基于ISSR標記的鉤栗遺傳多樣性分析

田艷伶，李志輝

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；2.益陽市林業(yè)科學研究所，湖南 益陽 413000）

基于ISSR標記的鉤栗遺傳多樣性分析

田艷伶1，2，李志輝1

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，湖南 長沙 410004；2.益陽市林業(yè)科學研究所，湖南 益陽 413000）

利用 ISSR分子標記對鉤栗Castanopsis tibetanaHance 9個野生居群進行了遺傳多樣性分析。利用100條引物分別對111份鉤栗基因組DNA進行PCR擴增，共擴增出158條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶141條，多態(tài)性條帶百分率（P）平均為89.01%。鉤栗9個居群的Nei’s基因多樣性指數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)分別為0.332 3、0.492 0；總種群基因多樣度（Ht）、各種群基因多樣度分別為（Hs）0.410 8、0.334 6，表明鉤栗的遺傳多樣性較高。9居群的基因分化系數(shù)Gst為 0.185 5，占總遺傳多樣性的 81.45%。分子方差分析表明，80.21%的遺傳差異存在于群體內(nèi)，19.79%的遺傳差異存在于群體間?；蛄鳛?.196 0。用NTSYS 軟件計算出9居群111材料的DICE相似系數(shù)在0.811 6～0.921 8 之間，遺傳親緣關系較近。各居群間的遺傳距離差異較大；其中，邵武與建甌居群的遺傳距離最近，僅為0.081 5； 瀏陽和周寧居群的遺傳距離最遠，為 0.198 4。聚類分析結果表明，采自福建的邵武、建甌、建陽、屏南和周寧居群聚在一起；恩施和桑植居群聚在一起；永順和瀏陽居群聚為一起，種群遺傳變異分布模式基本上與其地理生態(tài)格局一致。研究結果表明：供試的鉤栗具有較高的遺傳多樣性，存在著較為頻繁的基因交流；基于 ISSR 標記分析能較準確地揭示出鉤栗種間的遺傳多樣性。

鉤栗；ISSR標記；遺傳多樣性；基因分化；聚類分析

鉤栗Castanopsis tibetanaHance為殼斗科錐屬樹種，又名鉤錐，鉤栲。為常綠闊葉高大喬木，樹冠渾厚，葉大蔭濃，高達30 m；堅果扁圓錐形，花期4～5月，果次年8～10月成熟[1]。鉤栗材質(zhì)堅硬，耐水腐，為優(yōu)良的建筑、車船、家具和室內(nèi)裝飾用材[2]，兼具用材、綠化、木本糧食等多種功能。其屬紅錐類，且萌發(fā)力強，天然更新良好，生長速度較快，是長江以南常見的主要用材樹種，也是具有重要開發(fā)前景的珍貴用材樹種。

目前，關于鉤栗方面的研究還比較少見，僅限于鉤栗種群生態(tài)及生命表分析[4-5]、種子特性[6-7]與播種育苗[8-9]等方面,對其多樣性特別是分子水平上的遺傳多樣性研究未見報道。且野生鉤栗分布廣、遺傳背景復雜，現(xiàn)存的鉤栗常散生于常綠闊葉林中，居群規(guī)模小、天然更新長期停留在幼苗階段，居群處于衰退狀態(tài)[1,3,6]。

因此，推進鉤栗遺傳多樣性及遺傳結構研究，對挖掘利用鉤栗野生種質(zhì)資源和開展種質(zhì)創(chuàng)新有著重要的意義，可為鉤栗珍貴用材林的營建、應用和推廣提供必要的理論依據(jù)。

簡單序列重復間區(qū)或微衛(wèi)星引物PCR(Microsatellite-Primed PCR)，也稱作錨定簡單序列重復（Anchored Simple Sequence Repeat）由加拿大蒙特利爾大學的Zietkiewicz[10]等于1994年提出。ISSR 分子標記技術操作簡單，實驗過程快速，不需要先知道模板 DNA 的序列，引物設計簡單，耗資少，同時多態(tài)性高，實驗結果重復性好，是物種遺傳多態(tài)性分析、遺傳結構及指紋圖譜構建等研究的有效手段[11]?，F(xiàn)己廣泛應用于種質(zhì)資源鑒定、系統(tǒng)發(fā)育及親緣關系等方面[12-13]，因而是研究植物遺傳多樣性理想的分子標記技術之一。

本研究首次采用ISSR分子標記技術對鉤栗9個種群共111個樣本的遺傳多樣性和遺傳結構進行研究，揭示不同地理分布區(qū)鉤栗種群的遺傳關系；探討鉤栗種群的遺傳分化趨勢，闡明不同生境條件對種群遺傳多樣性的影響；構建了樹狀聚類圖譜，通過聚類分析方法對鉤栗不同居群進行了遺傳關系的研究，為良種選育及野生錐栗資源的背景分析、保護及開發(fā)利用提為鉤栗種質(zhì)資源有效保護與合理利用以及制定鉤栗良種繁育策略提供供理論參考和科學依據(jù)。

表1 供試材料來源及環(huán)境因子Table 1 Tested materials sources and environment factors

1 材料和方法

1.1 實驗材料

于2013年在湖南省汨羅市玉池國有林場建立鉤栗種質(zhì)資源收集圃收集到分別來自湖南、湖北、福建等3省區(qū)的鉤栗種質(zhì)資源，對要用于種質(zhì)資源遺傳分析的樣本，野外采取集幼嫩葉片，裝于編號的錫箔紙中，再將錫箔紙包好放于硅膠中干燥封存，運回實驗室后放放入-80℃度的超低溫冰箱永久保存。各份種質(zhì)材料的編號和采集地如（表1）所示。

所用儀器和試劑： Eppendorf Centrifuge 5415R冷凍離心機，GeneAmp PCR System 9700擴增儀，電熱恒溫水浴鍋，WH-2微型旋蝸混合儀，DYY-12型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，Bio-Rad紫外凝膠成像儀；參考加拿大哥倫比亞大學(UBC) 的引物設計ISSR 引物，并由上海英駿生物技術有限公司合成；Marker由廣州東盛生物科技有限公司提供；Taq DNA 聚合酶、dNTPs 和 10×PCR buffer 等購自TINGEN公司；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、0.5 mol/L EDTA (pH8.0)、Tris-base、β-琉基乙醇、1xTBE溶液、瓊脂糖溴化乙淀(EB)、Buffer等購自長沙隆和化玻實驗用品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鉤栗總DNA提取

每個鉤栗樣品秤取30 mg，液氮中充分碾磨，使用TIANGEN公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA[14]。且將獲得的總DNA產(chǎn)物按一定比例溶解于滅菌雙蒸水中，置于-20 ℃的冰箱儲存、備用。

1.2.2 ISSR分析

本實驗研究通過參照錐栗ISSR遺傳分析中引物篩選的方法[15]，通過100個ISSR引物對來自不同居群的3個鉤栗DNA模板進行PCR擴增，共篩選出10條普帶清晰，信號強且，重復性好且擴增結果穩(wěn)定的引物（見表2），用于鉤栗遺傳結構分析。

實驗采用的最佳反應體系為：20 μL中含30 ng模 板 DNA，3mmol/L Mg2+，0.4 mmol/L dNTPs，0.75 U Taq DNA聚合酶，0.3 μmol/L引物，用純水補足。鉤栗ISSR-PCR反應擴增程序為：94 ℃預變性2 min；然后于94℃變性30 s、50～59.3 ℃退火30 s（根據(jù)不同引物的Tm值而設定具體退火溫度）、68 ℃延伸150 s，共40個循環(huán)；最后于72 ℃延伸7 min保存[14]。用質(zhì)量體積分數(shù)為0.7 %的瓊脂糖凝膠檢測鉤栗DNA的提取濃度及其質(zhì)量。

1.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

本實驗利用Quantity One軟件與人工讀取條帶相結合，按凝膠同一位置上DNA條帶的有無進行統(tǒng)計，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，建立原始“01”矩陣。按照Nei等[16]的方法，利用 POPFENE Version1.32、NTSYS Version2.10 及AMOVA等軟件對9個居群111個鉤栗樣本的遺傳多樣性、遺傳結構、遺傳距離與相似性、居群聚類結果等進行遺傳分析。

2 結果與分析

2.1 ISSR－PCR 擴增結果分析

利用優(yōu)化的反應體系從100 條引物中篩選出10條穩(wěn)定性強、 重復性好、 多態(tài)性豐富的引物，10條引物的序列以及擴增結果見（表2）。 然后利用篩選出的10條引物對111 個供試樣品的基因組 DNA 進行 PCR 擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳得到部分指紋圖譜（圖1-2）。不同引物組合擴增的多態(tài)性條帶數(shù)均不相同，在250～2 000 bp 內(nèi)共擴增出158條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶141條，多態(tài)性條帶百分率（P）平均為89.01%。每個引物擴增的條帶數(shù)目在13～19條之間，平均每條引物擴增出15.8條條帶。其中，用引物UBC846 擴增獲得的條帶數(shù)最少，僅13條；用引物UBC880擴增獲得的條帶數(shù)最多，達19條。除引物UBC830之外，其余的 ISSR 引物擴增獲得的PPB均大于85.0%，且引物UBC842擴增的PPB均達到 100.0%。每個居群的多態(tài)性條帶百分率在84.81%～93.67%之間，其中周寧居群最低，永順居群最高。由此可見，供試的9個鉤栗居群具有較豐富的遺傳變異和遺傳多樣性。

表2 用于鉤栗基因組總DNA ISSR -PCR的隨機引物堿基序列及擴增結果Table 2 Base sequences of random primers used for ISSRPCR ofgenomic total DNA of Castanopsis tibetana Hance and its amplified results

圖1 821號引物在優(yōu)化后的體系下擴增20個樣品的PCR結果Fig.1 The PCR results of 20 specimens with primer 821 and optimized reaction system

圖2 880號引物在優(yōu)化后的體系下擴增23個樣品的PCR結果Fig.2 The PCR results of 23 specimens with primer 880 and optimized reaction system

2.2 鉤栗居群遺傳多樣性分析

應用POPGENE32遺傳分析軟件對得到的111個鉤栗樣品的“01”矩陣，按9個居群進行群體遺傳多樣性分析，結果見表3。從表3中可以看出各居群供試材料具有豐富的ISSR標記位點，鉤栗居群間基因交流頻繁，遺傳多樣性豐富，是鉤栗種質(zhì)創(chuàng)新的重要來源。其中，永順與邵武分別為湖南、福建省野生鉤栗居群遺傳多樣性最豐富的區(qū)域。

表3 基于ISSR 標記的9個鉤栗居群遺傳多樣性分析結果Table 3 Analysis result of genetic diversity of 9 populations of Castanopsis tibetana Hance based on ISSR marker

由表3可以看出，居群觀測等位基因數(shù)（Na）為1.897 9，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.733 0； Nei基因多樣性指數(shù)（H）值平均值為0.332 3，物種平均值為0.409 4，最大的是邵武（SW）居群為0.362 2，最小的是瀏陽（LY）居群僅為0.316 6。9個居群的Nei基因多樣性指數(shù)（H）值均低于0.4，參照前面提到的研究結果表明，參試的9個鉤栗居群的遺傳多樣性水平較低。鉤栗居群的Shannon’s信息指數(shù)（I）在0.549 4～0.531 3之間，平均值為0.492 0，物種平均值為0.593 6。從表3中還可以得出，邵武居群的Shannon’s信息指數(shù)（I）和Nei基因多樣性指數(shù)（H）均高于其他六個種群，即在參試的9個鉤栗居群中邵武居群的遺傳多樣性水平最高。

本研究進一步利用 AMOVA軟件[17]對鉤栗居群內(nèi)和居群間的分子變異進行了分析。從表4中的結果可以看出：鉤栗居群間變異占19.79%，居群內(nèi)變異占80.21%，居群內(nèi)和居群間的變異均極顯著（p＜0.001）。比較發(fā)現(xiàn)，AMOVA分析所得結果與Nei’s遺傳多樣性分析的結果基木一致。

2.3 不同種源間的遺傳距離及聚類分析

根據(jù)ISSR擴增結果組成二元數(shù)據(jù)矩陣，用POPGENE 32軟件計算9個鉤栗居群的遺傳相似系數(shù)（表5），結果表明：邵武（SW）和建甌（JO）居群的遺傳距離最近，僅為0.081 5，相似系數(shù)為0.921 8，表明親緣關系很近。瀏陽（LY）與周寧（ZN）居群的遺傳距離最遠，為0.198 4，相似系數(shù)為0.811 6，表明親緣關系很遠，可能與其分布地距離相對較遠、生長環(huán)境差異較大有關；參試鉤栗居群的遺傳距離平均值為0.137 9，平均相似度為0.871 4。根據(jù)不同居群親緣關系的遠近，可為今后鉤栗育種親本選擇提供理論參考。

進一步計算不同鉤栗居群間的遺傳距離，依據(jù)遺傳距離進行UPGMA聚類分析，從而獲得9個不同鉤栗居群間的ISSR系統(tǒng)聚類圖（圖3）。從圖11可以看出，當λ=0.88時，9個鉤栗居群聚為6支，周寧、桑植、恩施、永順和瀏陽各單獨聚為一支；而來自福建屏南的居群聚為一支。且屏南居群又分為兩個亞支，建陽居群為1個亞支，地理距離最近的邵武和建甌居群聚為1個亞支。從下面聚類圖可以看出，不同的居群的聚類規(guī)律符合其在空間上的地理位置，福建省的邵武、建甌、建陽、屏南和周寧居群聚在了一支；湖北的恩施居群與湖南張家界的桑植居群在地理位置上臨近，故也聚為一支；湖南的永順居群與瀏陽居群則獨自聚為一支。

表4 鉤栗居群間和居群內(nèi)分子變異的AMOVA分析結果Table 4 Analysis of moleculuar variance (AMOVA)within/among Castanopsis tibetana Hance populations

表5 遺傳一致性(上)和遺傳距離表(下)?Table 5 Nei’s unbiased measures of genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

圖3 基于ISSR 標記的 5 個鉤栗居群的 UPGMA 聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of fi ve populations of Castanopsis tibetana Hance based on ISSR marker

2.4 基因分化

通過POPGENE 軟件對9個鉤錐居群進行遺傳分化分析（表6），得出總種群基因多樣度（Ht）、各種群基因多樣度（Hs）0.410 8、0.334 6，基因流為2.196 0；種群間遺傳分化系數(shù)（Gst）為（Gst=(Ht-Hs)/Ht）為0.185 5，這表明遺傳變異大部分存在于居群內(nèi),即居群內(nèi)的遺傳變異占總變異量的81.45%，而只有18.55%的遺傳變異存在于居群間。由此可知，參試鉤栗的遺傳變異以居群內(nèi)遺傳變異為主。

表6 基于ISSR分析的鉤栗遺傳變異Table 6 Analysis of genetic variation for Castanopsis tibetana Hance by ISSR

3 討 論

本研究中，用10個ISSR隨機引物對鉤栗9個居群的基因組DNA進行擴增，得到了158條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶有141條，多態(tài)性條帶百分率達到89.01%，根據(jù)條帶的差異可以較好地將供試的9個居群區(qū)分開來。一般情況下，如果多態(tài)性條帶百分率超過 50%，就可以認為該物種有較為豐富的遺傳多樣性[18-19]。Hamrick[20]等也指出：多數(shù)多年生木本樹種平均多態(tài)位點百分數(shù)為 65%。由此可知，供試的鉤栗有豐富的遺傳多態(tài)性，利用ISSR分子標記技術能快速準確地檢測其遺傳變異，也為鉤栗提供了分子標記輔助選擇與評價的技術方法。總之，從反映物種遺傳多樣性的多個參數(shù)上，包括物種水平的 Nei’s 基因多樣度(0.409 4) 和Shannon’s 多樣性指數(shù) (0.593 6)等，均表明鉤栗種內(nèi)的遺傳多樣性十分豐富，對其生存環(huán)境有很強的適應能力。其中，Nei’s 基因多樣度還高于一般針闊葉樹種的估算值(0.206)[21]。無論是在物種水平上，還是在居群水平上，本研究結果均反映出鉤栗具有非常豐富的遺傳多樣性水平和較高的遺傳變異度。

由于地理分布隔離的原因，鉤栗在長期的自然選擇和遺傳變異過程中基因頻率必然發(fā)生變化，某些基因位點可能消失。在多位點檢測的基礎上通過計算遺傳距離并利用聚類分析進行種的識別，具有較高的可靠性[22]。研究結果表明，不同的居群的聚類規(guī)律符合其在空間上的地理位置，福建省的邵武、建甌、建陽、屏南和周寧居群聚在了一支；湖北的恩施居群與湖南張家界的桑植居群在地理位置上臨近，故也聚為一支；湖南的永順居群與瀏陽居群則獨自聚為一支，說明兩者較其他居群的遺傳差異相對較大。研究表明：同種居群間的遺傳距離一般為 0.03 ～0.20、相似系數(shù)一般為 0.80 ～0.97[23]。9個鉤栗居群間存在著一定的遺傳分化，是因為其受環(huán)境差異和地理隔離等因素的影響，然而，根據(jù)Thorpe等研究者的標準理論值來看，這9個鉤栗居群仍然屬于同一地理群體。

從反映物種遺傳多樣性的多個參數(shù)上，包括物種水平的 Nei’s 基因多樣度(0.409 4) 、Shannon’s 多樣性指數(shù)(0.593 6)和多態(tài)性條帶百分率(89.01%) 等，均表明了鉤栗種內(nèi)的遺傳多樣性較為豐富，且Nei’s 基因多樣度還高于已發(fā)表的一般針闊葉樹種的估算值(0.206)[21]。

由于本研究的實驗材料采樣不完整，只取自湖南、湖北、福建3個省份的9個樣地，故并不能完全說明鉤栗的全部遺傳背景。若要全面了解鉤栗的遺傳背景，仍需擴大鉤栗種質(zhì)資源的收集范圍，最好對已發(fā)現(xiàn)的具有代表性的省份（如浙江、廣西、云南等）進行樣品采集，并采用多種方法對鉤栗進行遺傳多樣性和遺傳結構的研究分析，為科學地經(jīng)營、管理、保護和利用鉤栗種質(zhì)基因資源，維持其豐富的遺傳育種潛力和遺傳多樣性奠定基礎。

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Genetic diversity analysis of Castanopsis tibetana Hance based on ISSR marker

TIAN Yan-ling1,2, LI Zhi-hui1
(1. School of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. Yiyang Forestry Instritue, Yiyang 413000, Hunan, China)

The genetic diversity of nineCastanopsis tibetanaHance populations were analyzed using inter-simple sequence repeat(ISSR) markers. 10 ISSR primers were screened out from l00 primers from UBC for amplifying 111 genomic DNA ofCastanopsis tibetanausing ISSR-PCR. 158 intensive bands were amplified, among which there were 141 polymorphic bands. The polymorphic loci percentage (P) was 89.01%. The Nei’s genetic diversity index, Shannon’s information, number of total genetic diversity index,genetic diversity index are 0.3323, 0.4920, 0.4108, 0.3346. They showed that genetic diversity ofCastanopsis tibetanawas high. Genetic differentiation coef fi cient (Gst) ofCastanopsis tibetanawere 0.1855, it indicated that the variation within population account 81.45%.The results by AMOVA analysis indicated that the variation within population account for 80.21% and variation among populations accounted for 19.79% . As analyzed by NTSYS, the genetic similarity ranged from 0.811 6 to 0.921 8 based on DICE. The genetic relationships among the 111 materials were relatively close. Genetic distance among all populations differs obviously, in which, that between populations of Shaowu and Jianou is the nearest(only 0.0815) while that between populations of Liuyang and Zhouning is the farthest (0.1984). Cluster analysis showed that Shaowu, Jianou, Jianyang, Pingnan and Zhouning populations clustered together. Enshi and Sangzhi population grouped together. Yongshun grouped together with Liuyang population. It was a further indicator that genetic variation of populations and its geographic pattern was basic consistency. It is suggested that populations ofCastanopsis tibetanaHance tested possess higher genetic diversity，and there are frequent gene exchange. The genetic diversity ofCastanopsis tibetanaHance can be accurately revealed by means of ISSR marker analysis.

Castanopsis tibetanaHance; ISSR marker; genetic diversity; gene differentiation; cluster analysis

S718.46

A

1673-923X(2016)12-0129-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.12.022

http: //qks.csuft.edu.cn

2014-10-22

國家林業(yè)行業(yè)公益性項目“珍貴樹種鉤栗良種選育及栽培關鍵技術研究”（201204405）

田艷伶，碩士研究生

李志輝，教授，博士生導師，博士；E-mail:lzh1957@126.com

田艷伶，李志輝. 基于ISSR標記的鉤栗遺傳多樣性分析[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016, 36(12): 129-134, 139.

[本文編校：文鳳鳴]