彭繼慶，曹福祥，曹基武，董旭杰，劉志明，任 銳，熊亞麗，張鵬鴻

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

繡球花品種遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構(gòu)建

彭繼慶，曹福祥，曹基武，董旭杰，劉志明，任 銳，熊亞麗，張鵬鴻

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

利用ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)23個(gè)繡球花品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，從100條引物中篩選出10條引物對(duì)供試材料基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出條帶123條，其中多態(tài)性條帶102條，占82.93%，具有較高的多態(tài)性。經(jīng)PopGen32軟件包分析，23個(gè)繡球花品種的平均有效等位基因數(shù)為1.493 7，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.290 7，平均Shannon信息指數(shù)為0.435 7，遺傳距離介于0～0.769 1之間，遺傳一致度介于0.463 4～1.000 0之間，具有廣泛的遺傳多樣性，夢(mèng)幻藍(lán)和史歐尼10條引物的擴(kuò)增結(jié)果一致，二者可能為同一個(gè)品種。UPGMA聚類將23個(gè)品種分成2類，聚類結(jié)果與葉片特征一致。引物UBC855可以將23個(gè)繡球花品種完全區(qū)分，依此建立了23個(gè)繡球花品種的指紋圖譜。研究結(jié)果為繡球花分類，品種鑒定、分子育種和子代鑒定提供了重要的依據(jù)。

繡球花；ISSR；遺傳多樣性；指紋圖譜

繡球花Hydrangea macrophylla又名八仙花，屬繡球花科 Hydrangeaceae繡球花屬，常綠或落葉亞灌木、灌木或小喬木，主要分布于亞洲東部至東南部、北美洲東南部至中美洲和南美洲西部，是世界上極具發(fā)展?jié)摿Φ幕ɑ芷贩N之一。我國(guó)是繡球花的發(fā)源地，全國(guó)約37種，7變種，是繡球花屬植物資源最為豐富的國(guó)家之一，然而我國(guó)對(duì)繡球花研究多集中在繁育[1-3]病蟲(chóng)害治理[4]和次生代謝[5-6]等方面，新品種培育方研究甚少，僅有屈連偉[7]和海風(fēng)[8]等2篇報(bào)道。市場(chǎng)上的繡球花品種主要來(lái)至于歐美國(guó)家，我國(guó)繡球花品種基本處于野生、半野生狀態(tài)，建立我國(guó)繡球花新品種培育體系，培育我國(guó)自主品種的繡球花品種已經(jīng)迫在眉睫。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有成本低、穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性高等特點(diǎn)[9]，在雜交育種、親緣關(guān)系鑒定、指紋圖譜構(gòu)建等方面已被廣泛應(yīng)用，在花卉方面應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛。董海燕等[10]對(duì)紅花檵木品種間遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析表明，41個(gè)紅花檵木品種聚為5類，聚類結(jié)果支持葉色作為最高分類等級(jí)。胡仲義等對(duì)重慶南山植物園中的26株川茶花[11]古樹(shù)進(jìn)行遺傳多樣性研究表明， 26個(gè)品種分為5個(gè)類群，牡丹茶與山牡丹之間遺傳相似性最大，可能為牡丹茶的芽變品種。孫利娜等利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)百合[12]輻射突變體進(jìn)行分子鑒定表明經(jīng)60 Co～γ射線輻射獲得的變異百合在DNA水平上存在多態(tài)性差異。嚴(yán)華[13]對(duì)國(guó)蘭遺傳多樣性進(jìn)行了研究，并建立了部分國(guó)蘭的指紋圖譜。黃穎楨等[14]對(duì)不同種源的野生金線蓮間遺傳多樣性進(jìn)行研究，王湘瑩等[15]成功分析了23個(gè)金銀花品種間的遺傳變異，楊梅等[16]將9個(gè)武當(dāng)木蘭典型種群分為3大類群，聚類結(jié)果與地理分布和花部特征劃分大致一致。高武軍對(duì)20個(gè)紅花[17]品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，20個(gè)品種聚為5類。此外，崇明水仙[18]，金葉女貞[19]，芍藥[20]等品種或雜交后代也進(jìn)行了ISSR分子鑒定。

本研究對(duì)22個(gè)國(guó)外繡球花品種和1個(gè)繡球（來(lái)自國(guó)內(nèi)）進(jìn)行ISSR遺傳多樣性研究，對(duì)其遺傳多樣性做出全面、客觀的評(píng)價(jià)，了解育種親本之間的分子基礎(chǔ)，有利于雜交后代的早期檢測(cè)，為繡球花新品種培育提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本實(shí)驗(yàn)所用植物材料為繡球花品種，來(lái)自于中南林業(yè)科技大學(xué)，共23個(gè)品種，其中8個(gè)品種引種于美國(guó)喬治亞大學(xué)，14個(gè)品種引種于荷蘭或意大利，1種繡球（表1），選取植株上葉片完整，生長(zhǎng)狀況好，表面沒(méi)有病蟲(chóng)害和微生物污染的新鮮葉片作為實(shí)驗(yàn)材料

表1 23個(gè)繡球花品種名稱和來(lái)源Table 1 The name and source of 23 varieties of Hydrangea macrophylla

1.2 ISSR引物

本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列來(lái)源于加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的第九套ISSR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，篩選引物編號(hào)及序列（表2）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

繡球花基因組總DNA利用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生物科技（北京）有限責(zé)任公司）進(jìn)行提取，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白分析儀檢測(cè)合格后，稀釋至50 ng/μL，備用。繡球花品種ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系在參考博白大果油茶[22]、殼菜果[23]、野生小果油茶[24]、鉤栗[25]、仙茅[26]等植物反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化并確立，最佳應(yīng)體 系 為（20 μL）：10×PCR Buffer 2.0 μL，DNA 30 ng， Mg2+2.0 mmol/L，ISSR 引物 0.6 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1.5 U，最后用ddH2O將體系補(bǔ)足到20 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火45 s，72 ℃延伸90 s，共36個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸420 s，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照。

以200 bp ladder DNA marker作為參考，根據(jù)電泳圖譜，確定所有樣品圖譜中擴(kuò)增條帶的位置和大小，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶，清晰、可辨認(rèn)的條帶記為“1”，模糊不清或沒(méi)有條帶的，記為“0”，并按照片段大小進(jìn)行排序，形成原始矩陣，根據(jù)Hardy-Weinberg平衡對(duì)原始矩陣進(jìn)行修正。利用PopGen32軟件包對(duì)修正后的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行計(jì)算、分析，利用MEGA6對(duì)繡球花品種進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 繡球花引進(jìn)品種ISSR分子標(biāo)記的多態(tài)性

10條引物對(duì)繡球花23個(gè)品種進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增（見(jiàn)圖1），10條引物共擴(kuò)增了123條條帶，條帶大小在180 bp～3 000 bp之間，條帶清晰，分布比較均勻，其中多態(tài)性條帶共102條，多態(tài)性條帶百分比為82.93%，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。每條引物均能擴(kuò)張出11～14條清晰的條帶（表2），擴(kuò)增條帶最多的引物是UBC815和UBC899，各擴(kuò)增出14條條帶；多態(tài)性條帶在7～13條之間，多態(tài)性條帶百分比最高的是UBC899，共擴(kuò)增13條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶百分比為92.86%，多態(tài)性條帶百分比最低的是UBC841和UBC876，為63.64%，10條引物均能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，可以利用10條引物進(jìn)行繡球花品種鑒定。通過(guò)PopGen32軟件包對(duì)繡球花品種分析，23個(gè)繡球花品種的平均觀測(cè)位點(diǎn)數(shù)na為1.829 3，有效等位位點(diǎn)數(shù)ne為1.493 7，Nei’s基因多樣性 h 為 0.290 7，Shonnon’s 信息指數(shù)為0.242 4，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.377 8、0.346 3、0.176 1和0.242 4，繡球花品種具有豐富的遺傳多樣性。

圖1 UBC895對(duì)23個(gè)繡球花品種ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of polymorphism PCR of 23 varieties of Hydrangea macrophylla in primer UBC895

表2 ISSR引物擴(kuò)增的位點(diǎn)Table 2 Amplification sites of ISSR primers

2.2 繡球花引進(jìn)品種遺傳距離和遺傳一致度

對(duì)繡球花品種進(jìn)行遺傳距離和遺傳一致度分析表明，23個(gè)品種的遺傳距離介于0～0.769 1，平均值為0.373 5；遺傳一致度介于0.463 4～1.000 0之間，平均值為0.696 2，23個(gè)品種中遺傳一致度最近的是夢(mèng)幻藍(lán)和史歐尼，為1.000 0，兩個(gè)品種均是由意大利或荷蘭培育而出的新品種，在形態(tài)方面具有很高的相似性；遺傳一致度最低的是羅斯和幻影繡球，僅為0.463 4，羅斯引種于荷蘭或意大利，幻影繡球引種于美國(guó)，二者在形態(tài)上也存在很大的區(qū)別，羅斯葉片肥厚，葉片較大，心形葉，球狀花序，而幻影繡球葉片較小，表面比較粗糙，枝條較細(xì)，圓錐形花序。繡球花品種間遺傳差異大與繡球花品種的培育方式有很大的關(guān)系，目前繡球花新品種都采用雜交育種的方式，為了出現(xiàn)很好的性狀分離，母本和父本之間在同屬之間親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，或者采用不同屬之間雜交，從而導(dǎo)致了繡球花品種間出現(xiàn)較大的遺傳變異。

2.3 繡球花品種聚類和親緣關(guān)系分析

利用Popgen32軟件包和MEGA6對(duì)23個(gè)繡球花品種進(jìn)行UPGMA聚類分析表明，23個(gè)繡球花品種分為2個(gè)大類，聚類結(jié)果與葉片形態(tài)特征一致（見(jiàn)圖2）。第1類包括香草草莓、粉寶石繡球、石灰燈和幻影繡球4個(gè)品種，其中粉寶石繡球和石灰燈的親緣關(guān)系最近。該類群的具有極大的相似性，花序?yàn)閳A錐形花序，葉片較小且葉片薄，葉表面粗糙，枝條較細(xì)，分枝多等特征。第2類包括19個(gè)品種，該類群花序?yàn)榍蛐位ㄐ蚧騻阈位ㄐ?，葉片肥大，葉表面光滑，分枝少，枝條粗壯。第2類群在遺傳距離閾值為14.5時(shí)可以分為4個(gè)亞群，第一亞群包括魔幻水晶、變?nèi)~繡球、魔幻紫水晶、紅寶石繡球、夢(mèng)幻藍(lán)、史歐尼、精靈、羅斯、塞爾瑪和伊米莉亞繡球，夢(mèng)幻藍(lán)和史歐尼親緣關(guān)機(jī)最近，二者遺傳距離為0，遺傳一致度為100.00%，形態(tài)特征上二者基本一致，葉片、花序等形態(tài)特征無(wú)明顯差別，二者可能為同一品種。第二亞群包括無(wú)盡夏、彭妮馬克繡球、藍(lán)尼康繡球、南丁格爾繡球、繡球、拉維布蘭6個(gè)品種，我國(guó)的繡球和美國(guó)的南丁格爾繡球親緣關(guān)系比較相近，遺傳距離為0.187 2，遺傳一致度為82.93%；第三亞群為新娘和塔貝；粉色回憶單獨(dú)成為一個(gè)亞群。

圖2 繡球花品種UPGMA聚類圖Fig.2 The UPGMA phylogenetic tree of varieties of Hydrangea macrophylla

2.4 繡球花引進(jìn)品種鑒定

利用10條ISSR引物對(duì)23個(gè)繡球花品種進(jìn)行品種鑒定，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析（表3），10條引物共鑒定出22個(gè)繡球花品種，但繡球花品種‘夢(mèng)幻藍(lán)’和繡球花品種‘史歐尼’的DNA指紋圖譜完全一致，10個(gè)引物的遺傳距離為0，遺傳一致度為100%，二者在形態(tài)特征上也沒(méi)有明顯的差異，因此將二者定為一個(gè)品種。每條引物鑒定繡球花品種的數(shù)量在5～21個(gè)之間，存在很大的差異，鑒定數(shù)量最多的是UBC855，共鑒定出21個(gè)繡球花品種，鑒定數(shù)量最少的是UBA876，僅鑒定出5個(gè)繡球花品種。鑒定出10個(gè)繡球花品種以上的引物多大7個(gè)，分別是UBC815、UBC824、UBC835、UBC841、UBC855、UBC895、UBC899，表明ISSR引物能很好地進(jìn)行繡球花品種鑒定。

2.5 繡球花品種DNA指紋圖譜構(gòu)建

10條ISSR引物中，UBC855能夠?qū)?2品種進(jìn)行很好地鑒定，因此，利用UBC855對(duì)22個(gè)繡球花品種進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建，UBC855對(duì)22個(gè)繡球花品種均能進(jìn)行很好的擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在220～1 400 bp之間，條帶清晰，多態(tài)性條帶豐富。片段長(zhǎng)度小于220 bp或大于1 400 bp，擴(kuò)增片段模糊不清，因此不予統(tǒng)計(jì)。根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無(wú)，有條帶記為“1”，沒(méi)條帶記為“0”，建立22個(gè)繡球花品種的計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜，如表4。

表3 ISSR引物對(duì)繡球花品種鑒定Table 3 Identification of varieties of Hydrangea macrophylla based on ISSR primers

表4 繡球花品種的計(jì)算機(jī)化DNA指紋圖譜?Table 4 The computerized DNA fingerprint of varieties of Hydrangea macrophylla

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)23個(gè)繡球花品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，繡球花多態(tài)條帶百分比為82.92%，遠(yuǎn)低于大菊品種的92.5%[21]，高于紅花檵木品種的72.9%，遺傳多樣性較高。遺傳距離介于0～0.769 1，平均值為0.373 5；遺傳一致度介于0.463 4～1.000 0之間，平均值為0.696 2，遺傳距離和遺傳一致度跨度較大，和大菊品種的遺傳多樣性特征相似，應(yīng)該有兩方面原因，一是分布廣泛，繡球花資源種類較多，分布更是跨不同氣候帶，具有很好的遺傳基礎(chǔ)；二是繡球花新品種培育多采用雜交育種的方式，有利于品種或種之間的基因交流。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有檢測(cè)靈敏、多態(tài)性好、穩(wěn)定、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)23個(gè)繡球花品種鑒定過(guò)程中，10條引物均能對(duì)繡球花品種進(jìn)行很好的鑒定，品種間遺傳一致度和遺傳距離跨度大，與繡球花雜交育種和新品種培育方式相關(guān)。而10條引物對(duì)‘夢(mèng)幻藍(lán)’和‘史歐尼’兩品種擴(kuò)增條帶圖譜完全一致，二者在形態(tài)特征，生長(zhǎng)表現(xiàn)也無(wú)明顯差異，兩個(gè)品種極有可能為同一品種，由此可見(jiàn)，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在繡球花品種鑒定方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。聚類結(jié)果與繡球花品種葉片和花序形態(tài)特征一致，香草草莓、粉寶石繡球、石灰燈和幻影繡球4個(gè)繡球花品種葉片橢圓形，葉片薄且表面粗糙，花序?yàn)閳A錐形花序；其余品種葉片呈心形，葉片厚而光滑，球形或聚傘花序，因此，UPGMA聚類結(jié)果可以作為繡球花品種葉片和花序分類的依據(jù)。但也存在不足，該方法聚類結(jié)果并不能將球形花序品種和聚傘花序品種完全區(qū)分，可能是由于方法本身限制，也有可能是未篩選出合適引物，具體原因還需進(jìn)一步研究。

指紋圖譜在植物品種鑒定、親子分析、雜種真?zhèn)舞b定和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面具有重要作用。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以將繡球花品種很好地區(qū)分，所選10條引物中有7條能區(qū)分出15個(gè)及以上品種，鑒定品種最多的是引物UBC855，可以鑒定出全部23個(gè)品種，利用引物UBC855進(jìn)行繡球花品種的指紋圖譜構(gòu)建，有利于繡球花品種鑒定和真?zhèn)伪鎰e，有利于繡球花新品種培育，子代檢測(cè)鑒定，同時(shí)還可為為繡球花雜交育種提供指導(dǎo)，具有重要意義。

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Genetic diversity and fi ngerprint construction of varieties of Hydrangea macrophylla by ISSR markers

PENG Ji-qing, CAO Fu-xiang, CAO Ji-wu, DONG Xu-jie, LIU Zhi-ming, REN Rui, XIONG Ya-li, ZHANG Peng-hong
(College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

ISSR-PCR was used to detect the genetic diversity and relationship of 23 varieties ofHydrangea macrophylla. ISSR fi ngerprinting ampli fi ed by 10 ISSR primers which were selected from 100 ISSR primers revealed a total number of 123 unambiguous bands, of which 102 ones were polymorphic and the polymorphism frequency was 82.93%. As analyzed by PopGen32, the mean effective number of alleles of 23 varieties ofHydrangea macrophylla, the mean Nei’s genetic diversity index is 0.2907, the mean Shannon information index is 0.435 7, the genetic distance between varieties ranged from 0 to 0.769 1 and the similarity coef fi cient ranged from 0.463 4 to 1, the genetic diversity is higher, the result ofHydrangea macrophylla‘rathen’ andHydrangea macrophylla‘masja’ are consistent, they may be as one variety. These 23 varieties ofHydrangea macrophyllawere divided into two groups by UPGMA based on the similarity coef fi cient, which is consistent with the classi fi cation results according to the blade features. Because 23 varieties ofHydrangea macrophyllacan be completely distinguished by the UBC855 primer, the fi ngerprint of 23 varietiesHydrangea macrophyllawas established. The result can be used as a basis for classification ofHydrangea macrophylla, variety identification,molecular breeding and offspring identify.

Hydrangea macrophylla; ISSR; genetic diversity; fi ngerprint

S718.46

A

1673-923X(2016)12-0115-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.020

http: //qks.csuft.edu.cn

2015-12-31

國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目“繡球花植物新品種及繁育技術(shù)引進(jìn)”(2013-4-35)；湖南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目：繡球花新優(yōu)品種培育及開(kāi)發(fā)利用（2016NK2143）；湖南省教育廳一般項(xiàng)目“繡球花品種遺傳多樣性的ISSR研究及指紋圖譜構(gòu)建”（15C1433）

彭繼慶，講師，碩士

曹福祥，教授，博士；E-mail：csfucao@163.com

彭繼慶，曹福祥，曹基武，等. 繡球花品種遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,36(12): 115-120.

[本文編校：文鳳鳴]