)定蝦青素的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于蝦青素及其有關(guān)雜質(zhì)的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高壓液相色譜儀：Acuity型，附帶自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、TUV 檢測(cè)器在線脫氣機(jī)和Epower 2 色譜工作站，美國(guó)Waters公司；

Milii-Q 超純水純化系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；

分析天平：AL104型，感量為0.1 mg，德國(guó)梅特勒公司；

2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于97%，美國(guó)Sigma公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCTM C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美國(guó)Waters公司)；柱溫：40℃；檢測(cè)器：可調(diào)波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：475 nm；流動(dòng)相：甲醇–水(體積比為75∶25)；流量：0.5 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

稱取蝦青素對(duì)照品1 mg，用乙腈溶解，置于10 mL 容量瓶中，稀釋至標(biāo)線，搖勻，配成質(zhì)量濃度為100 μg／mL的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

2.1.1 色譜柱的選擇

蝦青素結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)長(zhǎng)的共扼不飽和雙鍵，在反相色譜柱上保留性較強(qiáng)。首先考察不同反相色譜柱對(duì)蝦青素及其有關(guān)雜質(zhì)分離效果的影響，分別選擇UPLC BEH C18、UPLC BEH C8和UPLC CSH C18三種常見(jiàn)的UPLC色譜柱進(jìn)行考察，色譜圖見(jiàn)圖1。圖1結(jié)果表明，在甲醇–水(體積比為80∶20)和柱溫30℃的相同條件下，蝦青素在UPLC BEH C8色譜柱上不僅有保留，而且主峰與雜質(zhì)峰均能分開(kāi)；但在UPLC BEH C18和UPLC CSH C18色譜柱中的保留太強(qiáng)，蝦青素在UPLC BEH C18色譜柱中的保留時(shí)間為9.34 min，在UPLC CSH C18中的保留時(shí)間更晚，12 min未出峰。因此選擇UPLC BEH C8作為分析蝦青素的色譜柱。

圖1 高溫破壞的蝦青素在不同色譜柱上的色譜圖

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

比較了相同比例的乙腈–水和甲醇–水兩種不同流動(dòng)相對(duì)蝦青素及其雜質(zhì)分離效果的影響。結(jié)果表明，其它條件相同時(shí)，甲醇–水和乙腈–水作為流動(dòng)相時(shí)，主峰均能與雜質(zhì)峰有效地分離，但甲醇–水做流動(dòng)相的分離效果更好，雜質(zhì)峰之間也能基線分離，因此選擇甲醇–水體系作為流動(dòng)相?？疾觳煌壤募状绩C水對(duì)蝦青素與其雜質(zhì)峰分離效果的影響。在柱溫30℃和流速0.3 mL／min 的相同條件下，改變甲醇–水的比例(75∶25，80∶20，85∶15，90∶10)，不同比例流動(dòng)相的色譜圖如圖2所示。

圖2 高溫破壞的蝦青素在不同流動(dòng)相條件下的色譜圖

圖2結(jié)果表明，在甲醇–水(體積比為75∶25)、甲醇–水(體積比為80∶20)和甲醇–水(體積比為85∶15) 3種流動(dòng)相條件下，蝦青素均能與其雜質(zhì)峰有效地分離，但在甲醇–水(體積比為75∶25)作為流動(dòng)相時(shí)，不僅蝦青素能跟其它雜質(zhì)分離，且雜質(zhì)峰之間的分離效果更好；而當(dāng)甲醇體積比增加到90%時(shí)，蝦青素與雜質(zhì)峰未能分離。因此，選擇甲醇–水(體積比為75∶25)作為流動(dòng)相。

2.1.3 柱溫的選擇

在流動(dòng)相為甲醇–水(體積比為75∶25)和流量為0.3 mL／min 的相同條件下，考察柱溫變化(30，35，40℃)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3結(jié)果表明，在3種不同柱溫條件下，雖然樣品的保留時(shí)間隨著柱溫的提高而縮短，但變化不是特別明顯，且樣品主峰跟其它雜質(zhì)峰均分離良好。因此考慮樣品的保留時(shí)間，柱溫選擇40℃。

圖3 高溫破壞的蝦青素在不同柱溫條件下的色譜圖

2.1.4 流動(dòng)相流量的選擇

在流動(dòng)相為甲醇–水(體積比為75∶25)和柱溫40℃的相同條件下，改變流動(dòng)相流量(0.3，0.4，0.5，0.6 mL／min)，考察流量對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，樣品的保留時(shí)間隨著流量的增加而縮短，分離度基本沒(méi)有改變，但當(dāng)流量增加到0.6 mL／min時(shí)，雜質(zhì)峰之間未能很好地分開(kāi)。因此流量選擇0.5 mL／min。

圖4 高溫破壞后的蝦青素在不同流量下的色譜圖

2.2 檢出限與定量限

將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比S／N=3 時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限，S／N=10 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量下限。計(jì)算得檢出限為0.1 μg／mL，定量限為0.2 μg／mL。

2.3 線性關(guān)系

精密量取不同體積的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，1.0，2.0，4.0，8.0，10.0 μg／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2色譜條件測(cè)定其峰面積，以峰面積(Y)對(duì)蝦青素的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，蝦青素質(zhì)量濃度在0.2～10.0 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=15 078X+3 365.7，相關(guān)系數(shù)r=0.998 8。

2.4 精密度試驗(yàn)

對(duì)質(zhì)量濃度為8.0 μg／mL 的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.42%，表明該方法具有良好的精密度。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 回收試驗(yàn)

精密稱取不同量的蝦青素，按照1.3制備供試品溶液，在相當(dāng)于供試品溶液80%，100%，120%的濃度下，分別考察加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，方法的回收率為105.8%～110.3%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

采用UPLC BEH C8色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，建立了超高效液相色譜法測(cè)定蝦青素的方法。在選定的色譜條件下，蝦青素與其它雜質(zhì)得到良好分離，且該方法流動(dòng)相的流量小，樣品的保留時(shí)間短，節(jié)約溶劑和時(shí)間。該方法具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，可用于蝦青素樣品及其有關(guān)雜質(zhì)的高通量檢測(cè)。

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Determination of Astaxanthin by Ultra Performance Liquid Chromatography

Chen Weizhu， Zhang Yiping， Jin Wenhui， Fang Hua， Hong Zhuan
(Third Institute of Oceanography， State Oceanic Administration， People Republic of China; Engineering Research Center of Marine Biological Resource Comprehensive Utilization， State Oceanic Administration; Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361005， China)

A ultra performance liquid chromatography(UPLC) method for determination of astaxanthin was developed. The determination of astaxanthin was performed on a UPLC BEH C8column (50 mm×2.1 mm，1.7 μm). The influence of mobile phase，flow rate and column temperature on the separation of astaxanthin was comprehensively studied. The optimal separation condition was as follows: the mobile phase was methanol–water (volume ratio was 75∶25) with a isocratic elution profile and flow rate of 0.5 mL／min，the detection wavelength was 475 nm， the column temperature was 40℃. The mass concertration of astaxanthin has good linear ralationship with the chromatographic peak area in the range of 0.2–10.0 μg ／mL， the correlation coefficient r was 0.998 8. The detection limit was 0.1 μg／mL (S／N=3). The quantitation detection limit was 0.2 μg／mL(S／N=10). The relative standard deviation of determination results was 0.41%(n=6), and the recovery was 105.8%–110.3%. The method is rapid，simple，reliable，and sensitive with a good reproducibility, it can be used for the determination of astaxanthin.

astaxanthin; ultra–performance liquid chromatography (UPLC); rapid determination; separation of impurity

O657.7

A

1008–6145(2016)06–0026–04

10.3969／j.issn.1008–6145.2016.06.006

*福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015N0009)；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFF0201100，2016YFF0201104)；海洋生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中試技術(shù)研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)(12PZP001SF10)；廣東海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(GD2012–D01–001)

聯(lián)系人：陳偉珠；E-mail: wzchen@tio.org.cn

2016–08–12