曾繁榮，鄭智彪，鄭曙劍，廖祝元，范衛(wèi)永

(1 江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000；2 杭州隆基生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311121)

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一種新型可替寧抗原的合成

曾繁榮，鄭智彪，鄭曙劍，廖祝元，范衛(wèi)永

(1 江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000；2 杭州隆基生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311121)

合成了(S)-可替寧半抗原及人工抗原，并鑒定其是否合成成功。以(S)-可替寧為起始原料，經(jīng)硝化、還原和羧基化等一系列反應(yīng)得到(S)-可替寧半抗原，再通過DCC法將半抗原與BSA偶聯(lián)得到人工抗原；(S)-可替寧半抗原經(jīng)HPLC-MS結(jié)構(gòu)確認(rèn)，人工抗原經(jīng)紫外掃描和免疫學(xué)方法鑒定，結(jié)果表明目標(biāo)半抗原及人工抗原合成成功。通過本文的合成方法可以得到活性強(qiáng)、免疫性強(qiáng)的人工抗原。

可替寧；半抗原；人工抗原；化學(xué)合成；免疫檢測(cè)

(S)-可替寧，化學(xué)名為(S)-1-甲基-5-(3-吡啶基)-2-吡咯烷酮，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，(S)-可替寧并非煙草中的固有成分，是煙草中的尼古丁在人體內(nèi)進(jìn)行初級(jí)代謝后的主要產(chǎn)物。進(jìn)入人體內(nèi)的尼古丁約80%在肝臟代謝為(S)-可替寧，另一部分以尼古丁原型存在，尼古丁原型及(S)-可替寧可隨血液分布到人體各個(gè)部位。尼古丁在體內(nèi)的半衰期不到30 min，而(S)-可替寧的半衰期較長(zhǎng)為7～40 h[1]，因此(S)-可替寧比尼古丁對(duì)ETS(環(huán)境煙草煙霧)更具特異性；是目前公認(rèn)的評(píng)價(jià)ETS暴露的最佳生物標(biāo)志[2]。

圖1 (S)-可替寧結(jié)構(gòu)

(S)-可替寧檢測(cè)常用的方法有比色法、儀器法和免疫法。比色法是檢測(cè)(S)-可替寧最簡(jiǎn)單和最廉價(jià)的方法。但由于其檢出限高，不適合于ETS暴露較少人群的可替寧檢測(cè)[3]。儀器法包括HPLC、GC、GC-MS等方法，雖有較高的靈敏度和精密度，但對(duì)檢測(cè)樣品的前處理要求高，步驟較多，另外，儀器和設(shè)備本身的昂貴，使其難以推廣使用。免疫法中最常用的是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫膠體層析技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，需樣量少，靈敏度高，特異性強(qiáng)，能夠提供方便快捷的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[4-5]。

為建立(S)-可替寧的免疫檢測(cè)方法，必須將不具有免疫原性的(S)-可替寧小分子連接到生物大分子上形成具有免疫原性的人工抗原。本實(shí)驗(yàn)以(S)-可替寧為起始原料，經(jīng)硝化[6]、還原和羧基化等一系列反應(yīng)得到(S)-可替寧半抗原，再通過DCC法與BSA偶聯(lián)得到人工抗原，合成路線如圖2所示。

圖2 可替寧人工抗原合成路線

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Surveyor MSQ 型高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司；U3010紫外可見分光光度計(jì)，天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司；Bio-RAD 680酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂公司。(S)-可替寧(98%)，百靈威科技；可替寧抗體(10 mg/mL)，賽默飛世爾科技公司；可替寧對(duì)照抗原(10 mg/mL)，賽默飛世爾科技公司；其它試劑均為市售分析純。

1.2 抗原的合成

1.2.1 (S)-可替寧 N-氧化物Ⅱ合成

三口瓶中，1.76 g(S)-可替寧和5 mL冰乙酸加入，攪拌下，滴入1 mL 35%雙氧水，70 ℃保溫反應(yīng)5 h，加入5 mL無水乙醇，攪拌10 min，50 ℃減壓濃縮至無明顯液體流出，加入20 mL水，用飽和碳酸鉀溶液調(diào)成中性，分別用2×20 mL二氯甲烷萃取，有機(jī)層分別用20 mL飽和碳酸鉀溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥，50 ℃減壓濃縮至無明顯液體流出，得1.65 g白色固體化合物Ⅱ。

1.2.2 (S)-4-硝基可替寧 N-氧化物Ⅲ合成

三口瓶中，18 mL濃硫酸和18 mL發(fā)煙硝酸加入，再慢加入1.6 g化合物Ⅱ，回流5 h后，將反應(yīng)液慢倒入50 g冰水中，用飽和碳酸鉀溶液慢調(diào)中性，分別用2×50 mL二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，50 ℃減壓濃縮至無明顯液體流出，將濃縮物用二氯甲烷重結(jié)晶得0.82 g黃色固體化合物Ⅲ。

1.2.3 (S)-4-氨基可替寧Ⅳ合成

三口瓶中，0.80 g黃色固體化合物Ⅲ和10 mL冰乙酸加入，攪拌下，2 g鐵粉加入，回流5 h，熱濾，濾液加入10 mL水，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH為12～14，過濾除去紅色固體，濾液分別用2×30 mL二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，50 ℃減壓濃縮至無明顯液體流出，得0.48 g白色固體化合物Ⅳ。

1.2.4 (S)-可替寧半抗原Ⅴ合成

三口瓶中，0.45 g白色固體化合物Ⅳ、0.45 g丁二酸酐和5 mL吡啶加入，攪拌下，回流12 h，80 ℃減壓濃縮至無明顯液體流出，將濃縮物過柱得0.31 g白色固體化合物Ⅴ，即(S)-可替寧半抗原(展開劑：二氯甲烷：1,4-二氧六環(huán):95%乙醇:25%氨水=8:1:8：1，Rf=0.5)。

1.2.5 可替寧人工抗原Ⅵ合成

單口瓶中，0.30 g白色固體化合物Ⅴ和5 mL DMF加入，攪拌溶解，再加入0.22 g DCC和0.12 g NHS，密封下室溫下攪拌16 h，離心，取清液。攪拌下，將清液滴入到4 ℃的BSA溶液中(1.30 g溶于80 mL 0.01 mol/L的PBS中)，4 ℃反應(yīng)過夜，轉(zhuǎn)入透析袋中，在0.01 mol/L PBS(pH 7.4)溶液中透析3天，早中晚各換一次透析液。透析后的反應(yīng)液離心，取清液即為COT-BSA人工抗原Ⅵ?？商鎸幇豢乖铣煞椒ㄍ?將載體蛋白由BSA替換為BGG和活化后的半抗原偶聯(lián))。

1.3 結(jié)構(gòu)測(cè)試

1.3.1 (S)-可替寧半抗原的質(zhì)譜鑒定

將(S)-可替寧半抗原溶于甲醇，配制1 mmol/L的甲醇溶液，用ESI-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1.3.2 可替寧人工抗原紫外光譜測(cè)試

將(S)-可替寧半抗原、BSA和COT-BSA分別配成0.01 mg/mL、0.2 mg/mL和0.2 mg/mL的溶液，在200～400 nm分別掃描其紫外吸收，根據(jù)掃描圖譜進(jìn)行偶聯(lián)產(chǎn)物的鑒定。

1.3.3 (S)-可替寧人工抗原的活性測(cè)試

利用膠體金免疫層析法對(duì)可替寧人工抗原進(jìn)行檢測(cè)。用噴膜機(jī)以1.0 μg/cm的噴量，將人工抗原以3.0 mm的寬度噴在NC膜上，以可替寧抗體標(biāo)記膠體金，結(jié)合玻璃纖維紙及吸水紙，組裝成試紙條，對(duì)試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 可替寧免疫原性檢測(cè)

1.4.1 免疫方法

4只體重1 kg的新西蘭大白兔，觀察飼養(yǎng)一周后，各項(xiàng)生理指標(biāo)正常。取4 mg可替寧免疫抗原(COT-BSA)，加入用PBS稀釋到4 mL，加入等體積的弗氏完全佐劑混合乳化至滴一滴到水中不擴(kuò)散。初次免疫采取皮內(nèi)多點(diǎn)注射與肌肉注射，分別于第15 d、第29 d、第43 d、第57 d、第64 d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采用弗氏不完全佐劑，免疫抗原量保持不變。從第2次免疫開始，每次免疫7天后采少量血，分離血清用ELISA法測(cè)效價(jià)。

1.4.2 多抗血清效價(jià)檢測(cè)

以COT-BGG為包被抗原，用包被稀釋液稀釋成1 μg/mL，在酶標(biāo)上每孔包被100 μL，37 ℃孵育2 h；用酶標(biāo)洗滌液洗板3次后，每孔加入封閉液200 μL，37 ℃封閉1 h；洗板4次，每孔分別加入1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800 稀釋后的兔血清及空白對(duì)照PBS各100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板4次后加入稀釋后的酶標(biāo)二抗100 μL，37 ℃孵育30 min；洗板4次，加入100 μL底物顯色液，室溫顯色15 min后加入50 μL終止液終止顯色；用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度，吸收波長(zhǎng)為450 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 (S)-可替寧半抗原的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

(S)-可替寧半抗原的ESI-MS如圖3所示，該化合物的[M+H]+峰為292，與(S)-可替寧半抗原的分子量291相吻合，表明是本實(shí)驗(yàn)所合成的半抗原。

圖3 (S)-可替寧半抗原質(zhì)譜圖

2.2 可替寧人工抗原紫外光譜測(cè)試結(jié)果

(S)-COT半抗原、BSA和COT-BSA的紫外分光光度計(jì)的掃描結(jié)果如圖4所示。

圖4 (S)-COT hapten、BSA和COT-BSA的UV掃描圖

從圖4可以看出，(S)-COT半抗原在波長(zhǎng)237 nm和255 nm處各有一個(gè)最大吸收峰，BSA在214 nm和285 nm處各有一個(gè)最大吸收峰；而COT-BSA與(S)-COT半抗原和BSA有明顯不同，人工抗原的吸收峰在237 nm 處稍高于(S)-COT半抗原吸收值，在255 nm處明顯高于BSA吸收值，根據(jù)紫外吸收的加合性可初步認(rèn)為成功合成了人工抗原。

2.3 抗原活性分析

利用膠體金免疫層析法對(duì)本試驗(yàn)合成的抗原進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果如圖5所示。

陰性檢測(cè)：從左到右點(diǎn)膜樣品依次為COT-BSA(0.5 mg/mL)、

陽性檢測(cè)：從左到右待測(cè)樣品濃度依次為

從圖5可知，陰性檢測(cè)結(jié)果表明在點(diǎn)膜濃度相近的情況下，新合成的人工抗原與對(duì)照抗原檢測(cè)結(jié)果同相似，在檢測(cè)區(qū)T線位置均有很深的紫紅色且顏色深淺基本相同，證明合成的可替寧抗原活性與對(duì)照抗原活性相似，具有較高活性，能被抗體所識(shí)別并發(fā)生高效結(jié)合。陽性檢測(cè)結(jié)果表明能被400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品完全抑制，從200 ng/mL和600 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比證明可替寧標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)合成的可替寧抗原有競(jìng)爭(zhēng)性抑制，且有較好的梯度。

2.4 免疫過程血清效價(jià)變化結(jié)果

對(duì)用COT-BSA抗原免疫的四只兔子(分別標(biāo)記為兔1，兔2，兔3，兔4)免疫的各階段效價(jià)變化進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。

圖6 免疫期間血清效價(jià)變化

由圖6可看出，免疫期內(nèi)效價(jià)上升，四只兔在免疫期間效價(jià)變化整體趨勢(shì)一致。血清效價(jià)在第30 d(第三次免疫)后迅速上升，并且兔1、兔2、兔3和兔4均在第57 d(第五次免疫)價(jià)效上升達(dá)到最大值，幾天后效價(jià)基本不再上升，因此，取用COT-BSA抗原免疫兔血清，且應(yīng)在第五次免疫后血清效價(jià)達(dá)到最高時(shí)采血(第五次免疫后一周)，后期免疫效果基本不變。其中四只兔中兔2效價(jià)最高，免疫效果最好。

2.5 抗可替寧血清效價(jià)測(cè)定

以包被抗原常規(guī)的工作濃度1 μg/mL包被酶標(biāo)板，二抗酶標(biāo)記物稀釋倍數(shù)1:2000，用間接ELISA法測(cè)定第五次免疫后的血清在450 nm測(cè)定的OD值，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 第五次免疫后的血清的OD值

結(jié)果表明四只免疫兔子的兔血清效價(jià)均達(dá)到1:100000以上，表明均已產(chǎn)生很好的免疫效果，其中兔2效價(jià)最高能達(dá)到1:20萬以上。說明該抗原具有很高的免疫原性。

3 結(jié) 論

本文可替寧半抗原的合成所選擇的接入位點(diǎn)在吡啶環(huán)上，最大限度的保留了可替寧的結(jié)構(gòu)，引入了一個(gè)氨基，并且用丁二酸酐延長(zhǎng)了偶聯(lián)臂，避免了可替寧半抗原與載體蛋白偶聯(lián)時(shí)距離太近而被大分子蛋白包裹半抗原上的抗原決定簇；通過本文的合成方法能得到活性強(qiáng)、免疫性強(qiáng)的人工合成抗原，為下一步抗體的制備提供方便。

[1] John A Walling,Hsiang Yun Hu,Barbara EHasz.Haptens.tracers,immunogens and antibodies for immunoassays for cotinine derivatives[P].US5164504.

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Synthesis of A Novel Artificial Antigen of Cotinine

ZENGFan-rong1,ZHENGZhi-biao2,ZHENGShu-jian2,LIAOZhu-yuan1,FANWei-yong1

(1 Jiangxi Qingfeng Pharmaceutical Co., Ltd., Jiangxi Ganzhou 341000; 2 Hangzhou Clongene Biotech Co., Ltd., Zhejiang Hangzhou 311121, China)

To synthesize and identify the hapten and artificial antigen of cotinine, the hapten of (S)-cotinine was synthesized from (S)-cotinine through a series of reactions including nitration, reduction and carboxylation, etc. The (S)-cotinine hapten was coupled with BSA by means of DCC method. The structure of (S)-cotinine hapten was confirmed by HPLC-MS.The artificial antigen of cotinine was identified by UV spectroscopy and immunological analysis. The results indicated that the hapten and artificial antigens were prepared successfully. High activity and strong immunogenicity artificial antigen of cotinine can be obtained through the synthesis method.

cotinine; hapten; artificial antigen; chemical synthesis; immunoassay

曾繁榮，男，碩士研究生，主要從事藥物合成和應(yīng)用。

鄭智彪，男，生物技術(shù)本科生，主要從事抗原合成與檢測(cè)。

R285.5

A

1001-9677(2016)022-0053-04