都玉蓉， 譚春敏， 徐永濤， 周智紅， 馬建濱, 2*， 郭松長(zhǎng)

(1. 青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，西寧810008； 2.青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810008； 3. 青海省三江源民族中學(xué)，西寧810001；4. 中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810007)

?

藏羚羊基因組微衛(wèi)星分析與初步驗(yàn)證

都玉蓉1， 2， 譚春敏3， 徐永濤1， 周智紅1， 馬建濱1, 2*， 郭松長(zhǎng)4*

(1. 青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，西寧810008； 2.青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810008； 3. 青海省三江源民族中學(xué)，西寧810001；4. 中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧810007)

為明確藏羚羊Pantholopshodgsoni核DNA中微衛(wèi)星分布情況和特征，利用MISA工具對(duì)藏羚羊基因組進(jìn)行微衛(wèi)星掃描。在全長(zhǎng)2 696.89 Mb的藏羚羊基因組中，搜索到723 135個(gè)微衛(wèi)星座位，其中完全型微衛(wèi)星有675 809個(gè)。6種重復(fù)類型中，單核苷酸重復(fù)最多，有471 142個(gè)，占69.72%；其次是二核苷酸、三核苷酸，分別為88 832個(gè)和86 658個(gè)，占13.14%和12.82%；六核苷酸最少，僅215個(gè)，約占0.03%。以藏羚羊基因組DNA為模板對(duì)微衛(wèi)星座位進(jìn)行驗(yàn)證，在100個(gè)微衛(wèi)星座位中篩選到8個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星座位，多態(tài)比例約為8%。本研究將為研究藏羚羊微衛(wèi)星標(biāo)記、群體遺傳多樣性、藏羚羊保護(hù)生物學(xué)提供基礎(chǔ)。

藏羚羊；基因組；微衛(wèi)星；多態(tài)性

微衛(wèi)星又稱為簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequences repeats)，是以1～6個(gè)核苷酸為基本重復(fù)單位的串聯(lián)重復(fù)序列，其長(zhǎng)度在100 bp以內(nèi)，它們廣泛存在于各類真核生物的基因組中，原核生物基因組中也含有少量的微衛(wèi)星(羅文永等，2003)。微衛(wèi)星因分布廣泛、變異度高和易于檢測(cè)等特征而被應(yīng)用于分子生態(tài)、群體遺傳學(xué)等研究領(lǐng)域(張于光等，2003)。

目前，開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法主要分為以下3類：(1)從公共數(shù)據(jù)庫(kù)或相關(guān)文獻(xiàn)中查找微衛(wèi)星座位；(2)近緣物種間引物交叉擴(kuò)增；(3)從基因組DNA中篩選微衛(wèi)星座位(程曉鳳等，2011)。近年來(lái)，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的物種進(jìn)行了大規(guī)模測(cè)序并對(duì)物種的基因組進(jìn)行了微衛(wèi)星分布特征分析(馬秋月等，2013)，從而為在全基因組層面上分析基因組中微衛(wèi)星的分布、豐度等特性提供了可能。研究微衛(wèi)星在物種基因組中的豐度及其特征還有助于了解物種基因組的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化(張學(xué)勇，李大勇，2000)。

藏羚羊Pantholopshodgsoni是國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物，對(duì)藏羚羊特異性標(biāo)記資源以及遺傳多樣性的研究已有報(bào)道。賀培建(2004)、Ruan等(2005)、周惠等(2006)以及Du等(2010)利用mtDNA D-loop的遺傳變異對(duì)藏羚羊的遺傳多樣性、遺傳分化和種群動(dòng)態(tài)等進(jìn)行了分析。陳笑(2005)和Zhou等(2007)采用跨物種引物分別對(duì)藏羚羊的40個(gè)、25個(gè)微衛(wèi)星座位進(jìn)行分析，篩選出10對(duì)和9對(duì)可穩(wěn)定擴(kuò)增、多態(tài)性較高的引物。由于藏羚羊全基因組序列已測(cè)序完成(Geetal.，2013)，并于2013年在線公布，此數(shù)據(jù)庫(kù)成為開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的有利資源，但藏羚羊特異性的標(biāo)記資源及基因組序列信息還比較匱乏，藏羚羊基因組水平上微衛(wèi)星特征分析研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究主要通過(guò)查找藏羚羊基因組開(kāi)發(fā)出的微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)藏羚羊基因組所含不同類型的微衛(wèi)星特征和組成情況進(jìn)行分析，并初步驗(yàn)證微衛(wèi)星標(biāo)記；為藏羚羊遺傳多樣性研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藏羚羊微衛(wèi)星查找和引物設(shè)計(jì)

微衛(wèi)星檢出設(shè)置為：?jiǎn)魏塑账帷?0次，二核苷酸≥8次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸≥5次。下載藏羚羊基因組數(shù)據(jù)，利用MISA工具(http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)從藏羚羊全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選微衛(wèi)星座位。微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)由Primer 3聯(lián)合Perl腳本完成。

1.2 藏羚羊基因組微衛(wèi)星的分布及出現(xiàn)頻率

根據(jù)Weber(1990)的劃分標(biāo)準(zhǔn)，不同核苷酸重復(fù)的微衛(wèi)星排列方式可以劃分為3種類型：完全型、不完全型和復(fù)合型。本研究?jī)H對(duì)藏羚羊基因組中1～6堿基重復(fù)的完全型微衛(wèi)星進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)的序列特征，統(tǒng)計(jì)分析不同核苷酸重復(fù)類型所占比例，找出不同類型微衛(wèi)星中的優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元；并對(duì)1～6核苷酸重復(fù)類型中不同的微衛(wèi)星的長(zhǎng)度變異情況進(jìn)行分析。

1.3 藏羚羊基因組微衛(wèi)星標(biāo)記初步驗(yàn)證

1.3.1 基因組DNA的提取 藏羚羊基因組DNA采用苯酚-氯仿-異戊醇方法提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，4 ℃、-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微衛(wèi)星引物驗(yàn)證 去掉單核苷酸重復(fù)類型和不能設(shè)計(jì)引物的微衛(wèi)星座位，得到46 286個(gè)微衛(wèi)星座位及其引物序列，隨機(jī)挑選并合成100對(duì)引物(可發(fā)郵件向作者索取)進(jìn)行后續(xù)篩選與初步分析。

經(jīng)溫度梯度PCR篩選出有擴(kuò)增產(chǎn)物的引物對(duì)后，混合4個(gè)藏羚羊的基因組DNA做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物是否具有多態(tài)。如該引物檢測(cè)到該座位具有多態(tài)，則以2013年采集于可可西里國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的24個(gè)藏羚羊個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增和多態(tài)檢測(cè)。微衛(wèi)星多態(tài)檢測(cè)委托上海生工生物工程有限公司采用ABI 3730測(cè)序儀進(jìn)行。

擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，X ℃(各引物對(duì)相應(yīng)的退火溫度見(jiàn)表3)退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增體系為20 μL，含ddH2O 14.4 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，dNTPs 1.6 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 1.0 μL(50 ng·μL-1)，Taq酶1 U。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏羚羊基因組微衛(wèi)星豐度分析

在全長(zhǎng)約為2 696.89 Mb的藏羚羊基因組中共有723 135個(gè)微衛(wèi)星，平均每隔3 729個(gè)堿基就有1個(gè)。其中，完全型微衛(wèi)星675 809個(gè)，占93.46%。在675 809個(gè)完全型微衛(wèi)星中，單核苷酸471 142個(gè)，占69.72%；二核苷酸88 832個(gè)，占13.14%；三核苷酸86 658個(gè)，占12.82%；四核苷酸13 561個(gè)，占2.01%；五核苷酸15 401個(gè)，占2.28%；六核苷酸215個(gè)，占0.03%(圖1)。

圖1 微衛(wèi)星座位類型(核苷酸堿基數(shù)目)分布

2.2 藏羚羊基因組微衛(wèi)星中優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元堿基的組成

根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，每個(gè)微衛(wèi)星和其理論上對(duì)等的序列都合并為一類。因此，單核苷酸重復(fù)有2種重復(fù)單元；二核苷酸重復(fù)有4種重復(fù)單元；三核苷酸重復(fù)有10種重復(fù)單元；四核苷酸重復(fù)有33種重復(fù)單元；五核苷酸重復(fù)有102種重復(fù)單元；六核苷酸重復(fù)有350種重復(fù)單元。

單核苷酸中A/T是主要的重復(fù)單元，共450 879個(gè)(95.70%)，而G/C重復(fù)單元只有20 263個(gè)。

二核苷酸重復(fù)類型中，AC/GT重復(fù)單元最常見(jiàn)，共61 045個(gè)(68.72%)；其次是AT/TA重復(fù)單元，共21 935個(gè)(24.69%)；再次是AG/CT，共5 788個(gè)(6.52%)；GC/CG數(shù)量最少，僅出現(xiàn)64次。

三核苷酸重復(fù)以AGC/GTC和ACG/CTG為主，分別有31 379個(gè)(36.21%)和31 145個(gè)(35.94%)；其他重復(fù)單元類型及頻次分別為：AAC/GTT，8 974個(gè)(10.36%)；AAT/ATT，6 726個(gè)(7.76%)；ACC/GTG，3 278個(gè)(3.78%)；AGG/CTC，1 712個(gè)(1.98%)；AAG/CTT，1 132個(gè)(1.31%)；

ACT/ATG，991個(gè)(1.14%)；ATC/GTA，927個(gè)(1.07%)；CCG/CGG，394個(gè)(0.45%)。

四核苷酸中A/T豐富的重復(fù)單元(AAAT/ATTT，AATT/ATTA，AAAG/CTTT，AAAC/GTTT，AACT/ATTG，AAGT/ATTC，AATC/GTTA，AATG/CTTA，ACAT/GTAT，AGAT/ATCT)共有10 836個(gè)，占79.91%；其中AAAT/ATTT 30.94%，AAAC/GTTT 22.54%，AAAG/CTTT 7.26%，AACT/ATTG及AATC/GTTA最少，分別占0.48%和0.45%。而G/C豐富的重復(fù)單元(CCGG/CGGC，CCCG/CGGG，CCCT/AGGG，CCCA/TGGG，CCAG/CGGT，CCTG/CGGA，CCGA/TGGC，CCGT/AGGC，CACG/CGTG，CTCG/CGAG)共551個(gè)，占4.06%；其中CCCT/AGGG 1.69%，CACG/CGTG 0.87%，CCGG/CGGC沒(méi)有出現(xiàn)。

五核苷酸中A/T重復(fù)單元(AAAAN)n1 027個(gè)、(AAANN)n14 113個(gè)，占98.31%(N代表除A以外的任何堿基，下同)；而G/C重復(fù)單元所占比例少。

六核苷酸中A/T豐富的重復(fù)單元(AAAAAN)n71個(gè)、(AAAANN)n28個(gè)，也構(gòu)成了很大一部分六核苷酸重復(fù)(46.05%)。

表1 不同堿基重復(fù)微衛(wèi)星在藏羚羊基因組中的分布

2.3 藏羚羊基因組微衛(wèi)星長(zhǎng)度分布分析

對(duì)不同重復(fù)微衛(wèi)星類型中的重復(fù)長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)重復(fù)次數(shù)>20的微衛(wèi)星相對(duì)較少，在單核苷酸中只有8 596個(gè)，占1.82%；二核苷酸中4 315個(gè)，占4.86%；三核苷酸中215個(gè)，占0.25%；四核苷酸中41個(gè)，占0.30%；五核苷酸中87個(gè)，占0.56%；六核苷酸中3個(gè)，占1.40%(表2)。以微衛(wèi)星核心重復(fù)序列的長(zhǎng)度為橫坐標(biāo)，分布頻率為縱坐標(biāo)作圖，可知每種重復(fù)微衛(wèi)星類型都隨著重復(fù)次數(shù)的遞增，頻率呈遞減趨勢(shì)，即：微衛(wèi)星長(zhǎng)度越長(zhǎng)，其豐度越低(圖2)。

2.4 藏羚羊基因組微衛(wèi)星標(biāo)記初步驗(yàn)證

100對(duì)引物中，有70對(duì)引物可獲得清晰的條帶，占引物總數(shù)的70%。混合4個(gè)藏羚羊的基因組DNA為模板并進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)8個(gè)微衛(wèi)星座位具有多態(tài)。各座位對(duì)應(yīng)的引物如表3所示。

2.5 微衛(wèi)星座位多態(tài)檢測(cè)

24個(gè)藏羚羊樣本在座位P6、P63、P67、P73、P75、P78、P90、P96上的等位基因數(shù)(NA)分別為7、11、9、9、14、14、12和9個(gè)。除座位P73和P67觀測(cè)雜合度(Ho)較低外，其余6個(gè)微衛(wèi)星座位的Ho均大于0.7，具有較高的雜合度；而各座位的期望雜合度(He)均較高；且多態(tài)信息含量(PIC)也均大于0.5(表4)。以上表明所篩選的8個(gè)微衛(wèi)星座位具有較高的遺傳變異。

3 討論

分析結(jié)果顯示藏羚羊基因組中的優(yōu)勢(shì)重復(fù)序列類型是單核苷酸重復(fù)序列，其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)序列，之后是五核苷酸、四核苷酸重復(fù)序列，六核苷酸重復(fù)序列最少，這與牛Bostaurus、山羊Caprahircu、綿羊Ovisaries(王月月等，2015)和牦牛Bosmutus、水牛Bubalusbubalis(戚文華等，2015)各重復(fù)類型微衛(wèi)星在分布數(shù)的順序上完全一致，與豬Susscrofa、犬Canislupusfamiliaris和馬Equuscaballus(王月月等，2015)以及大熊貓Ailuropodamelanoleuca、北極熊Ursusmaritimus(李午佼等，2014)的微衛(wèi)星分布順序略有不同。采用MISA工具并采用相同微衛(wèi)星檢出設(shè)置，對(duì)上述10個(gè)物種的基因組微衛(wèi)星驗(yàn)證分析得到了類似的結(jié)果，即藏羚羊1～6堿基重復(fù)微衛(wèi)星分布順序與牛、牦牛、水牛、山羊、綿羊等?？莆锓N完全一致，且其分布頻率也與這5個(gè)物種更接近；而藏羚羊1～6堿基重復(fù)微衛(wèi)星的分布順序和頻率與其他5個(gè)物種均存在較大差異(表5)。在分類上，藏羚羊與牛、牦牛、水牛、山羊和綿羊均屬于?？啤Ｒ虼?，上述結(jié)果表明物種間微衛(wèi)星分布存在一定的保守性，親緣關(guān)系越近，其分布規(guī)律越相似。

表4 藏羚羊種群多態(tài)信息

表5 11個(gè)物種微衛(wèi)星類型分布與頻率

注： 括號(hào)內(nèi)數(shù)字為該型微衛(wèi)星占物種微衛(wèi)星總數(shù)的百分比。

Note： The number in the bracket is the percentage of the repeat unit in all repeat types.

在單核苷酸重復(fù)類型中A/T(450 879)占多數(shù)，而C/G(20 263)的分布相對(duì)較少。在目前已知全基因組的物種中，如人Homosapiens、果蠅Drosophilamelanogaster、秀麗隱桿線蟲(chóng)Caenorhabditiselegans、酵母Saccharomycescerevisiae和擬南芥Arabidopsisthaliana的基因組單堿基微衛(wèi)星中也發(fā)現(xiàn)了相同的現(xiàn)象(Tóthetal.，2000)。

在二核苷酸重復(fù)類型中，比例較高的是AC/GT(68.72%)，其次是AT/TA(24.69%)、AG/CT(6.52%)，GC/CG最少。人和果蠅中，二堿基的重復(fù)由高到低依次是AC、AT和AG，擬南芥中最多的是AT，其次是AG，而在酵母中AT占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(Tóthetal.，2000)。對(duì)于CG 含量稀少的現(xiàn)象，Schorderet和Gartlar(1992)進(jìn)行了解釋：根本原因是由于基因組DNA中的CpG的甲基化，使得胞嘧啶C很容易經(jīng)過(guò)脫氨基作用轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶T。同時(shí)基因組DNA 中CpG的甲基化會(huì)成為突變的熱點(diǎn)，而且少量的GC又是維持DNA 熱力學(xué)穩(wěn)定性所必需的，這可能是導(dǎo)致GC含量偏少的原因。

在三核苷酸重復(fù)類型中，微衛(wèi)星重復(fù)的10種類型可全部被發(fā)現(xiàn)。AGC/GTC數(shù)量最多(31 379)，其次是ACG/CTG(31 145)，AAC/GTT(8 974)，AAT/ATT(6 726)，CCG/CGG最少(394)。而河豚Takifugurubripes基因組微衛(wèi)星中以AAT最多，其次是AGG和ATC，GCC最少(崔建洲等，2006)；人類基因組微衛(wèi)星的重復(fù)拷貝類別中AAT和AAC最多，接下來(lái)是AAG和AGG，ACG最少(Subramanianetal.，2003)；果蠅中AGC最多，擬南芥和秀麗隱桿線蟲(chóng)含有較多的AAG重復(fù)，而酵母中含有更多的AAT、AAG、ATG 和AGC 重復(fù)(Kattietal.，2001)。

研究結(jié)果顯示，不同重復(fù)類型核苷酸中，隨著微衛(wèi)星核心單元重復(fù)次數(shù)增加，其出現(xiàn)頻率呈遞減的趨勢(shì)，且核心單元重復(fù)次數(shù)>20的微衛(wèi)星僅占1.96%，與牦牛、水牛基因組微衛(wèi)星各核心重復(fù)單元的拷貝數(shù)分布區(qū)間高度一致(戚文華等，2015)。

本研究從46 286個(gè)藏羚羊微衛(wèi)星中隨機(jī)挑選出100對(duì)引物進(jìn)行合成并進(jìn)行溫度梯度擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示約70%的引物可以得到有效擴(kuò)增。進(jìn)一步對(duì)上述可穩(wěn)定擴(kuò)增的微衛(wèi)星座位進(jìn)行篩選、測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)微衛(wèi)星座位具有多態(tài)，占總座位數(shù)的8%。據(jù)報(bào)道，通過(guò)構(gòu)建微衛(wèi)星文庫(kù)，研究人員在中國(guó)鱟Tachypleustridentatus、鹵蟲(chóng)Artemia中分別獲得了7.5%(寧曄鳳等，2015)和9.52%(劉海珍等，2016)的多態(tài)引物，這表明通過(guò)基因組數(shù)據(jù)與通過(guò)微衛(wèi)星文庫(kù)構(gòu)建法篩選多態(tài)引物具有類似的效率。因此，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用日益豐富的物種基因組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)目標(biāo)物種的多態(tài)微衛(wèi)星座位具有簡(jiǎn)便、高效、可靠的特點(diǎn)。

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Genome-wide Characterization and Identification of Microsatellites inPantholopshodgsoni

DUYurong1, 2，TANChunmin3，XUYongtao1，ZHOUZhihong1，MAJianbin1, 2*，GUOSongchang4*

(1. School of Life and Geography Science， Qinghai Normal University， Xining 810008， China; 2. Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources in Qinghai-Tibetan Plateau, Qinghai Province, Xining 810008, China; 3. Sanjiangyuan Nationalities High School of Qinghai Province， Xining 810001， China; 4. Key Laboratory of Evolution and Adaptation of Plateau Biota， Northwest Institute of Plateau Biology， Chinese Academy of Sciences， Xining 810007， China)

To investigate the distribution and feature of simple sequence repeats or microsatellites (1～6 bp repeats)， we screened the entire genome of Tibetan antelope (Pantholopshodgsoni)(2 696.89 Mb) by using MISA. A total of 723 135 microsatellite loci including 675 809 perfect microsatellites were detected and characterized within the whole genome. Among these microsatellites， the most abundant repeat type was mononucleotide (69.72%)， followed by di- (13.14%)， tri- (12.82%)， penta- (2.28%)， tetra- (2.01%)， hexa- (0.03%) nucleotide repeat types， and the motifs AC/GT (9.09%) and ACG/CTG (4.64%) appeared in high frequency. An approximate evaluation was conducted by randomly amplifying 100 microsatellite loci， and 8 loci (8%) were proved to be polymorphic. This study provide abundant microsatellite markers for analysis of genetic variation， construction of genetic map， as well as the conservation biology investigation inP.hodgsoni.

Pantholopshodgsoni; genome; microsatellite; polymorphism

2016-08-03 接受日期：2016-10-08

青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2013-Z-751; 2013-Z-750)

都玉蓉(1968—)， 女， 教授， 研究方向：動(dòng)物分子生態(tài)學(xué), E-mail：xndyr@163.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：mjb_117@163.com; guo@nwipb.cas.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160213

Q959.8

A

1000-7083(2016)06-0845-07