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循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)及其在肺癌中的臨床應(yīng)用價(jià)值

劉帥(綜述)張慶廣(審校)

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科濱州256603

【關(guān)鍵詞】肺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；檢測(cè)；臨床價(jià)值

肺癌是目前我國(guó)發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤，其中約40%的初治患者存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，超過90%的患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為肺癌治療失敗及患者死亡的主要原因[2]。因此，探尋能夠早期診斷并能預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的檢測(cè)方法對(duì)于提高肺癌患者生存率至關(guān)重要。本文將對(duì)于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)的分離檢測(cè)方法,以及在肺癌臨床診治中的意義進(jìn)行系統(tǒng)闡述。

1CTCs的檢測(cè)

CTCs在外周血中非常稀少，通常需要從上億白細(xì)胞及上百億紅細(xì)胞中尋找數(shù)個(gè)腫瘤細(xì)胞，而且可以應(yīng)用的標(biāo)本是非常有限的，因此尋求合適的分離檢測(cè)方法至關(guān)重要。理想的分離檢測(cè)方法應(yīng)該具備高靈敏度、高純度(分離富集純度高)、高細(xì)胞活性(允許進(jìn)一步的細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及培養(yǎng))、經(jīng)濟(jì)易操作(便于臨床普及應(yīng)用)等優(yōu)點(diǎn)。

一般來說，CTCs檢測(cè)主要由兩個(gè)步驟組成：一是富集分離；二是檢測(cè)。目前，CTCs富集方法按照原理主要分為非特異性富集方法和特異性富集方法。非特異性富集方法是根據(jù)CTCs的物理性質(zhì)(大小、密度、電荷等)，來加以區(qū)分它們和周圍正常血細(xì)胞。目前實(shí)驗(yàn)室最常用的此類分離方法為密度梯度離心法，也稱為區(qū)帶離心法。該方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，設(shè)備要求不高，而且保存了細(xì)胞的活性，但其缺乏特異性，純度較低，易受單核細(xì)胞的影響。在此基礎(chǔ)上建立的OncoQuick，增加了內(nèi)置的多孔屏障，可以有效的避免離心前標(biāo)本與分離液混合污染，因此，其對(duì)于腫瘤細(xì)胞的平均回收率較傳統(tǒng)分離法更高，但在富集過程仍會(huì)有少量腫瘤細(xì)胞的丟失。另外一種常用的非特異性富集方法為膜過濾法(the isolation by size of epithelial tumor cells, ISET)。此法在2000年由Vona等首先提出，其原理為根據(jù)腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞大小不同來將兩者分離，由該法所得到的腫瘤細(xì)胞形態(tài)保持完整，不影響細(xì)胞的特性，為后續(xù)的一些相關(guān)檢查提供了良好的基礎(chǔ)。此外，有學(xué)者用多種不同孔徑的濾過膜進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用8 μm大小孔徑過濾膜分離的CTCs效果最佳，但這也意味著ISTE只能分離直徑大于8 μm的腫瘤細(xì)胞，因此使其分離的靈敏度受到質(zhì)疑。

以往，常依靠PCR技術(shù)檢測(cè)血液中的DNA或RNA序列，基于腫瘤細(xì)胞及血細(xì)胞的基因表達(dá)不同，檢測(cè)CTCs。但因腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，使其具有很大的局限性，而且此法易受到干擾，產(chǎn)生假陽性，同時(shí)PCR技術(shù)亦無法做到CTCs的精確計(jì)數(shù)及任何形態(tài)學(xué)的檢測(cè)。近年來，利用細(xì)胞角蛋白(cytokeratins，CKs)、上皮細(xì)胞黏附(epithelial cellular adhesion molecule， EpCAM)等細(xì)胞表面分子標(biāo)記物的抗體捕獲CTCs成為應(yīng)用最廣泛的方法。例如Cell Search系統(tǒng)，通過結(jié)合抗EpCAM的磁珠及免疫熒光的CK抗體、CD45抗體對(duì)CTCs進(jìn)行富集分選，并用DAPI對(duì)分選出的CTCs進(jìn)行染色，然后即可自動(dòng)對(duì)捕獲細(xì)胞進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)和分析。該系統(tǒng)集合免疫磁珠分選技術(shù)及免疫組化染色，將細(xì)胞的富集、染色、分析相結(jié)合，是目前自動(dòng)化程度最高的CTCs檢測(cè)技術(shù)，具有較高的特異性、敏感性，目前已被應(yīng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌及肺癌等研究中[3]，但肺癌尚未批準(zhǔn)在臨床中大量運(yùn)用此法。此外，CTCs芯片技術(shù)同樣是基于免疫學(xué)原理，該法通過抗EpCAM抗體捕獲血液樣本中的CTCs，達(dá)到富集效果。該方法被證有捕獲大量CTCs的能力，且具有極高的特異性、敏感性及可重復(fù)性，為CTCs檢測(cè)提供了一條嶄新的思路[4]。

2CTCs在肺癌中的臨床應(yīng)用

2.1CTCs與肺癌的早期診斷目前肺癌的早期診斷主要依靠外周血中的腫瘤標(biāo)記物及影像學(xué)檢查，但腫瘤標(biāo)記物的敏感度及特異度較低，影像學(xué)檢查在確定腫瘤性質(zhì)上存在一定的局限性。肺癌的早期診斷成為了影響患者預(yù)后的重要影響因素，同時(shí)依靠準(zhǔn)確的診斷早期治療是目前提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。

早在1998年Yoshida 等[5]對(duì)CTCs在早期肺癌診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了研究,認(rèn)為外周血中CTCs的檢測(cè)對(duì)肺癌早期的進(jìn)展具有重要的預(yù)測(cè)意義，目前越來越多的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。Tanaka等[6]檢測(cè)115例肺癌患者外周血中的CTCs，其中小細(xì)胞肺癌9例，非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)116例，分析發(fā)現(xiàn)CTCs水平與腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，檢測(cè)出CTCs數(shù)目為≥1的敏感度及特異度分別為71.0%和83.0%，認(rèn)為CTCs可以作為肺癌的一種早期診斷及檢測(cè)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物。同年Wu等[7]對(duì)47例肺癌患者進(jìn)行研究，結(jié)果均檢測(cè)出不同水平的CTCs，而正常對(duì)照組的血中沒有發(fā)現(xiàn)CTCs，進(jìn)一步證實(shí)了CTCs對(duì)于肺癌早期診斷具有一定的指導(dǎo)意義， 在肺癌高?；颊叩暮Y選檢查方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.2CTCs與肺癌的分期肺癌的分期在肺癌的診治過程中扮演著非常重要的角色，它能夠反映病灶的范圍、病變程度及預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療思路。近年來，許多相關(guān)研究報(bào)道指出[8-9]，NSCLC患者隨著TNM分期的增高，CTCs數(shù)目也有增加趨勢(shì)，提示其與肺癌的臨床分期存在關(guān)聯(lián)性。2012年國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究同樣證實(shí)了該結(jié)論[10]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)肺腺癌中的CTCs數(shù)目較鱗癌高，可能與腺癌更易發(fā)生血液轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Beulaville等[11]在無臨床癥狀和轉(zhuǎn)移灶的肺癌患者體內(nèi)也檢測(cè)到了CTCs，這些早期肺癌若按照TNM分期進(jìn)行常規(guī)的治療可能會(huì)造成治療強(qiáng)度不夠，延誤病情影響治療效果，提示目前肺癌的TNM分期存在一定的局限性。隨著CTCs檢測(cè)方法可行性及可靠性的提高，CTCs計(jì)數(shù)有望作為肺癌臨床分期的參考，有助于改善腫瘤分期，利于采取更積極的治療。

2.3CTCs與肺癌個(gè)體化治療個(gè)體化治療顧名思義是根據(jù)患者的自身情況，來權(quán)衡治療后的療效及副作用，制定最佳治療方案。肺癌的治療已經(jīng)進(jìn)入了分子靶向治療的時(shí)代，同時(shí)對(duì)發(fā)現(xiàn)更多驅(qū)動(dòng)基因及治療靶點(diǎn)的檢測(cè)手段提出了新的挑戰(zhàn)。

CTCs的分子及遺傳特性，可以作為原發(fā)腫瘤的一種“液體活檢”，CTCs已經(jīng)分別在乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌的檢測(cè)中證明了HER2，KRAS和EGF的突變狀態(tài)[12]。Maheswaran 等[13]利用微流控芯片技術(shù)從27名轉(zhuǎn)移性NSCLC患者外周血中分離收集高純度的CTCs，并通過PCR技術(shù)進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)，指出血液中CTCs分子分析為肺癌患者治療期間監(jiān)測(cè)上皮腫瘤基因改變提供了可能性。在肺癌患者的治療過程中，若發(fā)現(xiàn)早期肺癌肺靜脈血中存在CTCs，術(shù)后則需要考慮采取化療、靶向等綜合治療；對(duì)于晚期肺癌，在化療前后及化療期間行CTCs檢測(cè)，不僅有利于了解腫瘤進(jìn)展及評(píng)估療效，還有助于敏感化療藥物的篩選及應(yīng)用，從而提高患者長(zhǎng)期生存率。

2.4CTCs與肺癌的預(yù)后判斷外周血中的CTCs被視為影響惡性腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因之一。原發(fā)腫瘤在早期生長(zhǎng)過程中即有微小的個(gè)體或集團(tuán)通過循環(huán)系統(tǒng)播散或轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官，如種子播撒在土壤中一般，并表明這種“腫瘤種子”即CTCs就是影響惡性腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。

劉春花等[14]利用免疫磁珠聯(lián)合免疫化學(xué)染色法對(duì)65例肺癌患者、10例肺良性疾病患者及10例健康志愿者外周血進(jìn)行檢測(cè)，研究指出， CTCs陽性率與患者的臨床分期、M分期及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并指出CTCs計(jì)數(shù)與Cyfra-211值及LDH值呈正相關(guān)。Hou等[15]對(duì)接受化療的97例小細(xì)胞肺癌患者的CTCs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CTCs計(jì)數(shù)與無進(jìn)展生存期(PFS)、總生存期(OS)均具有負(fù)相關(guān)性，多因素分析結(jié)果亦顯示，CTCs計(jì)數(shù)可作為PFS及OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，提示CTCs可作為一種替代的腫瘤標(biāo)志物及“虛擬”活檢，來預(yù)測(cè)肺癌患者預(yù)后。

3總結(jié)與展望

在過去的幾十年里，肺癌患者的管理方法已經(jīng)發(fā)生了重大的改變?；趯?duì)腫瘤分子生物學(xué)的研究，我們正在從“一勞永逸”的醫(yī)療模式向“個(gè)體化治療”逐漸轉(zhuǎn)變。在這個(gè)新時(shí)代，對(duì)患者的監(jiān)測(cè)是治療成功的基礎(chǔ)，因此需要新的生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。CTCs檢測(cè)具有可重復(fù)性高、侵入性小等優(yōu)點(diǎn)，近年來備受關(guān)注，CTCs亦被稱為惡性腫瘤的液體活檢,應(yīng)用于癌癥的早期診斷及檢測(cè)疾病的復(fù)發(fā)、進(jìn)展。而且，CTCs的檢測(cè)過程保持了細(xì)胞的完整性，這對(duì)后續(xù)的DNA、RNA以及蛋白質(zhì)分子的分析提供了獨(dú)特的機(jī)會(huì)。CTCs檢測(cè)將有望成為一種有價(jià)值的手段來改善肺癌患者的治療效果及預(yù)后。

參考文獻(xiàn)

[1] Wicha MS,Hayes DF.Circulating tumor cells:not all detected cells are bad and not all bad cells are detected[J].J Clin Oncol,2011,29(12):1508-1511.

[2] Lee CY,Shim HS,Lee S,et al.Prognostic effect of matrix metalloproteinase-9 in patients with resected Non small cell lung cancer[J].J Cardiothorac Surg,2015,10(1):44.

[3] Bian L,Wang T,liu Y,et al.Evaluation of treatment response for breast cancer:are we entering the era of “biological complete remission”?[J].Chin J Cancer Res,2012,24:403-407.

[4] Stott SL,Hsu CH,Tsukrov DI,et al.Isolation of circulation tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(43):18392-18397.

[5] Yoshida J,Nagai K ,Yokose T,et al.Primary peripheral lung carcinoma smaller than 1 cm in diameter[J].Chest,1998,114(3):710-712.

[6] Tanaka F,Yoneda K,kondo N,et al.Circulating tumor cell as a diagnostic marker in primary lung cancer[J].Clin Cancer Res,2009,15(22):6980-6986.

[7] Wu C,Hao H, Li L,et al.Preliminary investigation of the clinical significance of detecting circulating tumor cells enriched from lung cancer patients[J].J Thorac Oncol，2009,4(1):30-36.

[8] Du YJ, Li J, Zhu WF,et al.Survivin mRNA-circulating tumor cells predict treatment efficacy of chemotherapy and survival for advanced non-small cell lung cancer patients[J].Tumour Biol，2014，35(5):4499-4507.

[9] Devriese LA,Bosma AJ,van de Heuvel MM,et al.Circulating tumor cell detection in advanced non-small cell lung cancer patients by multi-marker QPCR analysis[J].Lung Cancer,2012,5(2):242-247.

[10] 馮也倩,胡春宏,俞健.非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].醫(yī)學(xué)臨床研究,2012,29(4):632-634.

[11] Bevilacqua S,Gallo M,Franco R,et al.A “l(fā)ive” biopsy in a small-cell lung cancer patient by detection of circulating tumor cells[J].Lung Cancer,2009 ,65(1):123-125.

[12] O'Flaherty JD,Gray S, Richard D,et al.Circulating tumour cells,their role in metastasis and their clinical utility in lung cancer[J].Lung Cancer,2012,76(1):19-25.

[13] Maheswaran S,Sequist LV,Nagrath S,et al.Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells[J].N Engl J Med,2008,359(4):366-377.

[14] 劉春花,楊政,李娜,等.循環(huán)腫瘤細(xì)胞與肺癌臨床病理特征的關(guān)系[J].重慶醫(yī)學(xué),2014,43(20):2565-2568.

[15] Hou JM,Krebs MG,Lancashire L,et al.Clinical significance and molecular characteristics of circulating tumor cells and circulating tumor microemboli in patients with small-cell lung cancer[J].J Clin Oncol，2012,30(5):525-532.

(收稿日期：2015-06-05)

【中圖分類號(hào)】R734.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1001-9510(2016)01-0065-03

通訊作者：張慶廣，E-mail:drzhqg@126.com