姚彥坡，張立田，鄭百芹，張建民，董李學(xué)，項(xiàng)愛麗，李愛軍

(河北省唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)站，河北 唐山 063000)

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花生黃曲霉毒素污染生防細(xì)菌篩選及菌株B85-1的鑒定和抗菌活性

姚彥坡，張立田，鄭百芹，張建民，董李學(xué)，項(xiàng)愛麗，李愛軍*

(河北省唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)站，河北 唐山 063000)

從采自廣西、江西、湖北及河北花生產(chǎn)區(qū)的花生莢果內(nèi)分離到511株內(nèi)生細(xì)菌。平板拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有10株拮抗細(xì)菌對黃曲霉菌具有顯著的抑制作用，拮抗帶寬超過10 mm，抑制率從45.5%～90.2%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8株內(nèi)生拮抗細(xì)菌對黃曲霉菌生長及毒素產(chǎn)生有較強(qiáng)的抑制作用，對黃曲霉菌的防治效果為22.5%～65.0%，對黃曲霉毒素污染的抑制率為40.0%～90.5%，其中，菌株B85-1、B11-3及B50-9對黃曲霉菌的防治效果分別達(dá)到65.0%、60.0%和44.2%，抑毒率最強(qiáng)菌株為B85-1、B50-9及B78-5，抑毒率分別為90.5%、75.2%和74.5%。田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株B85-1促生率及抑毒率最高，分別達(dá)到4.5%及65.5%，生防潛力巨大。經(jīng)形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)分析，初步鑒定菌株B85-1為解淀粉芽孢桿菌。菌株B85-1發(fā)酵液、上清液、濾液及粗蛋白提取液對黃曲霉菌菌絲生長與孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制活性。

花生；黃曲霉菌; 生防細(xì)菌；抗菌活性

花生是我國主要油料作物之一，同時(shí)也是重要的飼料原材料。花生在生長、儲(chǔ)藏和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中易受到霉菌毒素的污染，特別是黃曲霉毒素，這將嚴(yán)重影響到花生農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全。如何解決花生霉菌毒素污染問題，已成為一個(gè)亟待解決的難題。

黃曲霉菌寄主范圍廣，產(chǎn)生的黃曲霉毒素污染危害重，給花生、玉米、油菜等農(nóng)作物的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失，每年導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元[1-2]。黃曲霉毒素是一類強(qiáng)致癌、劇毒性真菌毒素，包括B、G和M族，其中B1最普遍且毒性最強(qiáng)，為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，致癌力為六六六農(nóng)藥的10000倍[3-4]，因此，加強(qiáng)花生等農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉侵染及毒素污染的防控刻不容緩。目前，防控花生黃曲霉菌侵染及毒素污染以化學(xué)防治為主，由于化學(xué)防治成本較高和易污染環(huán)境，而且病原物易對殺菌劑產(chǎn)生耐藥性甚至抗藥性，所以，尋找一種對人體健康、對環(huán)境友好的防控措施勢在必行。植物內(nèi)生細(xì)菌分布廣、種類多、數(shù)量大，在長期進(jìn)化過程中，與植物建立了密切關(guān)系，其中有些細(xì)菌具有抑制病原菌、促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)植株抗逆性、增殖和擴(kuò)散快等優(yōu)點(diǎn)，因而成為發(fā)展前景很好的植物病害生防菌[5-6]。

目前，國內(nèi)花生內(nèi)生拮抗菌的研究主要針對花生根腐病和莖腐病，對花生黃曲霉毒素污染的研究鮮有報(bào)道。本文以黃曲霉菌及毒素污染為研究對象，從健康的花生莢果中分離出內(nèi)生細(xì)菌，并采用活體方法篩選拮抗細(xì)菌，研究內(nèi)生拮抗菌的抗菌活性，以期為解決花生黃曲霉毒素污染的防控瓶頸問題探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及植物

花生黃曲霉菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所質(zhì)標(biāo)室/農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。內(nèi)生細(xì)菌自江西、廣西、湖北及河北省等黃曲霉菌侵染嚴(yán)重病區(qū)的健康花生莢果內(nèi)分離獲得。供試花生品種：唐花11號(唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生研究室提供)。

1.2 花生內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化與保存

花生內(nèi)生細(xì)菌的分離參照Dey等[5]方法。選取江西、廣西、湖北及河北省等罹病花生田中健康花生植株，連同土壤一同帶回實(shí)驗(yàn)室分離。超凈工作臺上將花生植株上部長有葉片的莖稈剪掉，輕輕抖掉莢果上附著且結(jié)合程度低的土壤，將健康莢果及其上附著牢固的土壤一起放入無菌水中，震蕩30min，獲得土壤懸浮液。將莢果從上述土壤懸浮液中無菌操作取出，用吸水紙吸干后用鑷子夾至無菌天平上稱重。將稱重后的花生莢果用自來水及牙刷洗凈表面土壤至眼睛看不見為止，然后在無菌三角瓶中用3%次氯酸鈉溶液浸泡10min，最后無菌水沖洗5次，瀝干水分。取出花生莢果，無菌操作掰開莢果，將果殼用無菌剪刀平均分成5等份，放置在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板中，于28℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長狀況，并及時(shí)挑取特征差異明顯、分離良好的單菌落，進(jìn)一步純化獲得純菌株，在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上保藏備用。

1.3 花生內(nèi)生拮抗細(xì)菌的離體篩選

采用對峙培養(yǎng)法對黃曲霉菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選。將預(yù)先準(zhǔn)備好的黃曲霉菌菌碟置于PDA平板中央，然后用高溫滅菌的牙簽蘸取內(nèi)生細(xì)菌，等距離(距病原菌2cm處)對稱點(diǎn)接到PDA平板上，于28℃黑暗培養(yǎng)，3～7d觀察抑菌帶有無及大小，重復(fù)3次。選出抑菌帶較寬的內(nèi)生細(xì)菌菌株在花生籽仁上進(jìn)行復(fù)篩及計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×100

1.4 花生黃曲霉菌內(nèi)生拮抗細(xì)菌的活體篩選

1.4.1 拮抗菌發(fā)酵液的準(zhǔn)備 用挑針挑取離體實(shí)驗(yàn)中具有抑菌活性的拮抗細(xì)菌菌株的單菌落，轉(zhuǎn)移至裝有50mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，于28℃、150r·min-1振蕩培養(yǎng)1 d。吸1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有50mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中，28℃、150r·min-1振蕩培養(yǎng)2d，獲得拮抗菌株的發(fā)酵液。

1.4.2 拮抗細(xì)菌的活體篩選 把上述發(fā)酵2d的拮抗菌發(fā)酵液(孢子最終濃度為3.0×106孢子·mL-1)和培養(yǎng)7d生長旺盛的黃曲霉菌菌懸液(孢子最終濃度為3.0×106孢子·mL-1)分別浸泡花生籽仁30 min，陰涼處晾干后放入無菌平板，每板20粒花生，放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為：溫度28℃，濕度70%～80%，光照為12 h黑暗/12 h光照。以不浸菌液為空白對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.5 田間試驗(yàn)

采用隨機(jī)設(shè)計(jì)，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)的面積為15 m×3 m。將60kg·hm-2(1×108孢子·g-1)生防制劑于花生播種時(shí)隨肥料施入，設(shè)置化學(xué)防治方法(70%甲基托布津可濕性粉劑0.5g/棵)及對照，農(nóng)藥的施用方法同生防制劑?；ㄉ斋@后每處理隨機(jī)調(diào)查5個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)10株。調(diào)查生防菌對黃曲霉毒素污染的防治效果及促生效果。

抑毒率(%)=(對照毒素量-處理毒素量)/對照毒素量×100

促生率(%)=(對照株高-處理株高)/對照株高×100

1.6 內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株B85-1的鑒定

1.6.1 常規(guī)鑒定方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.6.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增及序列測定 生防細(xì)菌基因組DNA的提取采取試劑盒的方法。以27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')為引物擴(kuò)增細(xì)菌菌株的16S rDNA。PCR體系：10×PCR緩沖液5μL，dNTPs(10 mmo1)lμL，引物27f(10μmol·L-1)1μL，引物R1492(10μmol·L-1)1μL，模板DNA約10pmol，Taq酶(5μ·μL-1)0.25μL，加重蒸水至50μL。擴(kuò)增條件：98℃ 5min；95℃ 35s，55℃ 35s，72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標(biāo)DNA片段，由上海派諾森生物公司測序；測序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank進(jìn)行同源性比較，以ClustalX進(jìn)行多序列比對后，用MEGA 4.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 菌株B85-1對花生黃曲霉菌的抑制作用

1.7.1 上清液和過濾液制備 生防菌B85-1在LB斜面上活化后，取一環(huán)于LB培養(yǎng)液中，100mL/300mL裝液量，37℃，160r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后，制備成的處理液在12000 r·min-1下離心15 min，取上清，用0.22μm細(xì)菌過濾器過濾后得到無菌的過濾液。

1.7.2 菌懸液制備 培養(yǎng)液在12000 r·min-1下離心15 min，棄上清，用無菌水清洗3次再離心，加入無菌水。

1.7.3 蛋白粗提液 培養(yǎng)液于4℃下12000 r·min-1離心15min棄沉淀，在上清液中加固體硫酸銨至70%飽和度，4℃靜置過夜，于4℃下10000 r·min-1離心20 min，棄上清液，沉淀用1/25體積10 mmol/L，pH7.0磷酸緩沖液懸浮，然后用0.22μm細(xì)菌過濾器過濾除掉可能存在的細(xì)菌。

1.7.4 生防菌代謝產(chǎn)物對黃曲霉菌菌絲生長的影響 測定方法：取黃曲霉菌菌懸液5mL(1×106孢子·mL-1)，放入溫度降到35℃左右PDA三角瓶中(100mL/350mL)，搖晃2min后，均勻地倒入培養(yǎng)皿中。用打孔器在PDA平板周圍等距離打3個(gè)孔，用移液槍分別加入100μL上清液、過濾液、冷凍上清液、冷凍過濾液及蛋白粗提液，30℃培養(yǎng)3～5d，待CK長滿平板時(shí)檢測各處理抑菌圈的半徑，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。同時(shí)，研究生防菌過濾液在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、110℃下的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)在水浴鍋中浸加熱1 h，121℃溫度下處理20 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生內(nèi)生細(xì)菌的分離

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及出現(xiàn)的早晚等差異，從表面徹底消毒的花生莢果碾碎液涂布的平板中挑取不同菌落進(jìn)行純化，得到511株內(nèi)生細(xì)菌。其中，江西健康花生莢果上共分離出內(nèi)生菌115株，廣西健康花生莢果上共分離出內(nèi)生菌142株，湖北健康花生莢果上共分離出內(nèi)生菌152株，河北健康花生莢果上共分離出內(nèi)生菌102株。結(jié)果顯示，不同省份區(qū)域的花生莢果內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量明顯不同。

2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

2.2.1 離體拮抗篩選 將分離獲得的511株花生內(nèi)生細(xì)菌通過對峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗篩選，其中，10株生防菌的抑菌帶寬均在10mm以上，拮抗效果在45%以上。菌株B85-1對花生黃曲霉菌的抑制率最高，達(dá)90.2%，其次為菌株B78-5和B423-2，抑制率分別達(dá)82.5%和75.5% (表1)。

表 1 生防菌株對黃曲霉菌的拮抗作用

2.2.2 活體拮抗篩選 將離體條件下具有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌在花生籽仁上進(jìn)行活體篩選(表2)，結(jié)果表明，獲得的內(nèi)生細(xì)菌在籽仁上表現(xiàn)出較好防病效果，對黃曲霉菌毒素污染抑制率較高?；ㄉ鷥?nèi)生拮抗細(xì)菌對花生黃曲霉菌的防病效果為22.5%～65.0%，其中，菌株B85-1對花生黃曲霉菌的防效最高，達(dá)65.0%，其次為菌株B11-3和B50-9，防效分別為60.0%和44.7%。抑毒效果較好的菌株分別為B85-1、B50-9、B78-5，抑制率分別為90.5%、75.2%、74.5%。

表 2 拮抗菌對黃曲霉菌的防治效果及抑毒率 (%)

2.2.3 田間試驗(yàn) 田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，生防菌對黃曲霉毒素污染具有較好的抑制效果，除菌株B11-3及B42-1外，其他菌株均具有一定程度的促生作用，菌株B85-1促生率及抑毒率最高，分別達(dá)到4.5%及65.5%，該菌株有進(jìn)一步研究的價(jià)值，生防潛力巨大，其次是菌株B78-5，促生率及抑毒率分別達(dá)到3.5%及61.5% (表3)。

2.3 菌株B85-1的鑒定

2.3.1 常規(guī)鑒定 形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，菌株B85-1在NA培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不產(chǎn)色素；菌體桿狀，大小為(0.9～1.2)μm×(2.8～3.2)μm；革蘭氏染色陽性；產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形；具有運(yùn)動(dòng)性，證明該菌株為芽孢桿菌(Bacillussp.)。

菌株B85-1接觸酶反應(yīng)、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌醇及纖維二糖均為陽性，氧化酶、D-阿拉伯糖等試驗(yàn)均為陰性。該菌株與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的特征基本相似，因此判斷該菌株可能為解淀粉芽孢桿菌[8-9](表4)。

表 3 生防菌對黃曲霉毒素抑制率及對花生促生效果 (%)

表 4 菌株B85-1的生理生化特征

注：“+”為陽性反應(yīng)，“-”為陰性反應(yīng)。

Note: "+"means positive reaction, "-"means negative reaction.

2.3.2 16S rDNA的序列分析 以菌株B85-1基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到該菌株1.48kb左右的16S rDNA。測序結(jié)果表明該菌株16S rDNA序列長度為1477bp。BLAST分析發(fā)現(xiàn)該菌株的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬細(xì)菌的16S rDNA相似，用Clustal W進(jìn)行多重序列對比，用軟件MEGA 4.0按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(附圖)。菌株B85-1與解淀粉芽孢桿菌菌株JF496388關(guān)系最緊密，同源性達(dá)到98%。結(jié)合菌株B85-1形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)測定等鑒定結(jié)果，初步將菌株B85-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

附圖 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株B85-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. Phylogenetic tree of strain B85-1 based on 16S rDNA sequences

2.4 菌株B85-1代謝物對黃曲霉菌的影響

6株生防菌培養(yǎng)液對病原菌菌絲生長作用的抑制作用均為100%；生防菌蛋白粗提液的抑制作用也很強(qiáng)，達(dá)到96%以上；生防菌過濾液和凍過濾抑菌率均在30%以上，其中B10-8抑菌率最強(qiáng)，分別達(dá)到55.0%和50.0%，其次是B85-1，達(dá)到52.5%和45.5%；生防菌的上清液和凍上清抑菌率在52%以上，其中B85-1抑菌率最強(qiáng)，分別達(dá)到65.5%和60.0%，其次是B10-8，分別達(dá)到62.0%和60.0% (表5)。

溫度對生防菌代謝產(chǎn)物作用影響顯著，尤其對菌株B85-1、B11-3和B423-2影響明顯，超過60℃將失去對黃曲霉菌孢子萌發(fā)的抑制作用，說明生防活性物質(zhì)對熱較敏感，溫度對菌株B78-5、B10-8和B50-9影響不明顯，生防活性物質(zhì)對熱不敏感 (表6)。

表 5 生防菌代謝產(chǎn)物對黃曲霉菌生長的抑制作用

表 6 溫度對生防菌代謝產(chǎn)物的影響作用

3 討 論

生態(tài)環(huán)境中存在諸多生物致癌因素，其中由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素是已知的生物毒素中毒性最強(qiáng)的一種[1,11-13]，該毒素可通過不同途徑進(jìn)入人體誘導(dǎo)產(chǎn)生惡性腫瘤，而治理黃曲霉毒素的最佳辦法就是預(yù)防[14-15]。本研究采用對人體無害、對環(huán)境友好的生物防治技術(shù)，針對花生黃曲霉毒素的生防細(xì)菌展開研究。從我國不同主產(chǎn)區(qū)的花生莢果內(nèi)生環(huán)境中分離不同類群的細(xì)菌，篩選出高效抑制黃曲霉菌生長及黃曲霉毒素合成的生防細(xì)菌，選擇抑菌抑毒能力較強(qiáng)的生防菌株對其生防機(jī)制進(jìn)行研究。

內(nèi)生細(xì)菌在植物體內(nèi)具有穩(wěn)定的生存空間，不易受環(huán)境條件影響，可以在植物體內(nèi)繁殖和生長，成為生物防治中有潛力的生防菌而加以利用[10]。研究結(jié)果顯示出不同區(qū)域花生莢果內(nèi)細(xì)菌數(shù)量和種類明顯不同，這可能與不同花生黃曲霉菌的發(fā)生程度、內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)入花生體內(nèi)的方式、植株組織結(jié)構(gòu)及營養(yǎng)物質(zhì)分布有關(guān)。本研究從病區(qū)健康的花生莢果中分離內(nèi)生細(xì)菌，分離到的511株內(nèi)生細(xì)菌中有20株對花生黃曲霉菌有較強(qiáng)的拮抗作用，經(jīng)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和田間試驗(yàn)，菌株B85-1對黃曲霉毒素污染的防治效果室內(nèi)和田間分別達(dá)到90%及60%以上，具有較好的開發(fā)應(yīng)用潛力。菌株B85-1發(fā)酵濾液、上清液及蛋白粗提液對黃曲霉菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制活性。本研究表明，內(nèi)生拮抗細(xì)菌B85-1可通過分泌抗菌物質(zhì)來抑制黃曲霉菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，抑制和減輕黃曲霉菌侵染和毒素污染的發(fā)生，即菌株分泌的抗菌物質(zhì)為菌株抑菌抑毒機(jī)制之一。但其解毒機(jī)制、對環(huán)境中微生物種類和區(qū)系影響、定殖能力、對花生品質(zhì)與防病作用的關(guān)系有待進(jìn)一步深入探索和研究。

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Screening of Peanut Endophytic Bacterial Antagonists againstAspergillusflavus,and Identification and Antagonistic Activities of Strain B85-1

YAO Yan-po, ZHANG Li-tian, ZHENG Bai-qin, ZHANG Jian-min, DONG Li-xue, XIANG Ai-li, LI Ai-jun*

(Tangshan Livestock and Aquatic Products Quality Inspection and Test Center/Agricultural Product QualitySafetyRiskAssessmentExperimentStation,MinistryofAgriculture,Tangshan063000,China)

511 strains of endophytic bacteria were isolated from healthy peanut pods in severely infested plots in Guangxi, Jiangxi, Hubei and Hebei Provinces. Their antagonistic activities toAspergillusflavuswere tested by peanut in vivo and dual culture tests. The results showed that 10 strains from peanut pods showed strong antagonistic activities toAspergillusflavuswith the width of inhibition zones more than 10 mm, control efficiency from 45.5% to 90.2%. The control efficacy of 8 strains of the endophytic bacteria to peanutAspergillusflavusranged from 22.5%to 65.0%, inhibitory rate of poison to aflatoxin from 45.5%to 90.5%, and the control efficiency of B85-1、B11-3 and B78-5 were 65.0%、60.0% and 44.2%, respectively, inhibitory rate of poison of B85-1, B50-9, B78-5 were 90.5%, 75.2% and 74.5%, respectively. Based on the morphological, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis, strain B85-1 identified asBacillusamyloliquefaciens. The fermentation filtrate, supernatant, filtrate and crude protein extract of B85-1 showed strong antagonistic activities to the hyphal growth, hyphal morphology and spore germination ofAspergillusflavus.

peanut;Aspergillusflavus; biocontrol bacteria; antagonistic activity

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.03.004

2016-03-18

國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估重大專項(xiàng)(GJFP2015007)；農(nóng)業(yè)部生物毒素檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題

姚彥坡(1977-)，男，河北邯鄲人，唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心高級農(nóng)藝師，博士，主要從事糧油產(chǎn)品質(zhì)量安全、產(chǎn)毒真菌防控及微生態(tài)學(xué)研究。

*通訊作者：李愛軍，男，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail: ts03157909155@163.com

S565.2; S154.36

A