糞便中分離肺炎克雷伯菌的血清型與毒力基因檢測

曹敬榮，高世超，陳 靜，2，陳典典，段園園，王培昌

(1 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053； 2 江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，江西 南昌 330201)

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·論著·

糞便中分離肺炎克雷伯菌的血清型與毒力基因檢測

曹敬榮1，高世超1，陳 靜1，2，陳典典1，段園園1，王培昌1

(1 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053； 2 江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，江西 南昌 330201)

目的 了解糞便標(biāo)本分離肺炎克雷伯菌(KPN)的血清型與毒力基因分布，為臨床治療提供依據(jù)。方法 收集2013年11月—2014年6月某院健康體檢者及住院非腹瀉患者糞便標(biāo)本分離KPN，檢測其黏液表型、 6種莢膜血清型(K1、K2、K3、K5、K54和K57)及6種毒力基因(rmpA、fimH、Aero、mrkA、wabG和ironB)，分析不同黏液表型、不同人群來源菌株莢膜血清型與毒力基因分布情況。結(jié)果 收集糞便標(biāo)本510份，其中健康體檢者92份，住院非腹瀉患者418份，分離KPN 107株(健康體檢者19株，住院非腹瀉患者88株)，糞便標(biāo)本KPN總分離率為20.98%，其中高黏液表型菌24株，非高黏液表型菌83株。分離的KPN中6種血清型和6種毒力基因均有檢出，以K1、K2、K57、K54血清型為主(48.60%)；毒力基因mrkA和wabG檢出率最高(分別為90.65%、83.18%)，rmpA+fimH+Aero+mrkA +wabG基因同時檢出最常見(30.84%)，主要分布于K1、K2、K57、K54血清型中。rmpA和Aero毒力基因主要在K1、K2、K57、K54血清型中檢出。健康體檢者KPN血清型以K1型為主(26.32%)，未檢測到K3和K57型；住院非腹瀉患者6種血清型均有檢出，以K1、K2、K57、K54為主。高黏液表型菌同時攜帶4種毒力基因以上者占83.33%(20/24)，高于非高黏液表型菌的32.53%(27/83)(χ2=19.51，P<0.01)。高黏液表型菌中K1、K2、K57、K54血清型總檢出率為91.67%(22/24)，高于非高黏液表型菌的36.14%(30/83)；rmpA、Aero毒力基因的檢出率均為95.83%，均高于非高黏液表型菌組(分別為31.32%、30.12%)(均P<0.05)。結(jié)論 糞便中分離的KPN均檢測到強(qiáng)毒力莢膜血清型和多種毒力基因，尤其在高黏液表型菌和住院患者分離菌中，應(yīng)引起臨床重視。

肺炎克雷伯菌； 肺炎； 毒力基因； 血清型； 流行病學(xué)

[Chin J Infect Control，2016，15(11)：807-812]

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KPN)是呼吸道和消化道的定植菌，也是引起臨床多種感染的常見條件致病菌，具有較強(qiáng)的毒力和致病性，且多重耐藥嚴(yán)重。目前，國內(nèi)外關(guān)于不同感染標(biāo)本中KPN的分離鑒定、耐藥情況[1-7]、相關(guān)危險因素、血清型[2-5，8-13]、毒力基因及流行病學(xué)方面研究較多，而缺乏糞便KPN莢膜血清型和毒力基因方面的報(bào)道。筆者收集某院2013年11月—2014年6月不重復(fù)門診健康體檢者及非腹瀉住院患者糞便標(biāo)本，首次對糞便中KPN進(jìn)行莢膜血清型和毒力基因檢測，以了解糞便中KPN分離率、血清型分布及攜帶毒力因子情況，為KPN引起的感染性疾病的合理治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集及菌株收集 選擇首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院2013年11月—2014年6月不重復(fù)門診健康體檢者糞便標(biāo)本，入選標(biāo)準(zhǔn)：無腸道及其他明顯感染性疾病，標(biāo)本采集前1個月未使用抗菌藥物，糞便常規(guī)檢驗(yàn)正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：有腸道感染性疾病、腹瀉、糞便常規(guī)檢驗(yàn)異常、近期使用抗菌藥物的體檢者，共92份；選取同期非腹瀉住院患者糞便標(biāo)本418份，入選標(biāo)準(zhǔn)：糞便性狀、外觀正常，鏡下未見到紅、白細(xì)胞及寄生蟲等。糞便標(biāo)本接種于中國藍(lán)平板，按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》操作，根據(jù)菌落形態(tài)特點(diǎn)初篩KPN，菌種保存于-80℃冰箱。

1.2 主要儀器與試劑 PCR儀(Veriti 9902，Applied Biosystems，USA)，電泳儀(北京六一儀器廠，中國)，凝膠成像儀(U-Genius，Gene Company， UK)，離心機(jī)((Eppendorf AG22331， Hamburg，Germany)，生物安全柜(Thermo scientific，China)，-80℃低溫冰箱(海爾)。PCR檢測試劑Premix Taq(TaKaRa，Japan)，DL2000 DNA Marker(TaKaRa，Japan)，中國藍(lán)平板和血平板(Oxoid)。

1.3 黏液絲試驗(yàn) (string test，ST)篩選高黏液表型菌[9-12]將KPN受試菌接種于5%羊血瓊脂平板，37℃孵育過夜，用細(xì)菌接種環(huán)向上挑起菌落，如不能挑起黏液絲或黏液絲長度<5 mm，判為黏液絲試驗(yàn)陰性；如挑起黏液絲長度≥5 mm，則判為黏液絲試驗(yàn)陽性。

1.4 菌株鑒定、血清型和毒力基因檢測 將凍存于-80℃冰箱的菌種復(fù)蘇，接種于哥倫比亞血平板，35℃培養(yǎng)18 h后挑取菌落，采用煮沸法提取模板DNA(200 μL)，置于-20℃?zhèn)溆?，PCR擴(kuò)增khe基因鑒定KPN[8]。委托上海英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成khe基因和6種莢膜血清型(K1、K2、K3、K5、K54和K57)及6種毒力基因(rmpA、fimH、Aero、mrkA、wabG和ironB)的引物。引物序列見表1。PCR反應(yīng)為25 μL的體系，包括Premix Taq 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，DNA模板5 μL，雙蒸水5.5 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，48～58℃退火40 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)后72℃延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像儀觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞便標(biāo)本KPN分離情況 收集的510份糞便標(biāo)本中，健康體檢者92份，住院非腹瀉患者418份，分離KPN 107株，其中男性65例，女性42例，年齡15～94歲，平均年齡(60±13)歲，60歲以上者占59.81%。糞便標(biāo)本KPN總分離率為20.98%，健康體檢者分離率為20.65%(19/92)，住院非腹瀉患者分離率為21.05%(88/418)。

2.2 KPN莢膜血清型分布和毒力基因檢測結(jié)果 107株糞便分離菌中6種血清型和6種毒力基因均有檢出，以K1、K2、K57、K54血清型為主(48.60%)；毒力基因mrkA和wabG檢出率最高(分別為90.65%、83.18%)，ironB檢出率最低(2.80%)，且ironB僅存于其他型中。同時檢測到2種、3種和4種以上毒力因子的菌株分別占13.08%、28.04%和43.93%； 組合rmpA+fimH+Aero+mrkA +wabG最常見(30.84%)，主要分布于K1、K2、K57、K54血清型中。rmpA和Aero毒力基因主要在K1、K2、K57、K54血清型中檢出。見表2。6種莢膜血清型及毒力因子PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

表2 107株KPN莢膜血清型和毒力基因檢測結(jié)果

M：DNA Marker DL2000；1—6泳道分別為血清型K1、K2，K57、K54、K5和K3；7為陰性對照；8—13泳道分別為毒力基因rmpA、fimH、Aero、mrkA、wabG和ironB

圖1 KPN血清型及毒力基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜

Figure 1 PCR amplification results of KPN serotypes and virulence genes

2.3 不同人群分離KPN血清型與毒力基因分布 健康體檢者KPN血清型以K1型為主(26.32%)，未檢測到K3和K57型。住院非腹瀉患者6種血清型均有檢出，以K1、K2、K57、K54為主，K5和K3分別僅占6.82%和1.13%；住院非腹瀉患者毒力基因fimH、mrkA、wabG在6種血清型中均有檢出。見表3。

2.4 不同黏液表型KPN的血清型與毒力基因分布 高黏液表型菌(即黏液絲試驗(yàn)陽性)24株(22.43%)，高黏液表型菌僅檢測到K1、K2、K57和K54血清型；非高黏液表型菌83株(77.57%)，6種血清型均有檢出。高黏液表型菌同時攜帶4種毒力因子以上者占83.33%(20/24)，高于非高黏液表型菌的32.53%(27/83)(χ2=19.51，P<0.01)。高黏液表型菌中K1、K2、K57、K54血清型總檢出率為91.67%(22/24)，高于非高黏液表型菌的36.14%(30/83)；rmpA、Aero毒力基因的檢出率均為95.83%，均高于非高黏液組(分別為31.32%、30.12%)(χ2值分別為19.52、31.21、32.50，均P<0.05)。見表4。

表3 不同人群糞便標(biāo)本分離KPN的血清型與毒力基因分布

表4 不同黏液表型KPN的莢膜血清型與毒力基因分布

3 討論

糞便中攜帶細(xì)菌可移位引起其他部位感染，監(jiān)測糞便中的分離菌對感染病原菌的溯源和有效防治有重要價值。本組糞便KPN總分離率為20.98%，接近于張嶸等[4]報(bào)道的22.6%；其中住院非腹瀉患者糞便KPN分離率為21.05%，是引起醫(yī)院感染的一個潛在威脅；而攜帶KPN的60歲以上的老年患者占59.81%，由于高齡患者器官及免疫功能減退、營養(yǎng)狀態(tài)不良等因素，極易發(fā)生KPN感染[14]，因此，臨床和微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)注意對住院患者，尤其老年患者糞便攜帶細(xì)菌和其他感染部位分離菌進(jìn)行監(jiān)控，以發(fā)現(xiàn)感染來源。

KPN具有較強(qiáng)的毒力和致病性，與其產(chǎn)生的毒力因子密不可分，如莢膜多糖(K抗原)、黏附因子(I、III型菌毛)[15]、鐵攝入系統(tǒng)等。目前，公認(rèn)的77種莢膜血清型中以K1、K2、K54、K57毒力最強(qiáng)、最常見[1-12]。本組6種血清型均有檢出，以強(qiáng)毒力血清型K1、K2、K57、K54為主，占6種檢測血清型的86.67%(52/60)，與以往報(bào)道[8-12]一致。黏液表型是強(qiáng)毒力血清型KPN特征之一[8-10]，本組高黏液表型菌中K1、K2、K54、K57血清型所占比率(91.67%)高于非黏液表型菌(36.14%)，可能K1、K2、K54、K57血清型與高黏液表型密切相關(guān)[8-10]；K3和K5型僅存在于非高黏液表型菌中，提示其可能與高黏液表型菌強(qiáng)毒力關(guān)系不大，但由于檢測數(shù)據(jù)量少，需增加標(biāo)本量進(jìn)一步驗(yàn)證。對不同人群糞便標(biāo)本KPN檢測發(fā)現(xiàn)，健康體檢者血清型以K1型為主，未檢測到K3和K57型，而住院非腹瀉患者6種血清型均有檢出，且以K1、K2、K57、K54為主，說明住院患者糞便攜帶更多高毒力KPN，具有引起侵襲性嚴(yán)重感染的潛在危險，應(yīng)引起臨床的高度關(guān)注。107株KPN血清型未分型者47株(43.93%)，與已鑒定的6種血清型相比所占比例較大，主要存在于非高黏液組(95.74%，45/47)，這些血清型可能為低毒力型，需對其進(jìn)行其他血清型的分型鑒定，以明確血清型未分型KPN的分布和流行趨勢。

本組6種毒力基因中mrkA、wabG和fimH檢出率最高，ironB檢出率最低，與以往報(bào)道[5]相似。fimH和mrkA分別為I型和III型菌毛的黏附蛋白，與KPN與上皮細(xì)胞的黏附相關(guān)，而wabG主要作用為分泌細(xì)胞黏附式莢膜多糖，三者均是KPN的主要致病因子。本組mrkA、wabG和fimH基因在高毒力血清型中檢出率高，提示高毒力KPN具有更強(qiáng)的黏附及侵襲力。rmpA 基因是黏液型調(diào)節(jié)因子，可增加莢膜多糖合成基因的表達(dá)和莢膜的產(chǎn)生，增強(qiáng)其毒性和侵襲力。本組rmpA和Aero基因總檢出率分別為45.79%和44.86%，但在高黏液表型菌中二者的檢出率均>95%，說明rmpA和Aero基因可能與高黏液性相關(guān)；但非黏液組中亦有31.32%的KPN檢測到rmpA 基因，可能與其他毒力因子存在抑制了黏液表型有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。本組KPN中K3和K5血清型未檢測到rmpA和Aero基因)。高黏液表型菌中同時攜帶≥4種毒力因子者所占比例高于非高黏液表型菌，與以往研究[8-10]結(jié)果一致，高黏液性KPN中毒力基因攜帶率高。住院非腹瀉患者毒力因子fimH在6種血清型中均有檢出。

本組結(jié)合黏液性狀、莢膜分型和毒力基因，判斷糞便中分離KPN的特性，發(fā)現(xiàn)KPN攜帶多種強(qiáng)毒力血清型和毒力因子，是醫(yī)院感染的重要潛在感染源，臨床應(yīng)及早關(guān)注KPN致病因子的檢測。但本組未進(jìn)行藥敏數(shù)據(jù)的相關(guān)分析，在今后的研究中，我們將進(jìn)一步探討血清型、毒力基因與抗菌藥物相關(guān)的機(jī)制，為臨床更好地防治KPN引起的感染提供依據(jù)。

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(本文編輯：左雙燕)

Detection of serotypes and virulence genes of Klebsiella pneumoniae from feces

CAO Jing-rong1，GAO Shi-chao1，CHEN Jing1,2，CHEN Dian-dian1，DUAN Yuan-yuan1, WANG Pei-chang1

(1XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China； 2JiangxiHealthVocationalCollege,Nanchang330201,China)

Objective To understand the distribution of serotypes and virulence genes ofKlebsiellapneumoniae(KPN) isolated from feces specimens, and provide basis for clinical treatment. Methods KPN isolated from feces specimens of healthy physical examination people and hospitalized patients without diarrhea in a hospital between November 2013 and June 2014 were collected. Mucoid phenotype, 6 kinds of capsule serotypes(K1, K2, K3, K5, K54, and K57), and 6 kinds of virulence genes (rmpA,fimH,Aero,mrkA,wabG, andironB)were detected, distribution of capsule serotypes and virulence genes in KPN of different mucoid phenotypes and from different populations were analyzed. Results A total of 510 feces specimens were collected, 92 were from healthy physical examination people and 418 from hospitalized patients without diarrhea, 107 strains of KPN were isolated ( 19 from healthy physical examination people, and 88 from hospitalized patients without diarrhea),the total isolation rate of KPN from feces specimens was 20.98%, 24 isolates were hypermucoviscous phenotype KPN (HMVKP) stains, and 83 were non-HMVKP strains. 6 kinds of capsule serotypes and 6 kinds of virulence genes were all detected among KPN, the major were K1, K2, K57, and K54 serotypes(48.60%)；the detection rates of virulence genesmrkA andwabG were the highest (90.65% and 83.18% respectively), simultaneous detection ofrmpA+fimH+Aero+mrkA +wabG gene was most common (30.84%), which mainly distributed in K1,K2,K57,and K54 serotypes.rmpA andAerovirulence genes were mainly detected in K1,K2,K57,and K54 serotypes. Among healthy physical examination people, the main serotype of KPN was K1 type(26.32%)，while K3 and K57 types were not detected; 6 kinds of capsule serotypes were all detected from hospitalized patients without diarrhea, the major types were K1, K2, K57, and K54. HMVKP strains carrying 4 kinds of virulence genes was higher than non-HMVKP strains (83.33%[20/24] vs 32.53%[27/83],χ2=19.51，P<0.01). The total detection rate of K1, K2, K57, and K54 serotypes in HMVKP strains were higher than non-HMVKP strains (91.67%[22/24] vs 36.14%[30/83])； the detection rates ofrmpA andAerogenes were both 95.83%, which were higher than those in non-HMVKP strains (31.32% and 30.12% respectively)( bothP<0.05). Conclusion Hypervirulence capsular serotypes and multiple virulence genes are detected in KPN from feces, especially HMVKP strains and strains from hospitalized patients, which should be paid attention.

Klebsiellapneumoniae; pneumoniae; virulence gene; serotype; epidemiology

?因引物序列及來源參考文獻(xiàn)Table 1

靶基因引物序列(5’-3’)片段長度(bp)來源參考文獻(xiàn)K1F：GGTGCTCTTTACATCATTGC1283[1，2，8，9]R：GCAATGGCCATTTGCGTTAGK2F：GACCCGATATTCATACTTGACAGAG641[1，2，8，9]R：CCTGAAGTAAAATCGTAAATAGATGGCK5F：TGGTAGTGATGCTCGCGA280[1，9]R：CCTGAACCCACCCCAATCK54F：CATTAGCTCAGTGGTTGGCT881[1，8]R：GCTTGACAAACACCATAGCAGK57F：CTCAGGGCTAGAAGTGTCAT1037[1，8]R：CACTAACCCAGAAAGTCGAGK3F：TAGGCAATTGACTTTAGGTG549[1]R：AGTGAATCAGCCTTCACCTkheF：TGATTGCATTCGCCACTGG428[8]R：GGTCAACCCAACGATCCTGrmpAF：ACTGGGCTACCTCTGCTTCA536[1，8，9]R：CTTGCATGAGCCATCTTTCAfimHF：ATGAACGCCTGGTCCTTTGC688[1]R：GCTGAACGCCTATCCCCTGCAeroF：GCATAGGCGGATACGAACAT556[9]R：CACAGGGCAATTGCTTACCTmrkAF：CCGCTCGAGTTACTGATAAGTAATTTCGTAAG609[14]R：CGCGGATCCATGAAAAAGGTTCTTCTCTCTGwabGF：CGGACTGGCAGATCCATATC683[1]R：ACCATCGGCCATTTGATAGAironBF：GGCTACTGATACTTGACTATTC992[1，8]R：CAGGATACAATAGCCCATAG

2015-12-08

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院院級基金(2014)

曹敬榮(1979-)，女(漢族)，河北省邢臺市人，主治醫(yī)師，主要從事臨床微生物檢驗(yàn)、細(xì)菌耐藥性及分子流行病學(xué)研究。

王培昌 E-mail: pcw1905@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.11.001

R181.3+2

A

1671-9638(2016)11-0807-06