左 濤 ，包 海 ，陳 慧 ，蘇衍修 ，常聚普 ，郭利民 ，賀 偉 ，王延偉

（1.北京林業(yè)大學(xué) a.林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室；c.林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 濮陽市林業(yè)科學(xué)院，河南 濮陽 457000）

楊樹LAR基因的克隆及表達(dá)對(duì)兒茶素合成的影響

左 濤1a,b,c，包 海1b,c，陳 慧1b,c，蘇衍修2，常聚普2，郭利民2，賀 偉1a，王延偉1b,c

（1.北京林業(yè)大學(xué) a.林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室；c.林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 濮陽市林業(yè)科學(xué)院，河南 濮陽 457000）

無色花色素還原酶基因（Leucoanthocyanidin reductase,LAR）是類黃酮生物合成途徑中的一個(gè)重要基因，為了驗(yàn)證楊樹中LAR的功能，明確LAR基因?qū)共∥镔|(zhì)兒茶素合成的影響，本實(shí)驗(yàn)以接種后第6 d的一年生‘中林46’楊樹樹干的樹皮為材料, 利用RT-PCR技術(shù)克隆了LAR基因的OFR序列，并構(gòu)建LAR的過表達(dá)載體pCAMBIA1301-LAR。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，獲得了轉(zhuǎn)LAR基因的煙草6株。用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草的表達(dá)量，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因植株中，LAR基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)。用高效液相色譜法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中的兒茶素含量，結(jié)果顯示，6株轉(zhuǎn)LAR的煙草植株中，有4株內(nèi)源兒茶素含量顯著升高。以上結(jié)果表明，中林46楊LAR是楊樹類黃酮生物合成途徑中的一個(gè)基因，該基因與兒茶素的合成有關(guān)。

類黃酮；無色花色素還原酶基因；過表達(dá)；兒茶素

類黃酮是一類重要的次生代謝物，廣泛存在于整個(gè)植物界中，從苔蘚植物到被子植物均含有此類物質(zhì)。在杜仲組織中，類黃酮合成途徑上游的查爾酮合成酶基因（CHS）和查爾酮異構(gòu)酶基因（CHI）的表達(dá)量在不同的組織中呈現(xiàn)差異[1]。無色花色素還原酶基因（LAR）是類黃酮生物合成途徑中下游的一個(gè)重要基因，可直接將無色花色素轉(zhuǎn)化為2,3-反式黃烷-3-醇，即兒茶素[2]。該基因最早在銀葉山螞蝗Desmodium uncinatum中基于蛋白純化后克隆得到，編碼LAR的基因目前已被分離并在大腸桿菌中成功表達(dá)[3]。Li等[4]將玉米中的Lc（Leaf colour）調(diào)控基因轉(zhuǎn)入蘋果植株中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植物中LAR的表達(dá)量升高，且兒茶素大量積累。馬春雷[5-6]用半定量的方法研究了茶樹中各基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著兒茶素含量的增加，LAR的表達(dá)量有所增加，而其它基因的表達(dá)量則沒有增加。對(duì)不同茶樹品種間與兒茶素合成相關(guān)的多種酶差異表達(dá)分析顯示，只有DFR和LAR基因的表達(dá)量與茶樹總兒茶素含量呈一定的相關(guān)性。在模式植物擬南芥中沒有未發(fā)現(xiàn)LAR，而只能合成表兒茶素[7-8]，說明LAR與兒茶素的合成緊密相關(guān)。

煙草是最早應(yīng)用分子生物學(xué)和基因工程研究的植物之一，作為模式植物，容易進(jìn)行組織培養(yǎng)和獲得轉(zhuǎn)基因植株。在煙草的研究中已形成一套較為成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)流程，并獲得了大批抗逆轉(zhuǎn)基因煙草材料，從而在植物生命科學(xué)研究中起到了重要作用[9]。前人將脫落酸（ABA）誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草在干旱脅迫下有大量的ABA產(chǎn)生，其抗旱性得到提高[10]。將水稻的Os-SPXl基因轉(zhuǎn)入煙草，與野生型植株相比，其耐寒性有所提高[11]。利用AoPR1作為啟動(dòng)子將CrylAc基因轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因煙草遭受機(jī)械損傷后，CrylAc蛋白含量迅速增加，對(duì)棉鈴蟲和煙草天蛾的抗性增強(qiáng)[12]。

在本課題組前期研究中，發(fā)現(xiàn)‘中林 46’ 楊Populus×euramericanaNeva cv.‘Zhonglin 46’在受歐美楊細(xì)菌性潰瘍病病菌Lonsdalea quercina(Hildebrand and Schroth)Brady.subsp.populi.侵染后，其發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)高于‘107楊’[13]，并且LAR基因明顯上調(diào)[14]，這一結(jié)果初步表明LAR基因受到病原菌的誘導(dǎo)，LAR可能與楊樹抗病性有關(guān)，但未經(jīng)驗(yàn)證。若能利用轉(zhuǎn)基因的方法，證明‘中林46’楊LAR基因與兒茶素的含量有關(guān)，可為深入研究LAR基因的功能提供參考，并為抗病分子育種提供候選基因。為此，本研究克隆了‘中林46’楊接種細(xì)菌性潰瘍病菌后誘導(dǎo)的LAR基因并構(gòu)建其過表達(dá)載體，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)化煙草。在驗(yàn)證正義的LAR基因插入到煙草基因組后，用qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行LAR的表達(dá)量檢測(cè)，用HPLC法測(cè)定其相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物兒茶素的含量，確定該基因在煙草中的表達(dá)所引起的兒茶素含量變化，以期為分析LAR基因的功能提供進(jìn)一步的研究線索。

1 材料與方法

1.1 材 料

從楊樹組織中分離得到的歐美楊細(xì)菌性潰瘍病致病菌株Lonsdalea quercinaN-5-1保存于北京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。于2015年9月，在河南濮陽市林科院苗圃，選取1年生‘中林46’楊苗木，用菌株Lonsdalea quercinaN-5-1傷皮接種。接種苗木共3株，在每株苗干上間隔30 cm接一個(gè)點(diǎn)，共接4個(gè)點(diǎn)，接種后裹膠帶保濕。取同樣的苗木3株，接無菌水作為對(duì)照，接種后第6 d采集接種處長2 cm、寬1 cm的樹皮組織，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆?。煙草組培苗由北京林業(yè)大學(xué)林木育種國家工程實(shí)驗(yàn)室提供。pCAMBIA1301質(zhì)粒購自杭州寶賽生物科技有限公司。根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404由北京林業(yè)大學(xué)樹木生長發(fā)育生化機(jī)理研究室提供。

1.2 RNA提取和cDNA合成

采用RNA試劑盒改良法[15]提取接種后第6 d的‘中林46’楊樹皮總RNA。cDNA第一鏈的合成按照Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Superscript III Reverse Transcriptase First-Strand Synthesis System）說明書進(jìn)行。RNA取2 μg，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。

1.3 LAR基因的克隆

根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫（http://www.phytozome.net/）中公布的毛果楊無色花色素還原酶基因（LAR）（登錄號(hào)：Potri.009G118300）序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物：

將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋100倍，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：

總體積 50 μL

PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。將回收后的目的片段與pGEM-T(Progema)載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基上（含100 mg/L氨芐青霉素）進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑選陽性克隆于LB液體培養(yǎng)基中（含100 mg/L氨芐青霉素）振蕩培養(yǎng)至渾濁，做菌液PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆后，送上海英濰捷基生物公司測(cè)序。利用DNAMAN軟件對(duì)克隆得到的LAR基因序列和Phytozome中公布的毛果楊LAR基因序列進(jìn)行比對(duì)。

1.4 LAR序列載體構(gòu)建

用NcoI和BglII內(nèi)切酶雙酶切克隆載體上的LAR片段和pCAMBIA1301載體，再將LAR片段和pCAMBIA1301連接，構(gòu)建植物過表達(dá)載體，并做菌落PCR[13]和測(cè)序鑒定。

1.5 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌

制備農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)[16]，然后用凍融法[17]將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在YEB固體培養(yǎng)基（含利福平50 mg/L、鏈霉素100 mg/L、卡那霉素50 mg/L）上28 ℃培養(yǎng)48 h，菌落PCR驗(yàn)證后，得到轉(zhuǎn)基因工程菌。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化

剪下組培3～4周的煙草無菌幼嫩葉片，用無菌手術(shù)刀劃出傷口。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染葉片[18-19]，將侵染后的煙草葉片暗培養(yǎng)3 d，之后將葉片放入含有濃度為200 mg/L的特美汀和20 mg/L的潮霉素的篩選培養(yǎng)基中分化篩選，在培養(yǎng)溫度為25 ℃，光周期為16/8 h的組培室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株的普通PCR檢測(cè)

提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片和野生型煙草葉片的基因組DNA，按照植物基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行，以CaMV 35S和目的片段設(shè)計(jì)引物：

LARF：5’-TGACGCACAATCCCACTATC-3’；LARR：5’-GAGCAGCTGTAACTCCAATCT-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)體系如下：

總體積 25μL

PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.8 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(cè)

從轉(zhuǎn)基因煙草葉片和野生型煙草葉片中提取總RNA，RNA提取和反轉(zhuǎn)錄方法同上。qRT-PCR引物如下：

采用寶生物工程（大連）有限公司的SYBR Premix Ex Taq實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒進(jìn)行表達(dá)分析，以Ubiquitin作為內(nèi)參基因，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草中的相對(duì)表達(dá)量的變化。PCR反應(yīng)體系含SYBR Premix Ex Taq酶10 μL、ROX dyeII 0.4 μL、10 μmol/L 上下游引物各 0.4 μL、cDNA模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)充體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火32 s、共45個(gè)循環(huán)，并采集熒光數(shù)據(jù)。

1.9 HPLC法測(cè)量植株中兒茶素含量

甲醇溶解1 mg兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品，定容至10 mL，配制濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.45 μm的微孔膜過濾。分別稱取轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的干重葉片粉末各100 mg，加入10 mL70%的乙醇[20]，超聲破碎30 min，12 000 r/min離心2 min，將清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃旋蒸后定容至10 mL，通過0.45 μm的微孔膜過濾后，在色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。色譜條件為：檢測(cè)波長λ=280 nm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸（V∶V）[21]；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAR基因的擴(kuò)增及克隆

提取中林46楊接種后第6 d的樹皮總RNA，反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板，PrLAR-F和PrLAR-R為引物擴(kuò)增，凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到一條約1 000 bp左右的片段（圖1），片段大小與引物設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 測(cè)序結(jié)果及序列分析

測(cè)序后得到的LAR基因序列，利用DNAMAN軟件，與Phytozome中公布的毛果楊LAR基因序列（Potri.005G229500）進(jìn)行比對(duì)（圖2）。中林46中的LAR基因（ATGGCCGCGAAAACTAAGA TTCTGTTCATCGGGGGAACAGGATACATAGGAA AATTCATAGTGGAAGCAAGTGCCAAGGCAGGC CACCCTACTTTTGCTCTTGTTAGAAAGTCCAGT CTTTCTAGCCCTGCCAAATCTAATGTGATTAACA AATTCAAGAATCTTGGTGTCAATTTTCTCACTG GAGATTTGTTTGATCATGAGAGTTTGGTGAAGG CGATAAAGCAAGTGGATGTGGTGATCTCTGCG GTTGGTCACTCTCAATTGGGTAACCAAGACAG GATCATTACTGCCATTAAAGAAGCTGGAAATGT TAAGAGGTTTTTCCCGTCCGAATTTGGAAATGA TGTTGATAGGGTGCATGCTGTTGAACCAGTAAA ATCAGCATATGCTCATAAGGTTAAACTACGCAG AGTTCTTGAGGCCGAAGGAATTCCATACACCAT TGTGTCAAATAATTTTTTTGCTGGTTATTTCCTT CCAACTTTGAACCAGATTGGAGTTACAGCTGC TCCAAGAGATAAAGTTGTCATCTGGGGTGATGG AAATCCTAAAGCGGTGTTTAACGTGGAAAATG ACATTGGCACCTATACTATCAGAGCAGTGGATG ATCCAAGAGCCTTGAACAAAATCCTCTACATTA GACCCCCAGCTAACACCATCTCATTCAACGATC TTGTGTCTTTGTGGGAGAGGAAGATTGGGAAA ACCCTTAAAAGGATTTACATTCCCGAGGAGCA ACTTTTGAAGAATATTCAAGAAGCTCCATTTCC AGACAGTGTGGAATTAGCACTTTTTCACTGTGT CTTTGTGAAGGGAGATCACACCAACTTCAAGA TTGAACCATCATTTGGTGTAGAGGCTTCTGAGC TTTACCCTGATGTCAAATACACTACCGTGGATG AATACCTTGATCAGTTTGTCTGA）與毛果楊中的LAR基因具有94.67%的相似性，保守性較高，其開放閱讀框架為927 bp，編碼308個(gè)氨基酸。

圖1 ‘中林46’楊LAR基因RT-PCR擴(kuò)增電泳Fig.1 Electrophoresis of LAR gene of P. euramericana cv.‘Zhonglin 46’ with RT-PCR ampli fi cation

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

克隆載體和pCAMBIA1301載體用NcoI和BglII雙酶切，然后用T4 DNA Ligase連接酶切后的LAR和pCAMBIA1301，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)，做菌落PCR檢測(cè)陽性克隆（圖3），并將陽性克隆菌液送公司測(cè)序，檢測(cè)LAR序列正確插入到了pCAMBIA1301載體CaMV 35S啟動(dòng)子的下游，檢測(cè)正確的表達(dá)載體命名為pCAMBIA1301-LAR，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中并得到轉(zhuǎn)基因工程菌株。

圖3 陽性克隆的菌落PCRFig.3 Colony PCR analysis of positive clones

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的普通PCR檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因工程菌侵染后的煙草葉片經(jīng)過3 d暗培養(yǎng)后，將其放在篩選培養(yǎng)基上分化篩選，再將篩選得到的抗性植株置于生根培養(yǎng)基中生根，進(jìn)而得到完整的煙草抗性苗。提取煙草抗性苗葉片的基因組DNA，以CaMV 35S和目的片段設(shè)計(jì)引物，以野生型煙草為陰性對(duì)照，重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-LAR為陽性對(duì)照，經(jīng)普通PCR擴(kuò)增后抗性植株得到長度為655 bp的特異擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小一致（圖4），可以初步證明LAR基因已整合到煙草的基因組中。共檢測(cè)轉(zhuǎn)LAR基因的煙草抗性植株6株，得到陽性植株6株。

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR分析

提取6株轉(zhuǎn)基因煙草葉片和野生型煙草片的總RNA，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進(jìn)行qRTPCR的表達(dá)量分析，用2-ΔΔCT方法來進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。結(jié)果顯示（圖5），正義表達(dá)載體pCAMBIA1301-LAR轉(zhuǎn)入煙草后，在轉(zhuǎn)基因植株中，LAR基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)。

圖4 轉(zhuǎn)基因煙草再生苗的PCR鑒定Fig.4 PCR analysis of transgenic seedling of tobacco

圖5 轉(zhuǎn)基因煙草再生苗LAR基因的表達(dá)量檢測(cè)Fig.5 LAR gene expression detection of transgenic seedling of tobacco

2.6 轉(zhuǎn)基因植株中兒茶素的含量測(cè)定

HPLC條件為：從0 min開始到40 min，流動(dòng)相乙腈為10%，0.1%磷酸為90%；40 min以后流動(dòng)相乙腈為100%，0.1%磷酸為0。標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為1 μL，樣品進(jìn)樣量為10 μL。WT為對(duì)照組，TS為實(shí)驗(yàn)組，由圖6可知，兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品出峰的時(shí)間為6.8 min，WT在6.8 min時(shí)沒有單峰（圖7），TS1、TS2、TS5和TS6在6.8 min時(shí)均有單峰，而TS3和TS4在6.8 min時(shí)沒有單峰（圖8）。

根據(jù)面積比等于濃度比的關(guān)系，求出內(nèi)源兒茶素含量，即內(nèi)標(biāo)面積/樣品面積=內(nèi)標(biāo)濃度/樣品濃度（表1）。

圖6 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC分析圖譜Fig.6 The HPLC analysis of catechin standard product

圖7 野生型煙草對(duì)兒茶素的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 The HPLC analysis of catechin product from WT

圖8 TS1～TS6對(duì)兒茶素的檢測(cè)結(jié)果Fig.8 The HPLC analysis of catechin product from TS1～TS6

表1 各樣品中兒茶素的液相峰面積與含量Table 1 The liquid phase peak area and content of catechin in the sample

由表1和表2可知，在野生型煙草中兒茶素含量未檢測(cè)到，在轉(zhuǎn)LAR的煙草植株TS1、TS2、TS5和TS6中，其內(nèi)源兒茶素的含量大幅度增加，而TS3和TS4中沒有檢測(cè)到兒茶素。

3 結(jié)論與討論

本研究克隆出了接種歐美楊潰瘍病菌第6 d后的‘中林46’楊LAR基因，并構(gòu)建了正義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入煙草中，得到6株正義LAR轉(zhuǎn)基因陽性植株，在6株轉(zhuǎn)基因株系中，LAR的表達(dá)量全部上調(diào)，其中有4株的兒茶素含量大幅度提高。說明外源的LAR促進(jìn)了內(nèi)源兒茶素的合成。

根據(jù)前人的研究結(jié)果可知，兒茶素在植物對(duì)病原物質(zhì)的防御和抵抗中也發(fā)揮著重要作用。在棉枯萎病菌Fusarium oxysporumf. sp. vasinfectum(Atk.) W.C. Snyd. &H. N. Hans.侵染棉苗組織后，兒茶素的含量顯著升高[22]。研究顯示，棉花體內(nèi)的兒茶素可使立枯絲核菌RhizoctoniasolaniKühn產(chǎn)生的的多聚半乳糖醛酸酶（PG）失活[23]，并能抑制棉枯萎病菌的菌絲生長[24]。在后續(xù)的研究中，可對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草進(jìn)行歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌的接種，觀察發(fā)病情況，并作分子檢測(cè)，進(jìn)一步揭示兒茶素和其合成相關(guān)基因LAR在抗病中的作用。

在本研究中，轉(zhuǎn)基因煙草有2株沒有檢測(cè)到兒茶素，可能與轉(zhuǎn)基因沉默有關(guān)系。以往植物轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，將查耳酮合成酶基因轉(zhuǎn)入紫色矮牽?；ㄖ幸约由钏念伾?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些花色不但沒有加深反而變淺，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)入的查耳酮合成酶基因和牽?；ㄖ姓５幕蛞黄鸢l(fā)生了沉默[25]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)果是一種轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象[26]。利用反義RNA阻斷線蟲中的par-1基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反義RNA阻斷了par-1基因表達(dá)，但同時(shí)正義RNA的對(duì)照組也出現(xiàn)par-1基因失活現(xiàn)象[27]。之后有科學(xué)家提出， dsRNA對(duì)其同源序列的mRNA表達(dá)具有很強(qiáng)的干涉作用，并稱這種現(xiàn)象為RNA干涉，即RNAi[28]。后來又有一些實(shí)驗(yàn)證明，在特定酶的參與下，外源和內(nèi)源的雙鏈RNA都可誘導(dǎo)生物體內(nèi)同源的mRNA發(fā)生降解，從而阻斷基因的表達(dá)，引發(fā)轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默[29]。為了明確轉(zhuǎn)基因煙草中沒有兒茶素的現(xiàn)象是否真的與RNAi有關(guān)，還需要做進(jìn)一步的研究方可判斷。

在本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，野生型的煙草葉片中沒有兒茶素。而在前人的研究中發(fā)現(xiàn)擬南芥沒有LAR基因，其只能合成表兒茶素而不能合成兒茶素[30-31]。因此，野生型煙草的兒茶素類化合物的合成途徑可能與擬南芥相似，在后續(xù)的研究中，可以分別檢測(cè)野生型煙草中與兒茶素類化合物合成相關(guān)的基因是否存在和其表達(dá)情況，以做進(jìn)一步分析。

[1]李鐵柱,杜紅巖,王璐.杜仲黃酮生物合成途徑相關(guān)基因表達(dá)差異研究[J]. 經(jīng)濟(jì)林研究, 2014, 32(1):21-26.

[2]Furukawa T, Eshima A, Kouya M,et al.Coordinate expression of genes involved in chtechin biosynthesis in Polygonumhydropiper[J]. Plant Cell Reports, 2002(21):385-389.

[3]Tanner GJ, Francki KT, Abrahams S. Proanthocyanidin biosynthesis in plants: puri fi cation of legume leucoanthocyanidin reductase and molecular cloning of its cDNA[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2003(278):31647-31656.

[4]Li H H, Flachowsky H, Fischer T C,et al.Maize Lc transcription factor enhances biosynthesis ofanthocyanins,distinct proanthocyanidins and phenylpropanoids in apple(Malus domesticaBorkh.) [J]. Planta, 2007(226):1243-1254.

[5]馬春雷.茶樹查爾酮異構(gòu)酶、黃酮醇合成酶和無色花色素還原酶等基因的克隆與表達(dá)分析[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2007.

[6]馬春雷,喬小燕,陳 亮.茶樹無色花色素還原酶基因克隆及表達(dá)分析[J].茶葉科學(xué),2010,30(1):27-36.

[7]Pourcel L, Routaboul JM, Kerhoas L,et al. TRANSPARENT TESTA10 encodes alaccase-like enzyme involved in oxidative polymerization of flavonoids in Arabidopsis seed coat[J]. The Plant Cell, 2005(17):2966-298.

[8]Liang M, Davis E, Gardner D,et al.Involvement of AtLAC15 in lignin synthesis in seeds and in root elongation of Arabidopsis[J].Planta, 2006,(224):1185-1196.

[9]王津津,侯學(xué)文.基因工程技術(shù)提高煙草抗病蟲性的研究進(jìn)展[J].植物保護(hù),2010,36(6):1-5.

[10]Imai R, Meena M S, Bray E A. Expression of an ABA induced gene of tomato in transgenic tobacco during periods of water de fi cit[J]. Journal of Experimental Botany,1995,(46):1077-1084.

[11]Zhao LN, Liu FX, Xu WY,et al. Incrcased expression of OSSPXl enhance cold/subfreezing tolerance in tobacco and Arabidopsis thaliana[J]. Plant Biotechnology, 2009,(7):550-561.

[12]Gulbitti-Onarici S, Zaidi M A, Taga I,et al. Expression of CrylAc in transgenic tobacco Plants under the control of a woundinducible promoter(AoPR1) isolated from Asparagus of fi cinalis to control Heliothis virescens and Manducasexta[J]. Molecular Biotechnology, 2009,42(3):341-349.

[13]倪 琳,賀 偉,常聚普.林分因子和氣象因素對(duì)歐美楊潰瘍病發(fā)生的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,34(8):53-58.

[14]Hou J, Wu Q, Zuo T,et al.Genome-wide transcriptomic pro fi les reveal multiple regulatory responses of poplar to Lonsdalea quercina infection[J]. Trees, 2016 (online,DOI: 10.1007/s00468-016-1376-7).

[15]侯 佳,孫豐碩,吳秋明,等.一種高效提取楊樹發(fā)病樹皮總RNA的方法及應(yīng)用[J].植物生理學(xué)報(bào),2014,5(2):223-228.

[16]朱 錦,權(quán)軍利,何玉科.根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備以及質(zhì)粒ProkⅡ?qū)ζ滢D(zhuǎn)化的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2006,34(7):91-95.

[17]Rhodes CA,Pierce DA,Metller IJ .Genetically transformed maize plants from protoplasts[J]. Science,1988,(240):204-207.

[18]Bevan MW, Flavell R B, Chilton M D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation[J]. Nature, 1983,(304):184-187.

[19]Horsch RB, Fry JE, Hoffman NL, Eichholtz D, Rogers SG,Fraley RT. Asimple and general method for transferring genes into plant[J]. Science,1985,227(7):1229-1231.

[20]賈可敬,李湘洲,殷 凱.長沙青皮竹葉中黃酮類化合物的提取工藝條件[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2014, 32(2):125-129.

[21]張戎睿,王舒雅,王富濟(jì),等.HPLC法同時(shí)檢測(cè)茶葉中八種兒茶素[J].黑龍江醫(yī)藥,2011,24(5):681-683.

[22]宋鳳鳴,鄭 重,童賢明,等.兒茶素對(duì)棉枯萎病菌胞壁降解酶的抑制及在棉花抗病性中的作用[J].真菌學(xué)報(bào),1996,15(4):297-303.

[23]Hunter R.EInactivation of pectic enzymes by polyphenols in cotton seedlings of different ages infected with Rhizoctonia solani[J]. Physiological Plant Pathology,1974,(4):151-159.

[24]宋鳳鳴,鄭重,葛秀春,等.兒茶素在棉苗對(duì)枯萎病抗性中的作用[J].植物病理學(xué)報(bào), 1998, 28(2):139-143.

[25]Napoli C,Lemieux C,Jorgensen R A. Introduction of a chimerieehaleone synthase gene into Petunia results in reversible cosuppression of homologous genesintrans[J]. The Plant Cell,1990:279-289.

[26]陳 文,王 東,何弈昆.RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默:原理及應(yīng)用[J]. 遺傳 ,2003,25(4):459-494.

[27]Guo S, KemphuesK J, Par-1,a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J]. Cell,1995,81(4):611-620.

[28]Fire A, Xu S, Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabitis elegans[J]. Natrue, 1998,(391):806-811.

[29]Waterhouse P M, Wang M B, Lough T. Gene silencing as an adaptive defence against viruse[J]. Nature,2001,(411):834-842.

[30]Pourcel L, Routaboul J M, Kerhoas L,et al.TRANSPARENT TESTA10 encodes alaccase-like enzyme involved in oxidativ epolymerization of fl avonoids in Arabidopsis seed coat[J]. The Plant Cell, 2005,(17): 2966-2980.

[31]Liang M, Davis E, Gardner D,et al.Involvement of AtLAC15 in lignin synthesis in seeds and in root elongation of Arabidopsis[J].Planta, 2006,(224):1185-1196.

Cloning of Poplar Leucoanthocyanidin reductase gene(LAR) and transgenic analysis on catechin synthesis in tobacco

ZUO Tao1a,b,c, BAO Hai1b,c, CHEN Hui1b,c, SU Yan-xiu2, CHANG Ju-pu2, GUO Li-min2, HE Wei1a, WANG Yan-wei1b,c
(1a. Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education of Beijing Forestry University; b. National Engineering Laboratory for Tree Breeding of Beijing Forestry University; c. Tree and Ornamental Plant Breeding and Biotechnology Laboratory of State Forestry Administration of Beijing Forestry University, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Forestry Research Institute of Puyang, Puyang457000, Henan, China)

Leucoanthocyanidin reductasegene (LAR) is one of important genes in fl avonoids biosynthesis pathway. This investigation was conducted in order to verify function ofLAR, and the in fl uence on the synthetsis of disease-resistant substances catechins. Total RNA was isolated from the infected bark ofPopulus×euramericanacv.‘Zhonglin 46’ 6 days after inoculation withLonsdalea quercinasubsp. populi. A speci fi cLARfragment of about 1000 bp was ampli fi ed by RT-PCR and sequenced, and then successfully constructed into an expression vector with sense-orientation driven by CaMV 35S promoter (pCAMBIA1301-LAR). Subsequently, Pcambia1301-LARwas transformed into tobacco usingAgrobacterium tumefaciensmediated method. Six transgenic lines was fi nally obtained and con fi rmed by PCR. qRT-PCR was further used to detect the expression ofLARin transgenic tobacco, which showed thatLARgene was signi fi cantly upregulated in transgenic lines compared to the wild type. High performance liquid chromatography (HPLC) was further used to detect the content of catechin in transgenic plants and wild type plants respectively. The results showed that the content of catechin in 4 transgenic plants were increased, however there were no catechin detected in 2 transgenic plants. The study shown thatLARofPopulus×euramericanacv.‘Zhonglin 46’is one of genes involved in fl avonoids biosynthesis pathway and is associated with the synthesis of catechin, which provides insights to the molecular mechanism ofLARcontrolling catechin synthesis and the utilization of resistance genes in the improvement of plant disease resistance.

fl avonoids;Leucoanthocyanidin reductasegene; sense expression vector; transformation; catechin

S792.11；S718.46

A

1673-923X(2016)12-0121-08

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.021

http: //qks.csuft.edu.cn

2016-03-29

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201104054）；國家自然科學(xué)基金（31470668, 31200511, J1103516）

左 濤，碩士研究生

賀 偉，教授，博士研究生；E-mail：hewei@bjfu.edu.cn

左 濤，包 海，陳 慧，等. 楊樹LAR基因的克隆及表達(dá)對(duì)兒茶素合成的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2016, 36(12):121-128.

[本文編校：文鳳鳴]