福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物表型耐藥與gyrA基因突變特征分析

魏淑貞，趙 永，梁慶福，林 建，林淑芳

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福建省耐多藥結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物表型耐藥與gyrA基因突變特征分析

魏淑貞1，趙 永1，梁慶福1，林 建1，林淑芳1

目的 了解福建省耐多藥(Multi-drug resistant, MDR)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)的gyrA基因突變特征，為FQs耐藥菌株的快速分子藥敏檢測提供基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。方法 收集來自福建省2010-2011年和2008-2009年耐藥監(jiān)測點(diǎn)的所有MDR Mtb臨床菌株，采用常規(guī)比例法進(jìn)行FQs敏感性試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增包含gyrA耐藥決定區(qū)的基因片段，測序后比對分析。結(jié)果 共收集到MDR結(jié)核分枝桿菌臨床菌株119株，經(jīng)常規(guī)藥敏試驗(yàn)，氧氟沙星(Ofloxacin,Ofx)的耐藥率為26.89%,左氧氟沙星(Levofloxacin,Lfx)耐藥率為25.21%，莫西沙星(Moxifloxacin,Mfx)耐藥率為11.76%。FQs敏感株gyrA基因未檢測到突變。gyrA基因在Ofx耐藥菌株的突變率為84.38%(27/32)，Lfx耐藥菌株的突變率為83.33%(25/30), Mfx耐藥菌株的突變率為92.86%(13/14)。gyrA基因突變?yōu)辄c(diǎn)突變，共發(fā)現(xiàn)有5種突變類型，以Asp94Gly，Asp94Asn和Ala90Val為主。結(jié)論 福建省MDR-Mtb對FQs耐藥的主要原因是gyrA基因突變，最常見的突變位于第94位，第90位和第91位密碼子。

結(jié)核分枝桿菌；耐多藥；氟喹諾酮類藥物；基因突變

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是嚴(yán)重威脅全球公共衛(wèi)生的傳染性疾病。耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥(multidrug resistant TB，MDR-TB)和廣泛耐藥(extensively drug resistant TB， XDR-TB)的出現(xiàn)及傳播增加了結(jié)核病控制和治療的難度。氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)是目前用于治療耐藥和MDR-TB及XDR-TB的核心二線抗結(jié)核藥物，包括氧氟沙星(Ofloxacin，Ofx)，左氧氟沙星(Levofloxacin，Lfx)，莫西沙星(Moxifloxacin，Mfx)等藥物，同時(shí)該類藥物也用于對一線抗結(jié)核藥物不能耐受者的治療。然而，F(xiàn)Qs被廣泛用于呼吸道、胃腸道及泌尿系統(tǒng)感染等的治療，以及FQs的不規(guī)范使用導(dǎo)致結(jié)核病對FQs的耐藥水平增加。據(jù)2007-2008年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告顯示：MDR-TB患者中Ofx的耐藥率為27.43%[1]。對MDR-TB進(jìn)行FQs耐藥的研究受到關(guān)注。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)DNA旋轉(zhuǎn)酶是FQs作用于Mtb的唯一靶標(biāo)，F(xiàn)Qs通過抑制DNA旋轉(zhuǎn)酶的活性，阻止該酶拓?fù)洚悩?gòu)變化，干擾細(xì)菌復(fù)制、修復(fù)和重組，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Mtb旋轉(zhuǎn)酶由2個(gè)A和2個(gè)B亞單位組成，分別由gyrA和gyrB兩個(gè)基因編碼。對于臨床Mtb菌株，gyrB基因較少發(fā)生突變，gyrA基因突變是Mtb對FQs耐藥的最主要原因,并且突變位點(diǎn)主要集中于gyrA基因的FQs耐藥決定區(qū)(QRDR)[2]。然而，gyrA基因突變的頻率和突變類型具有地區(qū)差異。為了掌握福建省MDR-Mtb對FQs的表型耐藥及耐藥基因gyrA的突變特征，我們對來自福建省耐藥監(jiān)測點(diǎn)的119株MDR-Mtb臨床分離株進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株 119株MDR-Mtb臨床菌株中，79株分離自2010-2011年福建省30個(gè)耐藥監(jiān)測點(diǎn)，另40株分離自2008-2009年福建省9個(gè)耐藥監(jiān)測點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.2 菌種鑒定和藥物敏感性試驗(yàn) 收集來的菌株經(jīng)改良羅氏(L-J)培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3周，用含對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基鑒別結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌。采用WHO推薦的比例法[3]進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，各藥物臨界濃度分別為：INH 0.2 μg/mL, RFP 40 μg/mL, SM 4 μg/mL, EMB 2 μg/mL，Ofx 2 μg/mL, Lfx 2 μg/mL和Mfx 0.25 μg/mL。

1.3 制備DNA 從L-J培基中生長良好的Mtb取一菌環(huán)，溶于200 μL TE(pH=8.0)中，經(jīng)旋渦振蕩器上振蕩均勻后，放在95℃水浴鍋中15 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清。

1.4 基因擴(kuò)增及檢測 采用上游引物：5′-GGGTGCTCTATGCAATGTTCG-3′，下游引物為5′-GCCGTCGTAGTTAGGGATGA-3′，擴(kuò)增含gyrA基因耐藥決定區(qū)(第74-103個(gè)密碼子)的DNA片段長度為314 bp。PCR反應(yīng)體系為50 μL， 包括2ⅹTaq PCR Master Mix 25 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，去離子水18 μL。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃變性8 min ;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s,30個(gè)循環(huán);再72 ℃延伸5 min。同時(shí)用H37Rv的DNA作為陽性對照，用去離子水作為陰性對照。PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 測序結(jié)果比對分析 測序序列以純文本形式查詢序列輸http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST查詢框，與標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv 的gyrA基因序列進(jìn)行比對。同時(shí)排除測序引起的誤差判斷測序結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 菌株背景及測序結(jié)果用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0分析相關(guān)數(shù)據(jù)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 FQs耐藥情況 經(jīng)傳統(tǒng)藥敏檢測，119株有32株對Ofx耐藥， Ofx耐藥率為26.89%，30株耐Lfx，Lfx耐藥率為25.21%，14株耐Mfx(11.76%)，13株耐KM(10.9%),如表1所示。標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的藥敏結(jié)果均為敏感。

表1 119株MDR結(jié)核分枝桿菌臨床菌株FQs的耐藥情況
Tab.1 Susceptibility of FQs about119 MDR-Mtb strains

ResistanttoNo.ofstrainsResistantrate(%)AnyofFQs Ofx3226.89 Lfx3025.21 Mfx1411.76 KM1310.9CrossresistanttoFQs Ofx+Lfx+Mfx1411.76 Ofx+Lfx1613.44 Ofx21.68

2.2 MDR-Mtb基因突變情況 119株MDR-Mtb測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，118株菌株均發(fā)現(xiàn)gyrA基因第95位AGC→ACC突變。32株Ofx耐藥菌株中有27株gyrA基因第90位，第91位和第94位密碼子的突變，突變率為84.38%(27/32)。87株Ofx敏感株未發(fā)現(xiàn)其他位點(diǎn)突變。質(zhì)控菌株H37Rv的gyrA基因無發(fā)生突變。

2.3 MDR-Mtb菌株gyrA基因耐藥決定區(qū)突變特征 32株Ofx 耐藥菌株有27株gyrA基因發(fā)生突變，突變率84.38%(27/32)，14株第94位密碼子發(fā)生突變，其中6株發(fā)生94Asp→Gly突變，5株發(fā)生94Asp→Asn突變，3株發(fā)生94Asp→Ala突變；有9株第90位發(fā)生GCG→GTG(Ala→Val)突變；4株第91位發(fā)生TCG→CCG(Ser→Pro)突變。30株Lfx耐藥菌株有13株第94位突變，其中6株發(fā)生94Asp→Gly突變，5株發(fā)生94Asp→Asn突變，2株發(fā)生94Asp→Ala突變；有8株90Ala→Val突變；有4株91Ser→Pro突變。14株Mfx耐藥菌株有11株第94位發(fā)生突變，其中5株94Asp→Asn突變，5株94Asp→Gly突變，1株94Asp→Ala突變； 90Ala→Val突變和91Ser→Pro突變各1株。詳見表2。

表2 MDR結(jié)核分枝桿菌FQs耐藥相關(guān)的gyrA基因突變特征
Tab.2 Characteristics of gyrA mutation associated with resistant to FQs in MDR-Mtb strains

OfxLfxMfxSpecificmutationAcidaminochangeNo.ofstrainsMutationrate(%)RRR90GCG→GTG90Ala→Val13.70RRR91TCG→CCG91Ser→Pro13.70RRR94GAC→AAC94Asp→Asn518.52RRR94GAC→GCC94Asp→Ala13.70RRR94GAC→GGC94Asp→Gly518.52RRS90GCG→GTG90Ala→Val725.93RRS91TCG→CCG91Ser→Pro311.11RRS94GAC→GCC94Asp→Ala13.70RRS94GAC→GGC94Asp→Gly13.70RSS90GCG→GTG90Ala→Val13.70RSS94GAC→GCC94Asp→Ala13.70

3 討 論

FQs與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)合應(yīng)用于治療結(jié)核病，特別是耐藥結(jié)核病具有良好的治療效果。同時(shí)該類藥物被臨床廣泛用于各類感染治療，加上濫用現(xiàn)象，對FQs耐藥問題越來越嚴(yán)重。本研究中119株MDR-Mtb有32株對FQs耐藥，耐藥率為26.89%，略低于全國耐藥基線調(diào)查報(bào)告的27.43%[1]，遠(yuǎn)低于國內(nèi)學(xué)者報(bào)道的40%[4]，這可能與菌株來源有關(guān)，同時(shí)也說明了MDR-Mtb對FQs耐藥具有一定的地區(qū)差異。本研究Mfx耐藥的菌株對Ofx和Lfx 均產(chǎn)生耐藥；30株Lfx耐藥的菌株全部對Ofx耐藥，有16株對Mfx敏感(53.33%)，進(jìn)一步說明Ofx，Lfx和Mfx之間為不完全交叉耐藥，對于Ofx耐藥患者，WHO 推薦Lfx或Mfx用于Ofx耐藥患者的治療[5]。本研究119株MDR菌株有41株為pre-XDR(占34.45%)，感染pre-XDR的患者發(fā)展成為XDR-TB的危險(xiǎn)性極高，所以盡早發(fā)現(xiàn)pre-XDR患者并進(jìn)行有效治療格外關(guān)鍵。有效治療MDR-TB患者最好進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，而傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)耗時(shí)長，所需環(huán)境條件高，因此建立準(zhǔn)確檢測FQs等二線抗結(jié)核藥物耐藥的快速分子藥敏勢在必行。

gyrA基因是DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞基的編碼基因，該基因突變導(dǎo)致FQs無法與DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞基結(jié)合，使MTB對FQs產(chǎn)生耐藥[2]。32株FQs耐藥的MDR菌株在gyrA基因均有第95位AGC→ACC 突變，同時(shí)有27株FQs耐藥株發(fā)生其他位點(diǎn)的突變，86株FQs敏感的菌株在gyrA基因均檢測出第95位發(fā)生AGC→ACC 突變而其他位點(diǎn)未發(fā)生突變，另一株FQs敏感的菌株未發(fā)現(xiàn)任何位點(diǎn)的突變，這說明gyrA基因AGC95ACC是遺傳多態(tài)性的一種表現(xiàn)[4-8]，與FQs耐藥性無關(guān)。本研究中Ofx 耐藥菌株gyrA基因的突變率為84.38%(27/32)，與俄羅斯報(bào)道的83%相仿[9]，與國內(nèi)報(bào)道的78%接近[5]。Lfx耐藥菌株的突變率為83.33%(25/30), Mfx耐藥菌株的突變率為92.86%。Mfx耐藥株的突變率稍高于Ofx 耐藥株和Lfx耐藥株的突變率，可能與Mfx耐藥的菌株同時(shí)也對Ofx和Lfx耐藥有關(guān)，而這些FQs耐藥的共同機(jī)制主要是gyrA基因突變[10]。

本實(shí)驗(yàn)32株FQs耐藥菌株有27株在gyrA基因發(fā)現(xiàn)有義突變，主要突變位于第94位密碼子，其次為第90位，再次是第91位。Ofx 耐藥株和Lfx耐藥株的gyrA基因突變均以Ala90Val最為常見，其次為Asp94Gly和Asp94Asn。Mfx耐藥株突變以Asp94Gly和 Asp94Asn為常見。有文獻(xiàn)報(bào)道gyrA基因第74,83,87,88,89位等[11-12]位點(diǎn)的突變以及同一株菌gyrA基因存在雙位點(diǎn)突變[13-14]，而在本研究尚未發(fā)現(xiàn)。本次實(shí)驗(yàn)有5株FQs耐藥菌株(占15.63%)未發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變，提示了這些菌株可能存在FQs耐藥的其他機(jī)制，比如gyrB基因突變，藥物主動(dòng)外排泵的過度表達(dá)以及細(xì)胞膜的通透性下降等[15]，有待進(jìn)一步深入研究。在福建省臨床FQs耐藥的MTB分離株中，未發(fā)現(xiàn)gyrB基因突變[16]，這充分提示了gyrA基因突變是福建省FQs耐藥的MDR-TB臨床分離株的主要耐藥機(jī)制，主要突變位于第94位、第90位、第91位密碼子。gyrA基因可以作為福建省FQs耐藥的理想分子標(biāo)記物，通過檢測這些位點(diǎn)的突變情況來快速預(yù)測FQs是否耐藥，從而為臨床患者的診療贏得時(shí)間，減少耐藥的傳播。

有文獻(xiàn)報(bào)道[7]gyrA基因Asp94Asn和Asp94Gly可能引起FQs較高水平耐藥； Ala90Val和Asp94Ala可能引起FQs低水平耐藥。另有報(bào)道[8]gyrA基因Asp94Asn只發(fā)生在FQs低耐藥株，Ala90Val和Asp94Gly在FQs高水平耐藥株當(dāng)中占多數(shù)。本研究MDR菌株的突變類型以Asp94Gly，Asp94Asn 和 Ala90Val為主，是否意味著福建省MDR-Mtb菌株以FQs高水平耐藥為主，而本次研究僅單純按照WHO推薦的濃度進(jìn)行FQs藥敏測定，尚未對Ofx耐藥的菌株進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)的檢測，因此gyrA基因突變位點(diǎn)與突變類型是否與FQs的耐藥水平有關(guān)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證研究。

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Phenotypic fluoroquinolones resistance and characteristics ofgyrAmutation in MDRMycobacteriumtuberculosisisolates in Fujian, China

WEI Shu-zhen, ZHAO Yong, LIANG Qing-fu, LIN Jin, LIN Shu-fang

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention/FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,Fuzhou350001,China)

Our study investigated the phenotypic fluonoquinolones resistance and the molecular characteristics of mutation ingyrAin MDRMycobacteriumtuberculosis(Mtb) clinical strains in Fujian Province, and provided some reference for rapid molecular detection of fluonoquinolones resistance inMtb. MDR isolates collected from drug resistant survey sites through the province in 2010-2011 and 2007-2008, and the strains were conducted FQs susceptibility testing by proportion method. The quinolone resistant determining region (QRDR) ingyrAwas amplified by PCR and the PCR products were sequenced, the results of sequencing were blasted with H37Rv. Of 119 strains were collected and performed FQs susceptibility testing. The rate of resistant to FQs was 26.89% (Ofloxacin, Ofx), 25.21% (Levofloxacin, Lfx), and 11.76% (Moxifloxacin, Mfx) respectively. No mutation was found ingyrAin fluonoquinolones sensitive MDR strains. The mutation rate ofgyrAin Ofx resistant MDR strains was 84.38% (27/32), the mutation rate of Lfx resistant MDR was 83.33% (25/30), and that of Mfx was 92.86% (13/14). The characteristic ofgyrAmutation in our study was point mutation, with five mutation types, and mainly was Asp94Gly, Asp94Asn and Ala90Val. Thus, we conclude thatgyrAmutation is the main reason of MDR strains resistant to flunoquinolones in Fujian Province. And the most common mutation is in the codon 94, codon 90, and codon 91.

Mycobacteriumtuberculosis; multi-drug resistant; fluoroquinolones; gene mutation

Lin Shu-fang, Email: zqszl@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.005

林淑芳，Email: zqszl@163.com

福建省疾病預(yù)防控制中心，福建省人獸共患病重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室，福州 350001

R378.91

A

1002-2694(2016)10-0876-04

2016-04-27；

2016-08-24

福建省自然科學(xué)基金課題(No.2014J01280)資助

Supported by the Fujian Provincial Science Foundation Project (No. 2014J01280)