劉璨穎，張濟(jì)培，王丙云

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大腸桿菌O-抗原血清型鑒定研究進(jìn)展

劉璨穎，張濟(jì)培，王丙云

大腸桿菌在一定條件下能引發(fā)宿主疾病，其表面O-抗原與毒力有關(guān)。O-抗原的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)具有高度多樣性，并且O-抗原血清型種類與大腸桿菌致病性有一定聯(lián)系。因此，大腸桿菌O-抗原血清型鑒定對(duì)流行病學(xué)調(diào)查，防御和控制致病性大腸桿菌病有重要意義。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法耗時(shí)長、費(fèi)用高、準(zhǔn)確度不理想。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者對(duì)大腸桿菌196種O-抗原基因簇進(jìn)行了破譯，比較分析了不同O-抗原基因簇序列，并針對(duì)基因簇中特異性DNA序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，運(yùn)用PCR方法對(duì)O-抗原血清型進(jìn)行分型，其中包括一般PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR、DNA芯片和微球懸浮列陣法。此外，還有rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法，磁性微球免疫分析法和基于全基因組序列預(yù)測(cè)法，這些方法豐富了O-抗原血清型鑒定方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法的不足。本文概述了O-抗原合成基因簇序列和O-抗原血清型鑒定方法相關(guān)研究進(jìn)展。

大腸桿菌；O-抗原；血清型分型

大腸桿菌廣泛存在于自然界中，致病性大腸桿菌是一類重要的人獸共患病病原菌，依據(jù)致病特性分為腸內(nèi)致病性和腸外致病性大腸桿菌。腸內(nèi)致病性大腸桿菌能分泌毒素，引發(fā)宿主水樣、血樣腹瀉，甚至導(dǎo)致全身性臨床癥狀，如溶血尿毒癥和腎神經(jīng)后遺癥。腸外致病性大腸桿菌能侵襲并定殖于宿主胃腸道外組織，并誘發(fā)感染，包括腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染等。大腸桿菌菌株間差異大，常按照種系發(fā)育群、生物表型、致病特性、抗原特性等進(jìn)行分類區(qū)分[1-2]。

菌體O-抗原，表面K-抗原和鞭毛H-抗原是大腸桿菌分型的主要表面抗原[3]。O-抗原是大腸桿菌脂多糖的最外層結(jié)構(gòu)，與細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)，是細(xì)菌的毒力因子，也是細(xì)菌噬菌體和宿主免疫系統(tǒng)的主要目標(biāo)，能在宿主體內(nèi)誘發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[4-6]。?rskov于1977年提出了綜合分型方案，將大腸桿菌O-抗原分為164種，該方案是分類學(xué)、流行病學(xué)調(diào)查、疾病暴發(fā)時(shí)菌株區(qū)分以及監(jiān)控中大腸桿菌分型的主要標(biāo)準(zhǔn)[7]。隨著研究成果的不斷更新，報(bào)道有O1-O187血清型，其中6種O-抗原血清型O31、O47、O67、O72、O94和O122被撤消，4種被分為亞型O18ab/ac，O28ab/ac，O112ab/ac和O125ab/ac。此外，還有11種OX-型。因此目前大腸桿菌O-抗原血清型共有196種[8]。

O-抗原血清型種類與大腸桿菌的致病性有一定的聯(lián)系，不同致病型大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)O-抗原血清型不同。例如，腸出血性大腸桿菌的主要血清型為O157，E.coliO157菌株是重要的全球食源性病原菌[9]；禽致病性大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)血清型為O1、O2、O18和O78[10]；與尿道感染有關(guān)的大腸桿菌，其血清型主要為O1、O2、O4、O6、O7、O16、O18、O25和O75[11]；能引發(fā)新生兒腦膜炎的腸外致病性大腸桿菌菌株，其血清型主要為O18∶K1[12]；我國患病豬場(chǎng)分離的豬源腸外致病性大腸桿菌菌株優(yōu)勢(shì)血清型依次為O11、O8、O138、O161和O101[13]。因此，快速、準(zhǔn)確鑒定大腸桿菌O-抗原血清型將有助于流行病學(xué)調(diào)查，疾病診斷和疫苗研發(fā)，對(duì)防御并控制致病性大腸桿菌傳播有重要意義。

1 O-抗原概述

1.1 O-抗原組成和特性 革蘭氏陰性菌外膜脂多糖由脂質(zhì)A，核心寡糖和O-抗原多糖3部分組成。脂質(zhì)A在大腸桿菌中非常保守，是毒性成分。核心寡糖區(qū)域分為內(nèi)部和外部區(qū)域，O-抗原多糖與核心寡糖外部區(qū)域的糖基相連，具有血清型特異性，由含有3-7個(gè)單糖的寡糖單位重復(fù)連接組成。單糖種類、數(shù)量、排列方式和寡糖間鏈的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性[6,14]。基因水平轉(zhuǎn)移是O抗原高度多樣性的主要原因。基因水平轉(zhuǎn)移、重組和點(diǎn)突變能使O-抗原血清型發(fā)生轉(zhuǎn)變[15-17]。此外，獲得位于細(xì)菌噬菌體或質(zhì)粒上的O-抗原修飾基因也能導(dǎo)致細(xì)菌O-抗原血清型的差異[18-19]。具有完整O-抗原的大腸桿菌為光滑型表型，而O-抗原發(fā)生突變或丟失時(shí)，大腸桿菌失去合成O-抗原的能力，為粗糙型表型[20]。

1.2 O-抗原合成基因簇 大腸桿菌中，大部分編碼O-抗原合成酶的基因在染色體上相鄰排列，形成一個(gè)約4.5 kb(O155，含有4個(gè)基因)-19.5 kb(O108，含有18個(gè)基因)的基因簇，被稱為rfb基因簇。該基因簇兩端常有持家基因galF(UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基轉(zhuǎn)化酶編碼基因)和gnd(6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶編碼基因)，在染色體上位于可拉酸合成基因簇(wca基因)和組氨酸(his基因)合成操縱子之間[21]。DebRoy等對(duì)大腸桿菌196種O-抗原合成基因簇進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示其中有21組(46種)序列相似性高達(dá)98%～99.9%，插入元件在O-抗原合成基因簇進(jìn)化過程中發(fā)揮了重要作用[8]。但O-抗原血清型O14和O57型菌株galF和gnd基因間不含有O-抗原合成基因簇[22]。

O-抗原合成基因簇中主要包括3類基因：單糖合成酶基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理酶基因。核苷酸糖合成基因參與O-抗原核苷酸糖前體的合成，在不同O-抗原血清型中有高度相似性，且常聚集成簇[14,8]。最新研究顯示有至少27%種O-抗原血清型，核苷酸糖合成基因不位于O-抗原合成基因簇中[22]。糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移不同糖前體形成寡糖，每種O-抗原合成基因簇中含有2～6個(gè)基因編碼假定糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基轉(zhuǎn)移酶基因的點(diǎn)突變能導(dǎo)致O-抗原血清型間的差異[16]。O-抗原處理蛋白涉及O-抗原基本單位的轉(zhuǎn)運(yùn)和聚合。

在大腸桿菌中合成O-抗原多糖的途徑為Wzy聚合酶依賴型途徑和三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)盒(ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑。這兩種合成途徑中，基因wzx(糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因)/wzy(寡糖單位聚合酶編碼基因)和wzm(O-抗原ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子通透酶編碼基因)/wzt(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子ATP-結(jié)合蛋白編碼基因)分別與O-抗原基本單元轉(zhuǎn)運(yùn)和聚合有關(guān)。DebRoy等對(duì)大腸桿菌196種O-抗原合成基因簇進(jìn)行分析，顯示185種基因簇中含有wzx和wzy基因，這兩個(gè)基因與運(yùn)用Wzy聚合酶依賴型途徑合成和轉(zhuǎn)運(yùn)O-抗原有關(guān)，另外11種O-抗原血清型(O162，O101，O89，O92，O97，O52，O95，O60，O8，O99和O9)攜帶wzm和wzt基因，利用三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)盒轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑處理O-抗原。并且依據(jù)Lguchi等對(duì)大腸桿菌182種O-抗原合成基因簇wzx/wzy或wzm/wzt同源基因序列分析結(jié)果顯示，137種O-抗原合成基因簇wzx/wzy或8種O-抗原合成基因簇wzm/wzt同源基因序列差異大，同源性<70%，具有一定的O-抗原合成基因簇特異性[8,22]。

2 O-抗原血清型分型方法

2.1 傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法 傳統(tǒng)的O-抗原血清型鑒定方法是運(yùn)用特異的抗血清進(jìn)行血清凝集實(shí)驗(yàn)，需要從檢測(cè)樣品中分離出細(xì)菌并進(jìn)行富集，將細(xì)菌于100 ℃加熱2 h釋放出表面O-抗原后，與標(biāo)準(zhǔn)O-抗原血清型細(xì)菌的特異性抗血清進(jìn)行血清凝集反應(yīng)，眼觀判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。若菌體表面無脂多糖呈粗糙型，或者菌體發(fā)生自凝集，則不與抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，不能用該方法進(jìn)行鑒定。如O14型菌株為粗糙型表型，與抗血清不反應(yīng)，不能進(jìn)行血清學(xué)分型。此外血清學(xué)鑒定方法還受到血清質(zhì)量、血清來源、血清交叉反應(yīng)、以及菌體表面其他抗原成分的影響，使檢測(cè)準(zhǔn)確度、檢出率和靈敏度不太理想[8, 23]。并且傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法耗時(shí)長，花費(fèi)高，不利于大規(guī)模檢測(cè)。

2.2 基于特異性DNA序列的PCR分型方法 基于特異性DNA片段的PCR鑒定方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、準(zhǔn)確和高效的檢測(cè)，能夠很大程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定方法的不足。基因wzx/wzy或wzm/wzt具有一定的O-抗原血清型特異性，常被作為PCR和芯片分析鑒定大腸桿菌O抗原血清型的靶標(biāo)。依據(jù)基因wzx/wzy或wzm/wzt的特異性DNA片段，設(shè)計(jì)并篩選出不同O-抗原血清型的特異性引物，運(yùn)用PCR進(jìn)行大腸桿菌O-抗原血清型鑒定[24-28]。但19.8%種O-抗原血清型中wzx/wzy基因不具有特異性，或特異區(qū)域過短，無法設(shè)計(jì)引物。如O73型、O17型、O44型、O77型與O106型大腸桿菌中wzx/wzy基因的核苷酸序列同源性≥95%；wzx_O46與wzx_O134基因序列同源性為99.7%，wzx_O46基因僅在3′端區(qū)域有2 bp的缺失突變[22]。也可依據(jù)rfb基因簇中差異區(qū)域DNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒別。例如wzx/wzy-O62與wzx/wzy-O68基因的核苷酸序列同源性>97%，O62與O68型rfb基因簇序列的差異僅在于O62中含有一個(gè)748 bp的插入元件IS1，該插入元件位于rmlA基因末端。因此為了鑒定并區(qū)分大腸桿菌O62與O68型，應(yīng)在擴(kuò)增出相應(yīng)wzx/wzy基因后，再在O62型rfb基因簇IS1元件兩側(cè)設(shè)計(jì)分子標(biāo)識(shí)，依據(jù)PCR產(chǎn)物大小差別區(qū)分兩種O-抗原血清型(表1)[27]。目前，根據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，設(shè)計(jì)并篩選出特異性引物的O-抗原血清型種類有68種，DebRoy等于2011年統(tǒng)計(jì)了58種[29]，本文補(bǔ)充了10種，包括O11，O12，O23，O62，O68，O116，O131，O140，O142和O163(表1)。

表1 基于大腸桿菌O-抗原合成基因簇特異序列的PCR引物
Tab.1 PCR primers based on specific sequence of E. coli O-antigen synthesis gene cluster

O-antigenserogroupTargetPrimersequencesSizeofPCRproduct(bp)ReferenceO11wzxF:GCACGCTTACTTACAC39524R:TTCCTATTAGTACTGCTwzyF:TTTGCCTCTTGCTTTA860R:TACTGCTCCGTTCTCAO12rbfregionF:ATACCGACGACGCCGATCTG23925R:GTGTCAAATGCCTGTCACCGO23wzxF:TTTTGTTTATCTTGGGCG42326R:TTTTTTCTTATGCTGCCCwzyF:TGCATAACTCTTCAGGCG402R:GCTTGGTAAGGTACGCTGO62wzxF:ATGCTGCATTAGCGTTAGCA28827R:CCTGTTGAATTGGCACGTAArmlAF:CTACACTGATGTTAGCGGGTATT1969R:CCGCTTCAAATTCAGGACAATAAO68wzxF:ATGCTGCATTAGCGTTAGCA28827R:CCTGTTGAATTGGCACGTAArmlCF:CTACACTGATGTTAGCGGGTATT1172R:CCGCTTCAAATTCAGGACAATAA表1(續(xù))O-antigenserogroupTargetPrimersequencesSizeofPCRproduct(bp)ReferenceO116wzxF:GTTTTGTCGGTAGTGTTAGG62828R:CAAGTTGGAGGAATAAGTCGwzyF:TGCTGCCCTGTTTCATTCT548R:CATAAAAGTCCGTAGCGTAGO131wzxF:TCGTGAGAAGGCTTTTTGGT29027R:CCCTATCCAATGCGCTTAAAO140wzxF:TTGGATAGCCGCGTTAATTC29427R:GCCTGAGTTAGCGGATTGAGO142wzxF:TCTCCATCCCCGTTTATTTG28527R:CCCCAAACATTAGCATTCGTO163wzyF:GCAATCTTGAAGCCAGAACC26227R:GATAAACCCAGCCACCAAA

針對(duì)O-抗原合成基因簇特異性序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行一般PCR、多重PCR和實(shí)時(shí)PCR鑒定O-抗原血清型外[30-31]，目前還延伸至DNA芯片法和微球懸浮列陣法。

DNA芯片法是將待檢大腸桿菌O-抗原合成基因簇中基因的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸點(diǎn)在玻璃片上，然后與帶有標(biāo)簽的特異O-抗原合成基因簇長片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，依據(jù)雜交信號(hào)判斷并鑒定大腸桿菌O-抗原血清型種類。DNA芯片法已用于腸產(chǎn)毒素大腸桿菌O-抗原血清型分型[33]。DNA芯片法優(yōu)勢(shì)在于能在同一平臺(tái)上一次性鑒定多種O-抗原血清型。

磁性微球懸浮列陣法中，微球外部結(jié)合有O-抗原血清型特異性DNA序列探針，微球內(nèi)部染有不同比例紅色和紅外熒光，可以產(chǎn)生100種獨(dú)特的光譜，因此每個(gè)樣本理論上可以分析高達(dá)100種不同的結(jié)合反應(yīng)。懸浮列陣由獨(dú)特?zé)晒馕⑶蚪M成。該方法，首先提取樣品DNA為模板，用生物素標(biāo)記的多種O-抗原血清型檢測(cè)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物變性后與微球上帶有的特異性探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，再用偶聯(lián)有強(qiáng)熒光藻類色素R藻紅蛋白的鏈霉素進(jìn)行顯色檢測(cè)[34]。Lin等用該方法檢測(cè)了10種與產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌相關(guān)的O-抗原血清型[35]。

2.3 rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法 rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法是利用長片段PCR方法擴(kuò)增出待檢大腸桿菌整個(gè)rfb基因簇后，用限制性內(nèi)切酶MboII對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，通過酶切后DNA片段凝膠電泳圖譜鑒定大腸桿菌O-抗原血清型。圖譜中條帶數(shù)目為5到25條，共有147種不同O-抗原限制性片段長度多態(tài)性圖譜。但其中有13種圖譜分別對(duì)應(yīng)兩種以上O-抗原血清型[36]。此外，由于圖譜中條帶較多，不易區(qū)分，且同一條帶中可能含有多條相同大小的酶切片段，結(jié)果分析易受干擾，且該分析方法耗時(shí)較長，使得rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法有一定的限制性。

2.4 磁性微球免疫分析法 磁性微球免疫分析法，與上述微球懸浮列陣法都是使用Luminex技術(shù)，是一種復(fù)合微球感應(yīng)系統(tǒng)。采用該技術(shù)的分析，用微球表面共價(jià)固定的特異O-抗原血清型單克隆抗體來捕獲抗原。通過帶有生物素的二抗和紅藻蛋白報(bào)告子檢測(cè)到結(jié)合分析物。Luminex分析儀對(duì)結(jié)合分析物進(jìn)行量化，從而進(jìn)行多重檢測(cè)分析。微球免疫分析法的優(yōu)勢(shì)是可以同時(shí)進(jìn)行多重分析，因此能夠降低檢測(cè)的費(fèi)用，并且檢測(cè)時(shí)間較短，只需要3 h，此外該方法具有高靈敏度和特異性。Clotilde等利用該方法同時(shí)檢測(cè)了產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌O-抗原血清型O157、志賀氏毒素1和2，并且證實(shí)與標(biāo)準(zhǔn)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)相比，該方法有上述優(yōu)勢(shì)[37]。

2.5 基于全基因組序列預(yù)測(cè)法 SerotypeFinder在線預(yù)測(cè)工具通過收集已知O-抗原血清型大腸桿菌菌株中wzx/wzy或wzm/wzt基因序列建立數(shù)據(jù)庫，將待測(cè)大腸桿菌菌株的全基因組草圖或完整序列與數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用序列相似性來預(yù)測(cè)待測(cè)大腸桿菌菌株的O-抗原血清型。該方法相比于傳統(tǒng)血清學(xué)方法更為高效，但對(duì)于不同O-抗原血清型大腸桿菌中wzx/wzy或wzm/wzt基因有高度同源性時(shí)，鑒定結(jié)果不理想，且比對(duì)wzx或wzy基因可能有鑒定結(jié)果不一致的情況[38]。

3 結(jié) 語

大腸桿菌O-抗原血清型種類繁多，而血清型種類與大腸桿菌致病型有一定的聯(lián)系。因此，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模準(zhǔn)確、快速、便捷鑒定O-抗原血清型將有助于流行病學(xué)調(diào)查，疾病診斷和疫苗研發(fā)，對(duì)防御并控制致病性大腸桿菌傳播有重要意義。隨著越來越多大腸桿菌基因組序列的公布和O-抗原合成基因簇的破譯，可以基于DNA序列，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法彌補(bǔ)傳統(tǒng)血清學(xué)方法的不足，不斷完善O-抗原血清型鑒定方法。

目前已破譯196種O-抗原合成基因簇，但其中只有68種設(shè)計(jì)并篩選出了特異性分子標(biāo)識(shí)。除去O-抗原合成基因簇序列同源性>98%的21組血清型(共46種)，還有82種O-抗原血清型特異性分子標(biāo)識(shí)有待確定。O-抗原合成基因簇序列高度相似的這21組血清型(46種)中，有4組(8種)不發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，包括O2型和O50型，O46型和O134型，O118型和O151型，OX19型和O11型，可以聯(lián)合現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)血清學(xué)方法進(jìn)行O-抗原血清型鑒定。O-抗原合成基因簇序列高度相似的O-抗原血清型并不發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，可能是因?yàn)榭乖瓫Q定簇相關(guān)蛋白在翻譯后期進(jìn)行了不同的修飾，也可能是與O-抗原免疫學(xué)反應(yīng)有關(guān)的基因位于基因組中O-抗原合成基因簇以外的位置。對(duì)于不同O-抗原血清型大腸桿菌中O-抗原合成基因簇序列同源性>98%，并且傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定又出現(xiàn)交叉反應(yīng)時(shí)，應(yīng)將這些O-抗原血清型進(jìn)行融合，以免影響鑒定，包括O42型與O28ac型，O13型、O129型與O135型，O107型與O117型，O123型與O186型，O125ab型與O125ac型，O18ab型與O18ac型，OX6型與O168型，OX10型和O159型，OX21型和O163型，O38型和O128型，OX43型和O19型[8]。

大規(guī)模O-抗原血清型鑒定方法，如DNA芯片法，磁性微球懸浮列陣法，磁性微球免疫分析法和基于全基因組序列預(yù)測(cè)法等，提高了O-抗原血清型鑒定的效率和準(zhǔn)確度，將是今后血清型鑒定發(fā)展的方向。

[1] Kaper JB, Nataro JP, Mobley HL. PathogenicEscherichiacoli[J]. Nat Rev Microbiol, 2004, 2: 123-140. DOI: 10.1038/nrmicro818

[2] Smith JL, Fratamico PM, Gunther NW. Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli[J]. Foodborne Pathog Dis, 2007, 4(2): 134-163. DOI: 10.1089/fpd.2007.0087

[3] Kaufmann F. The serology of the coli group[J]. J Immunol, 1947, 57(1): 71-100.

[4] Raetz CR, Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins[J]. Annu Rev Biochem, 2002, 71: 635-700.

[5] Lerouge I, Vanderleyden J. O-antigen structural variation: mechanisms and possible roles in animal/plant-microbe interactions[J]. FEMS Microbiol Rev, 2002, 26(1): 17-47.

[6] Wang L, Wang Q, Reeves PR. The variations of O antigens in gram negative bacteria[C]//. Endotoxins: Structure, Function and Recognition, 2010, 53: 123-152

[7] ?rskov I, ?rskov F, Jann B, et al. Serology, chemistry, and genetics of O and K antigens ofEscherichiacoli[J]. Bacteriol Rev, 1977, 41(3): 667-710.

[8] DebRoy C, Fratamico PM, Yan XH, et al. Comparison of O-antigen gene clusters of all O-serogroups ofEscherichiacoliand proposal for adopting a new nomenclature for O-typing[J]. PLoS One, 2016, 11(1): e0147434. DOI: 10.1371/journal. pone.0147434

[9] Paton AW, Paton JC. Direct detection of Shiga toxigenicEscherichiacolistrains belonging to serogroups O111, O157, and O113 by multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(10): 3362-3365.

[10] Wang SH, Meng QM, Dai JJ, et al. Development of an allele-specific PCR assay for simultaneous sero-typing of avian pathogenicEscherichiacolipredominant O1, O2, O18 and O78 strains[J]. PLoS One, 2014, 9(5): e96904.

[11] Johnson JR. Virulence factors inEscherichiacoliurinary tract infection[J]. Clin Microbiol Rev, 1991, 4(1): 80-128.

[12] Johnson JR, Oswald E, O'Bryan TT, et al. Phylogenetic distribution of virulence-associated genes amongEscherichiacoliisolates associated with neonatal bacterial meningitis in the Netherlands[J]. J Infect Dis, 2002, 185(6): 774-784.

[13] Ding Y, Tang X, Lu P, et al. Clonal analysis and virulent traits of pathogenic extraintestinalEscherichiacoliisolates from swine in China[J]. BMC Vet Res, 2012, 8: 140.

[14] Stenutz R, Weintraub A, Widemalm G. The structures ofEscherichiacoliO-polysaccharide antigens[J]. FEMS Microbiol Rev, 2006, 30(3): 382-403.

[15] Rump LV, Beutin L, Fischer M, et al. Characterization of a gne: IS629 O rough:H7Escherichiacolistrain from a hemorrhagic colitis patient[J]. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(15): 5290-5291.

[16] Rump LV, Feng PC, Fischer M, et al. Genetic analysis for the lack of expression of the O157 antigen in an O Rough: H7Escherichiacolistrain[J]. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(3): 945-957.

[17] Wang Q, Perepelov AV, Wen L, et al. Identification of the two glycosyltransferase genes responsible for the difference betweenEscherichiacoliO107 and O117 O-antigens[J]. Glycobiology, 2012, 22(2): 281-287.

[18] Allison GE, Verma NK. Serotype-converting bacteriophages and O-antigen modification inShigellaflexneri[J]. Trends Microbiol, 2000, 8(1): 17-23.

[19] Sun Q, Knirel YA, Lan R, et al. A novel plasmid-encoded serotype conversion mechanism through addition of phosphoethanolamine to the O-antigen ofShigellaflexneri[J]. PLoS One, 2012, 7(9): e46095.

[20] Rittig MQ, Kaufmarm A, Robins A, et al. Smooth and rough lipopolysaccharide phenotypes of Brucella induce different intracellular trafficking and cytokine/chemokine release in human monocytes[J]. J Leukocyte Biol, 2003, 74(6): 1045-1055.

[21] Samuel G, Reeves P. Biosynthesis of O-antigens: genes and pathways involved in nucleotide sugar precursor synthesis and O-antigen assembly[J]. Carbohydr Res, 2003, 338(23): 2503-2519.

[22] Lguchi A, Lyoda S, Kikuchi T, et al. A complete view of the genetic diversity of theEscherichiacoliO-antigen biosynthesis gene cluster[J]. DNA Res, 2015, 22(1): 101-107.

[23] Orskov F, Orskov I.Escherichiacoliserotyping and disease in man and animals[J]. Can J Microbiol, 1992, 38(7): 699-704.

[24] Wang W, Peng X,Wang Q, et al. Sequence ofEscherichiacoliO-11 O-antigen gene cluster and identification of molecular markers specific to O11[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2006, 46(3): 341-346. (in Chinese)

王威，彭霞，王荃，等. 大腸桿菌O11 O-抗原基因簇序列的破譯及特異分子標(biāo)識(shí)的鑒定[J].微生物學(xué)報(bào), 2006, 46(3): 341-346.

[25] Clermont O, Johnson JR, Menard M, et al. Determination ofEscherichiacoliO types by allele-specific polymerase chain reaction: application to the O types involved in human septicemia[J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2007, 57(2): 129-136.

[26] Cheng JS, Wang W, Wang Q, et al. Molecular characterization of O-antigen gene cluster ofEscherichiacoliO23 reference strain and identification of UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2006, 46(5): 702-708. (in Chinese)

程劍松，王威，王荃，等. 大腸桿菌O23 O-抗原基因簇序列的破譯及UDP-N-乙酰葡萄糖-C4異構(gòu)酶的鑒定[J].微生物學(xué)報(bào), 2006, 46(5): 702-708.

[27] Liu YH, Yan XH, DebRoy C, et al.EscherichiacoliO-antigen gene clusters of serogroups O62, O68, O131, O140, O142, and O163: DNA sequences and similarity between O62 and O68, and PCR-based serogrouping[J]. Biosensors (Basel), 2015, 5(1): 51-68. DOI: 10.3390/bios5010051

[28] Han WQ, Wang W, Wang L. Characterization ofEscherichiacoliO116 O-antigen gene cluster and development of O-serogroup-specific PCR assay[J]. Chin J Zoonoses, 2007, 23(7): 667-671. (in Chinese)

韓巍青，王威，王磊. 大腸桿菌O116 O-抗原基因簇的破譯及PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào), 2007, 23(7): 667-671.

[29] DebRoy C, Roberts E, Fratamico PM. Detection of O antigens inEscherichiacoli[J]. Anim Health Res Rev, 2011, 12 (2): 169-185.

[30] DebRoy C, Roberts E, Davis MA, et al. Multiplex polymerase chain reaction assay for detection of nonserotypable Shiga toxin-producingEscherichiacolistrains of serogroup O147[J]. Foodborne Pathog Dis, 2010, 7(11): 1407-1414.

[31] Fratamico PM, Bagi LK, Cray WC, et al. Detection by multiplex real-time polymerase chain reaction assays and isolation of shiga toxin-producingEscherichiacoliserogroups O26, O45, O103, O111, O121, and O145 in groud beef[J]. Foodborne Pathog Dis, 2011, 8(5): 601-607.

[32] Liu YH, Fratamico PM.EscherichiacoliO antigen typing using DNA microarrays[J]. Mol Cellular Probes, 2006, 20(3/4): 239-244.

[33] Wang Q, Wang S, Beutin L, et al. Development of a DNA microarray for detection and serotyping of enterotoxigenicEscherichiacoli[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48(6): 2066-2074.

[34] Dunbar SA. Applications of Luminex○RxMAPTMtechnology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection[J]. Clinica Chimica Acta, 2006, 363(1/2): 71-82.

[35] Lin A, Nguyen L, Lee T, et al. Rapid O serogroup identification of the ten most clinically relevant STECs by Luminex microbead-based suspension array[J]. J Microbiol Methods, 2011, 87(1): 105-110.

[36] Coimbra RS, Grimont F, Lenormand P, et al. Identification ofEscherichiacoliO-serogroups by restriction of the amplified O-antigen gene cluster (rfb-RFLP)[J]. Res Microbiol, 2000, 151(8): 639-654. DOI: 10.1016/S0923-2508(00)00134-0

[37] Clotilde LM, Bernar Clay IV, Hartman GL, et al. Microbead-based immunoassay for simultaneous detection of Shiga toxins and isolation ofEscherichiacoliO157 in foods[J]. J Food Prot, 2011, 74(3): 373-379.

[38] Joensen KG, Tetzschner AM, Iguchi A, et al. Rapid and easy in silico serotyping ofEscherichiacoliusing whole genome sequencing (WGS) data[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(8): 2410-2426.

Research progress on identification ofEscherichiacoliO-antigen serogroups

LIU Can-ying, ZHANG Ji-pei, WANG Bing-yun

(DepartmentofVeterinaryMedicine,CollegeofLifeScience,FoshanUniversity,Foshan528231,China)

Escherichiacolicould cause diseases under certain conditions, O-antigens contribute to the virulence ofE.coli. The chemical composition and structure of O-antigen on the surface ofE.colihave high diversity, while specific O-antigen serotype have some connections with certain pathogenicity ofE.coli. Thus, identification of O-antigen serotypes is important for epidemiological studies and control of diseases caused by pathogenicE.coli. The traditional serological typing method is time-consuming, expensive and inaccurate. With the development of science and technology, 196 O-antigen synthesis gene clusters ofE.coliwere sequenced, different O-antigen synthesis gene clusters were compared and analyzed, and molecular markers for specific DNA sequences were designed. PCR method was applied for serotyping O-antigens, including single PCR, multiple PCR, real-time PCR, DNA microarray and microbead-based suspension array. Besides, restriction of the amplified O-antigen gene cluster, microbead-based immunoassay and whole genome sequencing were also used for serotyping O-antigens. These methods would enrich the identification method ofE.coliO-antigen serogroups and make up the deficiency of traditional serological typing method. This review focuses on the research progress about O-antigen synthesis gene cluster and O-antigen serotype identification methods.

Escherichiacoli; O-antigen; serotype

Wang Bing-yun, Email: bywang63@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.015

王丙云，Email: bywang63@163.com

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，佛山 528231

Q939

A

1002-2694(2016)10-0928-06

2016-04-28；

2016-08-12

廣東普通高校青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目(No.2015KQNCX173)

Supported by the project of the Young Creative Talents in Universities in Guangdong Province (No. 2015KQNCX173)