侯建建，白春生，張 慶，玉 柱

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，遼寧 沈陽110866；3.華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642)

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單一和復合乳酸菌添加水平對苜蓿青貯營養(yǎng)品質及蛋白組分的影響

侯建建1，白春生2，張 慶3，玉 柱1

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，遼寧 沈陽110866；3.華南農(nóng)業(yè)大學林學與風景園林學院，廣東 廣州 510642)

以第1茬現(xiàn)蕾期刈割的紫花苜蓿(Medicagosativa)為原料(干物質含量為42.56%)，結合康奈爾碳水化合物-蛋白質體系(CNCPS)，研究不同濃度的單一和復合乳酸菌對苜蓿青貯品質及蛋白組分的影響。發(fā)酵40 d后取樣分析其青貯發(fā)酵品質和營養(yǎng)成分,結果表明，所有乳酸菌處理組都能顯著降低苜蓿青貯飼料的氨態(tài)氮含量(P<0.05)，并且均未檢測到丁酸；添加量為1×107cfu·g-1的單一乳酸菌處理組氨態(tài)氮含量最低，乳酸含量最高；除添加量為1×105cfu·g-1的復合菌處理組外，其它乳酸菌處理組的pH均顯著低于無添加劑處理組(P<0.05)；乳酸菌處理后粗蛋白含量無顯著變化(P>0.05)；復合菌處理組的非蛋白氮含量顯著低于無添加劑處理組(P<0.05)；單一和復合乳酸菌都能降低蛋白組分中的非蛋白氮(PA)含量，增加快速降解真蛋白質(PB1)和中速降解真蛋白質(PB2)含量，復合菌處理的真蛋白質(PB)含量顯著高于對照的(P<0.05)。綜上所述，高濃度的單一植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)處理的苜蓿青貯發(fā)酵品質最好，復合菌能保護更多的真蛋白不被降解。

紫花苜蓿；乳酸菌；青貯品質；蛋白組分

紫花苜蓿(Medicagosativa)素有“牧草之王”的美稱。苜蓿青貯可以解決其在調制干草過程中葉片脫落和雨淋造成的營養(yǎng)物質損失，并且具有柔軟多汁、氣味芳香、適口性好的特點。但是，由于苜蓿可溶性碳水化合物含量低，具有較強的緩沖能力，因此不宜單獨青貯[1]。在苜蓿青貯中添加乳酸菌，如植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，能夠加快發(fā)酵速度，增加乳酸含量，降低pH和氨態(tài)氮含量，提高青貯發(fā)酵品質[2-7]。而且有研究報道，干酪乳桿菌(L.casei)能顯著提高苜蓿青貯發(fā)酵品質[8]。但是植物乳桿菌和干酪乳桿菌復合添加是否比單一處理效果更好尚未見報道。

對于豆科牧草特別是紫花苜蓿，青貯過程中蛋白質會降解產(chǎn)生大量的非蛋白氮(PA)，與蛋白氮相比，青貯飼料中的非蛋白氮不能被家畜有效利用，大部分氮以尿素的形式排出體外，進而降低優(yōu)質蛋白牧草氮的利用率[9]。相關研究表明，甲酸和甲醛能夠抑制苜蓿青貯過程中的蛋白質降解[10-11]，植物乳桿菌能保存更多的真蛋白質(PB)[5]，而干酪乳桿菌與植物乳桿菌復合處理對苜蓿青貯過程中蛋白降解的抑制效果還未見報道?？的螤柼妓衔?蛋白質體系(Cornell net carbohydrate and protein system，CNCPS)是繼飼料概略養(yǎng)分分析(Weende)和范式洗滌纖維(Van Soest)體系之后，充分考慮瘤胃降解特征的飼料評價體系[12]。因此,本研究設置不同濃度單一和復合乳酸菌，并結合CNCPS中蛋白質組分劃分的方法，分析探討單一植物乳桿菌和復合菌(植物乳桿菌+干酪乳桿菌)對苜蓿青貯發(fā)酵品質及其蛋白組分的影響。

1 材料與方法

1.1 青貯原料與乳酸菌

青貯原料為安徽蚌埠秋實草業(yè)種植的第1茬維斯頓紫花苜蓿，現(xiàn)蕾期刈割，用鍘草機鍘至2～3 cm，適度晾曬至水分約為60%，莖葉混合均勻。經(jīng)測定，原料干物質含量為42.56%，粗蛋白含量為21.46%，中性洗滌纖維含量和酸性洗滌纖維含量分別為36.21%和23.24%，水溶性碳水化合物含量為4.88%，非蛋白氮含量為6.02%。植物乳桿菌和干酪乳桿菌均由中國農(nóng)業(yè)大學草地研究所牧草青貯實驗室提供。

1.2 青貯處理

本試驗設置3個不同濃度的植物乳桿菌和3個不同濃度的植物乳桿菌與干酪乳桿菌的復合菌，對照組不使用任何添加劑(表1)。每個處理3個重復，分別裝入0.5 L白色塑料罐中，壓實密封，室溫保存。

表1 苜蓿青貯處理Table 1 The treatments of alfalfa silage

注：CK為對照； LP為植物乳桿菌；LC為干酪乳桿菌；cfu·g-1表示1 g鮮草添加的活菌數(shù)。

Note: CK, control group; LP,Lactobacillusplantarum; LC,L.casei; cfu·g-1, colony-forming units per gram fresh herbage.

1.3 測定指標和方法

發(fā)酵40 d后打開青貯罐，將青貯料取出，充分混勻，稱取20 g青貯料，加入180 mL蒸餾水，用九陽榨汁機攪碎1 min，先后用4層紗布和定性濾紙過濾，得到青貯飼料浸提液，于-20 ℃下保存，用于pH、乳酸、揮發(fā)性脂肪酸(包括乙酸、丙酸和丁酸)及氨態(tài)氮(NH3-N)的測定；剩余青貯料于65 ℃下烘干48 h，用植物粉碎機粉碎過0.425 mm孔徑篩后，收集保存，用于測定干物質(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、非蛋白氮(NPN)、可溶性蛋白(SOLP)、中性洗滌不溶蛋白(NDIP)和酸性洗滌不溶蛋白(ADIP)。

1.3.1 感官評價 青貯灌打開后，從青貯飼料的氣味、色澤和質地等3個方面進行評價[1]。

1.3.2 發(fā)酵指標 pH用雷磁PHS-3C型pH計測定；乳酸和揮發(fā)性脂肪酸(包括乙酸、丙酸和丁酸)采用 SHIMADZE-10A型高效液相色譜儀分析，色譜柱為ShodexRspak KC-811S-DVB gel Column 300 mm×8 mm，檢測器為SPD-M10AVP，流動相為3 mmol·L-1高氯酸，流速1 mL·min-1，進樣量5 μL，柱溫50 ℃，檢測波長210 nm[13]；NH3-N采用苯酚-次氯酸比色法測定[14]。

1.3.3 營養(yǎng)成分 DM采用烘干法測定[15]；CP采用凱氏定氮法測定[15]；NDF和ADF采用Van Soest法測定[15]。NPN采用鎢酸溶解法測定[16]；SOLP采用硼酸-磷酸緩沖液法測定[16]； NDIP用中性洗滌纖維測定后的濾袋測定[16]；ADIP用酸性洗滌纖維測定后的濾袋測定[16]；水溶性碳水化合物(WSC)采用蒽酮-硫酸比色法測定[15]。未經(jīng)過青貯處理的青貯原料同樣于65 ℃下烘干48 h，用植物粉碎機粉碎過0.425 mm孔徑篩后，收集保存，對其營養(yǎng)物質進行測定。

1.3.4 CNCPS蛋白組分計算方法[17]

PA (% CP)=NPN(% CP);

PB1(% CP)=SOLP(% CP)-PA(% CP);

PB3(% CP)=NDIP(% CP)-ADIP(% CP);

PC (% CP)=ADIP(% CP);

PB2(% CP)=100-PA(% CP)-PB1(% CP)-PB3(% CP)-PC(% CP);

PB (% CP)=PB1(% CP)+PB2(% CP)+PB3(% CP).

式中：PA、PB、PB1、PB2、PB3和PC分別為CNCPS蛋白質組分中的非蛋白氮、真蛋白質、快速降解真蛋白質、中速降解真蛋白質、慢速降解真蛋白質和結合蛋白質。% CP代表各組分占粗蛋白的百分比。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0進行單因素方差分析，用Duncan法(顯著水平為0.05)進行兩兩比較，結果用均值和標準差表示。

2 結果與分析

2.1 對苜蓿青貯發(fā)酵品質的影響

青貯發(fā)酵40 d后，打開苜蓿青貯罐，觀察到添加乳酸菌的苜蓿青貯飼料均手感松軟、色澤亮黃、有酸香味，而對照組色澤稍暗，有略微刺鼻味。

同對照相比，乳酸菌處理組的氨態(tài)氮占總氮的比(簡稱氨態(tài)氮)均顯著降低(P<0.05)，其中LP7處理組氨態(tài)氮含量最低，并且乳酸菌處理組均未檢測出丁酸(表2)。除LP5+LC5處理組外，其它乳酸菌處理組的pH均顯著低于對照組的(P<0.05)；單一菌LP5和LP6處理組的pH分別顯著低于復合菌LP5+LC5和LP6+LC6處理組和(P<0.05)，LP7處理組的pH也低于復合菌LP7+LC7處理組，但差異不顯著(P>0.05)。最高濃度乳酸菌處理組的氨態(tài)氮含量顯著低于最低濃度乳酸菌處理組的(P<0.05)。LP5+LC5處理組的乳酸含量顯著低于對照組的(P<0.05)，其它乳酸菌處理組的乳酸含量與對照之間差異不顯著(P>0.05)，復合菌LP5+LC5和LP7+LC7處理組的乳酸含量顯著低于單一菌處理組的(P<0.05)，其中LP7處理組乳酸含量最高。不同處理之間乙酸含量無顯著差異(P>0.05)，復合菌處理組的乙酸含量略低于單一菌處理組的。復合菌處理組的丙酸含量低于單一菌處理的，其中LP5+LC5處理組的丙酸含量顯著低于單一菌LP5處理組的(P<0.05)。丁酸只在對照組中檢測出。

2.2 對苜蓿青貯營養(yǎng)成分的影響

乳酸菌處理組與對照組之間干物質和粗蛋白含量無顯著差異(P>0.05)；單一菌處理組的粗蛋白含量略高于復合菌處理組的，其中，LP6處理組的粗蛋白含量顯著高于LP6+LC6處理組(P<0.05)(表3)。乳酸菌處理后中性和酸性洗滌纖維含量均增加，其中LP7處理組的中性和酸性洗滌纖維含量顯著低于LP5處理組的(P<0.05)，LP7+LC7處理組的中性洗滌纖維含量顯著低于LP5+LC5處理組的(P<0.05)。與對照相比，所有乳酸菌處理組的非蛋白氮含量均降低，其中復合菌處理組的非蛋白氮含量顯著低于對照組的(P<0.05)，其中LP7+LC7處理組的非蛋白氮含量最低。

2.3 對苜蓿青貯CNCPS蛋白組分的影響

對照組的PA含量顯著高于LP7、LP5+LC5和LP7+LC7處理組的(P<0.05)；相反,對照組的PB含量顯著低于LP7、LP5+LC5和LP7+LC7處理組的(P<0.05)；其中，LP7+LC7處理組的PA含量最低，PB含量最高；除LP7+LC7處理組外，其它乳酸菌處理組的PA和PB含量之間差異不顯著(P>0.05)。所有乳酸菌處理組的PB1含量顯著高于對照組的(P<0.05)，其中復合菌LP5+LC5處理組的PB1含量顯著高于單一菌LP5和LP6處理組的(P<0.05)。LP7+LC7處理組的PB2含量最高，且顯著高于對照組、LP5和LP6+LC6處理組的(P<0.05)，對照組PB2含量均低于乳酸菌處理組。LP6處理組的PB3含量最低，且顯著低于對照組和其它乳酸菌處理組的(P<0.05)。除LP5+LC5處理外，對照組的PC含量均顯著低于其它處理組的(P<0.05)(表4)。

表2 苜蓿青貯飼料的發(fā)酵品質Table 2 The fermentation quality of alfalfa silage

注：同列不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters within the same column mean significant difference among different treatments at 0.05 level.

表3 苜蓿青貯飼料的營養(yǎng)成分Table 3 The chemical components of alfalfa silage

表4 苜蓿青貯飼料的CNCPS蛋白組分Table 4 The CNCPS protein components of alfalfa silage

3 討論

通常情況下，發(fā)酵品質良好時，pH為4.2或更低，氨態(tài)氮占總氮含量小于10%，丁酸含量小于1%[1]。豆科牧草中低水分青貯有利于青貯飼料的穩(wěn)定貯藏[1]。本研究中對照組苜蓿青貯飼料的氨態(tài)氮含量小于10%，丁酸含量也較低，可能是因為青貯原料的DM含量為42.56%，屬于半干青貯；乳酸菌處理后苜蓿青貯飼料的pH、氨態(tài)氮和丁酸含量降低，說明乳酸菌在低水分的苜蓿青貯中能夠進一步提高青貯發(fā)酵品質[18-19]。本研究中高濃度植物乳桿菌處理的苜蓿青貯飼料的乳酸含量最高，氨態(tài)氮含量最低，同時其pH也較低，說明植物乳桿菌作為同型發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)乳酸能力較強，在青貯中能很快降低pH,從而抑制梭菌的生長[20-21]；但是同樣濃度植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合后乳酸含量降低，可能是因為復合菌處理存在異質型發(fā)酵，產(chǎn)生較少乳酸。另外，本研究中乳酸菌處理后纖維組分含量增加，且DM含量越高其纖維組分含量有增加趨勢，可能是因為紫花苜蓿在低水分青貯時，纖維組分更不易降解，而添加乳酸菌消耗了更多糖類物質，因此纖維組分含量相對增加。

相關研究表明，青貯飼料發(fā)酵過程中蛋白質的降解是由于植物蛋白酶和微生物的作用使真蛋白被分解為肽、游離氨基酸、氨以及胺等PA的過程，其中植物蛋白酶是造成青貯飼料蛋白質降解的主要原因[22-23]；微生物作用也是造成發(fā)酵飼料蛋白質降解的重要原因，飼草青貯發(fā)酵過程中的梭菌發(fā)酵可將蛋白質分解成胺和氨氣[1,24]。此外，發(fā)酵過程中蛋白質降解的程度與發(fā)酵飼料的pH有很大關聯(lián)，這主要是因為pH能夠影響蛋白酶的活性，且在低pH下植物蛋白酶的活性會受到抑制，有研究表明苜蓿中蛋白酶的最適宜pH為6.0[25]。植物乳桿菌處理后苜蓿青貯飼料中的PA含量低于不處理對照，但兩者間差異不顯著，不如甲酸處理效果顯著[5,26]。本研究中植物乳桿菌單一處理的NPN含量雖有降低，但與無添加劑對照相比，差異不顯著，可能是因為植物乳桿菌產(chǎn)生的乳酸降低了青貯飼料的pH，一定程度上抑制了植物蛋白酶的活性，但是效果不明顯。本研究還得出復合乳酸菌處理后青貯飼料中的PA含量與對照相比顯著降低，說明植物乳桿菌和干酪乳桿菌復合同時添加時，一方面pH降低抑制了植物蛋白酶的活性；另一方面，復合菌可能產(chǎn)生了抑菌物質[27]，減弱了微生物對蛋白質的降解作用，從而保護了更多的真蛋白質。因此，復合菌與單一菌相比，復合菌更能抑制苜蓿青貯過程中蛋白質的降解。此外，非蛋白氮中的長鏈肽氮是瘤胃微生物合成菌體蛋白的重要底物[11]，但是本研究只是分析了青貯飼料中PA含量，并沒有對青貯飼料中的氮組分進行深入研究。

CNCPS將蛋白質劃分為非蛋白氮是(PA)、真蛋白質(PB)和結合蛋白質(PC)，PB又被進一步分為快速降解真蛋白質(PB1)、中速降解真蛋白質(PB2)和慢速降解真蛋白質(PB3)3部分[28]。蛋白質組分中的PA、PB1和PB2是瘤胃微生物合成自身蛋白的主要氮源，但瘤胃微生物氮的合成效率是通過補充青貯蛋白氮而不是NPN提高的[29]。本研究中所有乳酸菌處理組的PA含量均低于對照組的，PB1和PB2含量均高于對照組的，其中植物乳桿菌與干酪乳桿菌復合菌處理的PB1和PB2含量增加更明顯，說明復合菌能為反芻動物瘤胃提供更有效的氮源。蛋白組分中的PB3與細胞壁結合在一起，在瘤胃中降解緩慢，其中大部分可避開瘤胃降解進入消化道[17,30]。因此，本研究中一些處理組的PB3含量增加一定程度上可為反芻動物提供瘤胃非降解蛋白質(rumen undegraded protein, RUP)，其中RUP是小腸可消化蛋白質的組成部分[31]。蛋白組分中的PC含有與木質素結合的蛋白質、單寧蛋白質復合物和其它高度抵抗微生物和哺乳類酶類的成分以及美拉德產(chǎn)物，在酸性洗滌劑中不能被溶解，在瘤胃中不能被瘤胃微生物降解，在瘤胃后消化道也不能被消化[30,32]。因此，PC組分中的氮不能被反芻家畜利用。本研究中PC含量較低，可能是因為現(xiàn)蕾期苜蓿中結合蛋白質含量較低。

此外，研究表明青貯飼料中添加乳酸菌對反芻動物瘤胃體外發(fā)酵和微生物產(chǎn)量也有影響[5,33-34]。本研究中，復合菌能夠顯著降低非蛋白氮含量，并且復合菌處理的PB1顯著增加，PB2含量也有增加趨勢。因此，在苜蓿青貯中植物乳桿菌和干酪乳桿菌復合添加可能有利于反芻動物瘤胃發(fā)酵，但仍需進一步研究其對瘤胃微生物的影響。

4 結論

單一和復合菌處理都能夠顯著降低苜蓿青貯飼料的氨態(tài)氮含量和丁酸含量；LP7處理氨態(tài)氮含量最低，乳酸含量最高；除LP5+LC5處理組外，其它乳酸菌處理組的pH均顯著低于無添加劑對照組；復合菌能顯著降低非蛋白氮含量；單一和復合菌都能降低苜蓿青貯飼料的PA含量，增加PB1和PB2含量，復合菌處理的PB含量增加更明顯。綜上所述，高濃度的植物乳桿菌處理的苜蓿青貯發(fā)酵品質較好，復合菌能保護更多的真蛋白不被降解。

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(責任編輯 茍燕妮)

Effects of different additive amount of single and multiple lactic acid bacteria on the silage quality and protein fractions of alfalfa

Hou Jian-jian1, Bai Chun-sheng2, Zhang Qing1, Yu Zhu1

(1.College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 10019, China;2.College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China;3.College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

The objective of this study was to determine the effects of applying single or multiple lactic acid bacteria (LAB) at ensiling on the fermentation quality and protein fractions of alfalfa (Medicagosativa). The protein fractions of alfalfa silage were calculated by Cornell net carbohydrate and protein system (CNCPS). The silage material was the first-cut alfalfa (425.6 g DM·kg-1fresh herbage) harvested at budding stage. Forage was packed into 21 laboratory silos and ensiled for 40 days. The results showed that all treatments with LAB had significantly lower (P<0.05) concentration of NH3-N than untreated group, and butyric acid was not detected in these treatments. The treatment of single-strain (Lactobacillusplantarum) at 1×107cfu·g-1fresh herbage had the lowest concentration of NH3-N and the highest concentration of lactic acid. Silages treated with lactic acid bacteria (other than multi-strains at 1×105cfu·g-1fresh herbage) characterized by lower (P<0.05) pH value. There was no (P>0.05) treatment effect on the content of crude protein. The content of non-protein nitrogen (NPN) in silages with all additives of LAB was reduced when compared with untreated, and silages treated with compound LAB characterized by lower (P<0.05) NPN. Additives with single and multi-strains of LAB both resulted in alfalfa silage with low concentration of non-protein nitrogen (PA), high concentration of immediately degraded protein (PB1) and intermediately degraded protein (PB2). The concentration of true protein (PB) in silage with multi-strains of LAB was higher (P<0.05) than untreated. Therefore, high concentration ofL.plantarumwas beneficial to improve the fermentation quality of alfalfa, and the proteolysis, in some extent, could be inhibited by multiple LAB at ensiling.

alfalfa; lactic acid bacteria; silage quality; protein fractions

Yu Zhu E-mail:yuzhu3@sohu.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0752

后生物生產(chǎn)層

2015-12-30 接受日期：2016-06-14

國家牧草產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-35)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303061)；天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉化與推廣項目(201404040)；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計劃項目“苜?；旌锨噘A調制技術研究與示范”第一作者：侯建建(1992-)，男，河南舞陽人，在讀碩士生，主要從事飼草加工研究。E-mail:819331877@qq.com

玉柱(1963-)，男(蒙古族)，內(nèi)蒙古通遼人，教授，博士，主要從事飼草加工貯藏與利用研究。E-mail:yuzhu3@sohu.com

S816.11;S551+.7

A

1001-0629(2016)10-2119-07*

侯建建,白春生,張慶,玉柱.單一和復合乳酸菌添加水平對苜蓿青貯營養(yǎng)品質及蛋白組分的影響.草業(yè)科學,2016,33(10)：2119-2125.

Hou J J,Bai C S,Zhang Q,Yu Z.Effects of different additive amount of single and multiple lactic acid bacteria on the silage quality and protein fractions of alfalfa.Pratacultural Science，2016,33(10)：2119-2125.