薛玉芹，方　強(qiáng)

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結(jié)核病DNA疫苗研究進(jìn)展

薛玉芹，方強(qiáng)

[關(guān)鍵詞]結(jié)核??；DNA疫苗；綜述

結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mtb)引起的以呼吸道為主的一種傳染性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人類對(duì)抗TB已取得了一定的成果，包括有效的治療藥物及疫苗的研發(fā)。但同時(shí)由于Mtb耐藥的嚴(yán)重性、人類免疫缺陷性病毒(HIV)與Mtb的雙重感染及流動(dòng)人口的日益增多、吸毒等，加上不少國(guó)家對(duì)TB的忽視，TB在全球范圍內(nèi)呈回升趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2012年全球結(jié)核病控制報(bào)告》[1]指出，雖然目前死于TB的人和患病的人都呈下降趨勢(shì)，但每年仍有數(shù)百萬TB新發(fā)病例，2011年全球新增TB患者870萬人，死于TB的人數(shù)為140萬人，其中新增TB患者中有3.7%患有耐多藥TB，全球TB負(fù)擔(dān)仍然十分嚴(yán)重。

至今，卡介苗(BCG)仍是被批準(zhǔn)使用的預(yù)防TB的唯一疫苗，其保護(hù)力不穩(wěn)定，差異大，究其原因可能受BCG菌株差異、感染Mtb菌株的差異性、Mtb的內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染以及接種人群和臨床試驗(yàn)方法的差異性等的影響[2]。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，新型的TB疫苗已得到廣泛研究，如活疫苗、亞單位疫苗(DNA疫苗、重組蛋白疫苗等)和滅活疫苗等，其中DNA疫苗以其安全、經(jīng)濟(jì)、有效等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來TB疫苗研究的熱點(diǎn)之一，本文就TB DNA疫苗的研究進(jìn)展作一綜述。

1DNA疫苗的概念及免疫機(jī)制

1.1DNA疫苗的概念DNA疫苗是指把能引起機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原編碼的外源基因和真核表達(dá)載體連接，通過某種方法導(dǎo)入機(jī)體，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯合成抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)該抗原的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，以達(dá)到預(yù)防和/或治療疾病的目的。WOLFF等[3]研究發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼肌細(xì)胞能捕獲不加任何處理的外源基因并在一定時(shí)間內(nèi)表達(dá)，并能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞與體液免疫反應(yīng)，從而開辟了核酸疫苗學(xué)的新天地。DNA疫苗按其應(yīng)用目的可分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。

1.2DNA疫苗的免疫機(jī)制目前認(rèn)為，TB DNA疫苗被直接導(dǎo)入宿主體內(nèi)后，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Mtb蛋白抗原，加工形成多肽抗原，與宿主細(xì)胞MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子結(jié)合，遞呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng)，引起特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，特別是細(xì)胞毒體細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。組織細(xì)胞攝入質(zhì)粒DNA后，在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯成抗原蛋白分子。一部分內(nèi)源性抗原蛋白結(jié)合到泛肽上，被蛋白酶降解為多肽，通過肽轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，形成多肽-MHC-Ⅰ類分子聚合物，最后到達(dá)細(xì)胞膜表面，借助TCR受體被CD8+細(xì)胞識(shí)別，誘發(fā)CD8+CTL T細(xì)胞應(yīng)答；同時(shí)，部分抗原從抗原提呈細(xì)胞(APC)的細(xì)胞膜進(jìn)入，通過MHC-Ⅱ遞呈途徑，被APC溶酶體降解為多肽，最后形成成熟的MHC異聚體，在細(xì)胞膜表面，被CD4+T細(xì)胞識(shí)別，引起細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。其中，還有一部分抗原多肽遞呈給B細(xì)胞，激活B細(xì)胞，部分轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體，引發(fā)體液免疫[4-6]。

2TB DNA疫苗的種類

2.1TB預(yù)防性DNA疫苗疫苗的最初目的是為了預(yù)防疾病的發(fā)生，DNA疫苗也是如此。TB DNA疫苗的研究目的也是由于BCG保護(hù)力不穩(wěn)定，而作為第二代疫苗的重組蛋白亞單位疫苗誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較弱，對(duì)TB的預(yù)防并不理想，需要研發(fā)能夠全面誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫的新型疫苗來預(yù)防TB的發(fā)生。近年來，隨著對(duì)結(jié)核菌致病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，預(yù)防性DNA疫苗的研制目標(biāo)不僅限于針對(duì)正常人群抗結(jié)核桿菌感染的預(yù)防，更重要的是要研發(fā)針對(duì)潛伏期感染的疫苗，達(dá)到抑制、清除潛伏感染的細(xì)菌，防止TB復(fù)發(fā)也是其重要的目標(biāo)[7]。目前，已有多種TB預(yù)防性DNA疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了較理想的效果。

2.2TB治療性DNA疫苗由于化療藥的不良反應(yīng)和耐多藥結(jié)核菌株的流行等，TB的免疫治療引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。治療性疫苗是指接種于已感染病原體的個(gè)體，發(fā)揮主動(dòng)免疫，成為近年來控制傳染性疾病的新方向[8]。 TB治療性疫苗的目的是誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，殺死細(xì)胞內(nèi)寄生的Mtb，DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)生成內(nèi)生性抗原，不僅能誘導(dǎo)體液免疫和TH1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，還能誘導(dǎo)特異性的CTL應(yīng)答，能將低效的抑菌反應(yīng)轉(zhuǎn)換成高效的殺菌作用。日本科學(xué)家[9]將白細(xì)胞介素(IL)-6相關(guān)基因連接到腺病毒載體，構(gòu)建IL-6相關(guān)DNA疫苗，采用該疫苗治療小鼠后，發(fā)現(xiàn)其肺部Mtb數(shù)目明顯低于BCG東京株，且能激發(fā)CTL活性，具有顯著的治療效果。目前在TB疫苗研制中備受關(guān)注的Ag85分泌性抗原，梁艷等[10-11]證明Ag85A、Ag85A/ESAT6嵌合型DNA疫苗與藥物聯(lián)合使用能顯著提高藥物對(duì)耐藥Mtb感染的治療效果。其中，Mtb早期表達(dá)的蛋白，適應(yīng)宿主體內(nèi)的免疫環(huán)境，成為免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)蛋白，因此在潛伏感染期首次表達(dá)的蛋白(休眠期蛋白)是治療性疫苗表達(dá)的重要抗原，但目前研究甚少，主要包括休眠相關(guān)基因熱休克蛋白(HSP)X、休眠相關(guān)蛋白(Dormancy-related，DosR)等。有研究[12-13]證明，HSP65與IL-12編碼基因融合表達(dá)構(gòu)建的DNA疫苗，在治療TB小鼠的實(shí)驗(yàn)中，能顯著提高TH1細(xì)胞免疫反應(yīng)，減少M(fèi)tb的數(shù)目。

3結(jié)核DNA疫苗研究的主要疫苗候選基因

3.1DosR編碼基因DosR是由Rv3407基因編碼，是Mtb從潛伏期轉(zhuǎn)化到再活化狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生的特異性蛋白，對(duì)潛伏期人群有明顯的保護(hù)作用[14]，是治療性疫苗的重要抗原。有研究[15-17]發(fā)現(xiàn)，Rv3407能誘導(dǎo)Mtb潛伏期的特異性記憶T細(xì)胞分泌干擾素(IFN)，構(gòu)建的 PVAX1-Rv3407 DNA 疫苗，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)蛋白抗原，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，對(duì)Mtb的潛伏期感染狀態(tài)，產(chǎn)生高效的T細(xì)胞免疫。研究[18]報(bào)道，Mtb休眠期抗原Rv2660c和Ag85B、ESAT6融合制備的疫苗具備有效預(yù)防潛伏期感染結(jié)核菌的復(fù)活。

3.2HSP編碼基因HSP又稱“分子伴侶”，屬于胞質(zhì)蛋白，是被免疫系統(tǒng)識(shí)別的重要抗原，其編碼基因是研究最早的DNA疫苗候選分子之一，近年來被用來研究DNA疫苗的主要是HSP65、HSP70編碼基因。二者質(zhì)粒DNA疫苗既可用作預(yù)防性疫苗又可作為治療性疫苗。ANDEREN等[19-20]構(gòu)建了HSP65與人IL-2融合基因的DNA疫苗，研究發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-2和特異性的IgG2a抗體，在用于治療TB小鼠模型時(shí)，能明顯降低Mtb的數(shù)目，提高TH1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。胡方靖等[21]構(gòu)建pIHsp65GM真核表達(dá)質(zhì)粒并研究其DNA疫苗的免疫原性和對(duì)感染Mtb小鼠的免疫保護(hù)效果，研究表明，pIHsp65GM DNA疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的IgG，脾淋巴細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ，且脾、肺載菌量均低于對(duì)照組。HSP70具有基因佐劑作用，有多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，免疫原性比Hsp65更強(qiáng)，可誘發(fā)特異性Th1反應(yīng)。LOWRIE等[22]研究發(fā)現(xiàn)，用HSP-70 DNA疫苗治療感染Mtb的小鼠，其HSP-70DNA疫苗可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生和特異性的CTL活性，小鼠脾、肺菌落數(shù)顯著低于對(duì)照組。史小玲等[23]把Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗接種于用H37Rv強(qiáng)毒株攻擊后的小鼠，研究表明該疫苗具有良好的免疫治療作用。

3.3Ag85復(fù)合物編碼基因Ag85復(fù)合物是Mtb和BCG主要的分泌性蛋白，由Ag85A、Ag85B、Ag85C三個(gè)組分構(gòu)成。在Ag85編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗中，Ag85A和Ag85B效果為佳，Ag85C基因重組的DNA疫苗效果不及Ag85A和Ag85B[24]。Ag85A和Ag85B含有數(shù)個(gè)T細(xì)胞抗原決定簇，可誘導(dǎo)感染鼠產(chǎn)生Ⅳ型超敏反應(yīng)(DTH)和保護(hù)性免疫。HA等[25]將Ag85A DNA疫苗及IL-12用于感染TB小鼠的治療，發(fā)現(xiàn)該疫苗和藥物聯(lián)合治療能顯著減少小鼠TB的復(fù)發(fā)。此外，國(guó)內(nèi)研制的Ag85A DNA疫苗，正在進(jìn)行中試工藝研究中[26]。

3.4MPT64編碼基因MPT64編碼基因位于RD2區(qū)，在某些BCG菌株缺失，編碼的分泌性MPT64蛋白是重要的T細(xì)胞抗原和B細(xì)胞抗原，能誘導(dǎo)Mtb感染的豚鼠發(fā)生很強(qiáng)的DTH反應(yīng)。KAMATH等[27]首次將MTP64 DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射免疫小鼠，在間隔免疫過程中血清特異性抗體滴度逐漸升高，可誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和特異性的CTL活性。梁艷等[11,28]比較Mtb MPT64、ESAT6、Ag85A和Ag85B 4種DNA疫苗的免疫原性發(fā)現(xiàn)，4組DNA疫苗肌內(nèi)注射后均可在體內(nèi)表達(dá)，MPT64DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體水平最高。但與IL-12或IFN-γ質(zhì)粒DNA同時(shí)免疫時(shí)，抗體水平無明顯增加，證明MPT64DNA疫苗與細(xì)胞因子共刺激后，細(xì)胞因子可降低小鼠對(duì)其疫苗的抗原特異性抗體反應(yīng)，而轉(zhuǎn)為以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主。

3.5PstS編碼基因Mtb磷酸鹽特異轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(phosphate-specific transport system，PstS)包括3個(gè)磷酸鹽結(jié)合蛋白,分別稱為PstS-1(也稱為蛋白抗原b)、PstS-2、PstS-3，PstS 基因所構(gòu)建的DAN疫苗免疫小鼠后可產(chǎn)生特異性的抗體和誘導(dǎo)TH1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生IL-12及IFN-γ等，其中PstS-1 DNA疫苗免疫不能激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，PstS-3 DNA免疫可產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答，接受H37Rv強(qiáng)毒株攻擊后，脾、肺菌數(shù)量明顯減少，PstS-2 DNA免疫產(chǎn)生的免疫水平介于中間[29]。

3.6RD1區(qū)優(yōu)勢(shì)抗原ESAT6、CFP10編碼基因BCG缺失的RD1區(qū)，僅存在于致病性分枝桿菌和一些非典型分枝桿菌。RD1區(qū)同一操縱子的ORFs Rv3875和Rv3874分別編碼的ESAT6和CFP10，是RD1區(qū)核心抗原，可誘導(dǎo)T細(xì)胞，PBMC、NK及TB患者PBMCs產(chǎn)生強(qiáng)烈的IFN-γ[30]，具有良好的抗原性，而全部BCG都缺失這兩種蛋白，使其成為當(dāng)今TB疫苗研制的熱點(diǎn)候選分子。有研究[31-32]表明，ESAT6和CFP10可使感染Mtb的小鼠體內(nèi)記憶效應(yīng)T細(xì)胞增殖及在感染早期即可產(chǎn)生高水平的IFN-γ。張海等[33]構(gòu)建的Mtb ESAT6-CFP10融合DNA疫苗免疫小鼠后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的IFN-γ與對(duì)照組BCG相比無明顯差異，可產(chǎn)生較好的免疫效果。WANG等[34]將泛素和ESAT6基因融合，研究發(fā)現(xiàn)，該DNA疫苗顯著增加了細(xì)胞免疫應(yīng)答，提供了較好的保護(hù)作用。

4提高TB DNA疫苗免疫效力的策略

眾多研究表明，TB DNA疫苗免疫效力不高，單一Mtb抗原的DNA疫苗的保護(hù)效果一般不及BCG，嚴(yán)重制約著DNA疫苗的發(fā)展。增強(qiáng)DNA保護(hù)效應(yīng)的方法除了選擇更為有效的保護(hù)性抗原和多種抗原聯(lián)合免疫或采用Prime-Boost免疫策略[35](即初次用DNA疫苗免疫，再次用BCG、抗原蛋白或抗結(jié)核藥物加強(qiáng)免疫)等方法外，表達(dá)載體與佐劑的選擇以及免疫途徑也至關(guān)重要。

4.1DNA疫苗載體的選擇及優(yōu)化自TB DNA疫苗研究以來，質(zhì)粒作為其研究載體仍然占重要地位。人們通過優(yōu)先選擇具備基因特異性的強(qiáng)啟動(dòng)子、功能性剪接體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子、特異有效的非甲基化CpG序列以及影響真核生物表達(dá)的Kozak序列等的質(zhì)粒[36-39],構(gòu)建優(yōu)化質(zhì)粒載體的DNA疫苗。近年來，隨著載體應(yīng)用研究的深入，病毒載體以其可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)目的基因的優(yōu)勢(shì)，成為DNA疫苗表達(dá)載體研究的熱點(diǎn)。最新研究[40-41]報(bào)道的一種ESAT6新型DNA疫苗，可表達(dá)ESAT6T細(xì)胞表位的減毒流感病毒A/New Caledonia/20/99株活疫苗可誘導(dǎo)ESAT6的高水平的抗血清抗體滴度，表明病毒樣顆粒作為展示表位載體的有效性和可操作性。目前，病毒性載體的研究主要以腺病毒和痘病毒為主。

慢病毒載體具備能感染分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞，攜帶的外源基因表達(dá)水平高，容納外源目的基因的片段大等優(yōu)點(diǎn)。其中腺病毒具有強(qiáng)有力的免疫原性和佐劑作用，可誘發(fā)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)[42]和特異性的記憶免疫反應(yīng)，有研究者[43]認(rèn)為第5型腺病毒用于結(jié)核疫苗的研究具有廣泛性,但5型腺病毒在人群中有高度流行性，感染后的人體易產(chǎn)生中和抗體，削弱流行區(qū)的疫苗效率，而35型是非流行株，用途較為廣泛；痘病毒具有接種一次，就能獲得長(zhǎng)期免疫效果的優(yōu)點(diǎn)。目前，已有眾多實(shí)驗(yàn)研究表明用該兩種病毒載體構(gòu)建的TB DNA疫苗的優(yōu)勢(shì)性和有效性，如ESAT6的重組腺病毒DNA疫苗，用于感染小鼠的免疫治療，發(fā)現(xiàn)其肺部的細(xì)菌數(shù)和病灶的炎癥反應(yīng)程度減少[44]；以痘病毒為載體的重組Ag85A DNA疫苗目前已進(jìn)入臨床二期試驗(yàn)[45]。

此外，病原體與感染宿主在密碼子使用偏嗜性方面的差異可能導(dǎo)致外源性蛋白表達(dá)偏低，從而導(dǎo)致DNA疫苗的誘發(fā)免疫效應(yīng)偏低，這已成為DNA疫苗發(fā)展的重要瓶頸之一。隨著生物技術(shù)手段的發(fā)展，密碼子優(yōu)化技術(shù)為研制有效的TB DNA疫苗提供了新思路。密碼子優(yōu)化是指在不改變所編碼蛋白的氨基酸序列的前提下，利用序列定點(diǎn)突變或全基因合成的方法，改變保護(hù)性抗原基因的稀有密碼子，使之更適合在真核宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)，刺激宿主產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答和保護(hù)力。在TB疫苗研究中，LAKEY等[46]將Mtb85A、85B及超氧化物歧化酶(SOD)在大腸埃希菌中使用率低的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)85B蛋白表達(dá)量增加約54倍，85A和SOD蛋白表達(dá)量提高4～6倍。KO等[47]對(duì)MtbAg85B抗原基因優(yōu)化，構(gòu)建人源化的Ag85BDNA疫苗，體內(nèi)外試驗(yàn)均提示，優(yōu)化后的Ag85B蛋白表達(dá)量顯著提高，且優(yōu)化后hAg85BDNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的Th1和CTL免疫反應(yīng)應(yīng)答，產(chǎn)生更好的保護(hù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室將CFP10和ESAT6基因進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建CFP10/PVAX1和ESAT6/PVAX1重組DNA疫苗，通過與優(yōu)化前比較，觀察其免疫效應(yīng)及保護(hù)力是否有所提高。這將是一個(gè)有意義的嘗試，目前該研究正在進(jìn)行之中。

4.2免疫佐劑TB DNA疫苗的使用可以不聯(lián)合佐劑，但合適的佐劑在某種程度上可解決其免疫原性低的問題，提高其免疫效應(yīng)和保護(hù)力，減少疫苗的免疫劑量和免疫次數(shù)。佐劑從最初的鋁鹽佐劑、弗氏佐劑，到各種新型佐劑已取得了迅速的發(fā)展，目前臨床上批準(zhǔn)用于人體的佐劑主要是鋁佐劑和MF59兩種。其次，細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-18等可促進(jìn)TH1反應(yīng)，在TB DNA疫苗的發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。SHI等[48]將Hsp65基因與人IL-2融合構(gòu)建DNA疫苗，研究顯示對(duì)感染Mtb的小鼠具有很好的保護(hù)效果。李暉等[49]將Mtb8.4/hIL-12嵌合DNA疫苗免疫小鼠，與BCG和Mtb8.4疫苗相比免疫作用增強(qiáng)。結(jié)核菌DNA中未甲基化的CpG序列一方面可誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖分化，同時(shí)還可激活T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子，誘發(fā)以TH1為主的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

此外，泛素、單磷酰脂(MLA)、IC31以及一些新型的復(fù)合佐劑如CAF01、TBD等可誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效應(yīng)[50-53]。目前作為免疫佐劑熱門研究領(lǐng)域的Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑，可介導(dǎo)即時(shí)的非特異性的抗病原體反應(yīng)，并能通過相應(yīng)的信號(hào)通路和免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng)，發(fā)揮佐劑作用，在疫苗研究中已有所研究[54-55]。隨著納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的發(fā)展，納米材料以其具有易于加工修飾、促進(jìn)功能分子入胞、保護(hù)DNA和蛋白質(zhì)等降解，延長(zhǎng)在血液的循環(huán)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，作為載體或佐劑在增強(qiáng)抗原免疫原性方面具有巨大的潛力，目前已有相關(guān)納米粒子作為佐劑在DNA疫苗中的一些研究[56-59]。

4.3免疫途徑DNA疫苗的免疫途徑有多種，不同的免疫途徑可影響抗原的吸收和表達(dá)，誘導(dǎo)的免疫強(qiáng)度和免疫機(jī)制也不同[60]。早期DNA疫苗采用的常規(guī)肌內(nèi)注射法，其骨骼肌細(xì)胞攝取DNA后，可長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá)，且肌肉接種誘發(fā)的免疫以TH1型為主，激活CTL、TH1細(xì)胞及產(chǎn)生IgG2a為主的B細(xì)胞[61]，但質(zhì)粒DNA注射后，由于肌束膜的影響，僅有1%～2%的肌纖維被轉(zhuǎn)染，大部分DNA未能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，只留在細(xì)胞間隙被降解，攝取量極低。所以，有研究者通過肌內(nèi)注射聯(lián)合體內(nèi)電轉(zhuǎn)染技術(shù)來提高質(zhì)粒DNA的攝取量，增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(又稱體內(nèi)電穿孔、電轉(zhuǎn)化、電脈沖)是通過脈沖電流增加靶細(xì)胞的滲透性，使DNA易透過細(xì)胞膜，而不損害靶細(xì)胞，解決質(zhì)粒DNA在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低的問題。有研究[62]將質(zhì)粒DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射后立即施加方型波電脈沖，發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)注射10 μg DNA疫苗加電轉(zhuǎn)染，能誘導(dǎo)出與不加電轉(zhuǎn)染接種100 μg DNA疫苗相似或更強(qiáng)的抗體免疫應(yīng)答，表明使用電轉(zhuǎn)染技術(shù)可減少DNA疫苗的劑量和成本。

此外，新的免疫途徑如基因槍法、黏膜免疫途徑法、口服納米乳或微針陣列經(jīng)皮免疫途徑等目前處于大量試驗(yàn)階段，對(duì)未來DNA疫苗的發(fā)展具有巨大的潛力。

5結(jié)語

TB DNA疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的新型疫苗，近年來已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展，其可作為預(yù)防性疫苗，也可作為治療性疫苗，被認(rèn)為在TB防治中占有很大的優(yōu)勢(shì)。但同時(shí)也存在著一些問題：一是目前TB DNA疫苗的研究主要局限于小鼠和豚鼠模型，很少用靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，所以要想在臨床試驗(yàn)中取得突破，還有很長(zhǎng)的一段路要走；二是疫苗的安全問題，疫苗應(yīng)用中不良反應(yīng)的報(bào)道越來越多，主要包括免疫抑制、超敏反應(yīng)及自身免疫等。因此，在日后的DNA疫苗研究進(jìn)程中，我們要繼續(xù)探求合適的保護(hù)抗原和載體，摸索最適宜的免疫策略、途徑以及免疫劑量，充分利用佐劑的作用，將研發(fā)的新型疫苗免疫多種動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究其保護(hù)性免疫機(jī)制，建立有效的體內(nèi)和體外疫苗評(píng)價(jià)模型，同時(shí)建立量化的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)[63]。我們相信，隨著DNA疫苗的免疫學(xué)機(jī)制和免疫策略的深入研究，人類定能克服困難，逐個(gè)攻破難題，研制出安全有效、經(jīng)濟(jì)合理的DNA疫苗用于TB的預(yù)防和治療。

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(本文編輯姚仁斌)

[文章編號(hào)]1000-2200(2016)03-0408-06·綜述·

[收稿日期]2013-12-25

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30600518/C030112)

[作者簡(jiǎn)介]薛玉芹(1985-)，女，碩士研究生.[通信作者] 方強(qiáng)，博士，碩士研究生導(dǎo)師，教授.E-mail：fq333@sohu.com

[中圖法分類號(hào)]R 378.91

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.043

[作者單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室，感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蚌埠 233030