莫旭東，鄧東京，覃 磊，才桑吉，莫 祎，夏石頭*

(1 植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128； 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)際學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

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擬南芥SNC1基因突變對(duì)植株細(xì)胞分生和抗氧化性狀的影響

莫旭東1，2，鄧東京3，覃 磊1，2，才桑吉2，莫 祎2，夏石頭1，2*

(1 植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410128； 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；3 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)際學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

以擬南芥snc1突變體、其抑制子突變體mos4snc1和Col-0野生型植株為材料，研究了SNC1基因突變對(duì)植株細(xì)胞分生和抗氧化性狀的影響。結(jié)果表明，snc1植株平均比Col-0植株矮65.05%，其第3、4片真葉平均長(zhǎng)度比Col-0的短53%，葉片平均寬度比Col-0的窄51%，角果莢平均短9.48%，平均種子數(shù)量少20.69%。與Col-0野生型植株相比，snc1植株第1、2片真葉細(xì)胞數(shù)目平均減少53.14%，而第3、4葉細(xì)胞數(shù)目平均減少61.88%；snc1突變體的SOD、POD、CAT酶活性和植株中花青素積累量均極顯著高于Col-0野生型植株的，而snc1的抑制子突變體mos4snc1則恢復(fù)了野生型表型，其SOD、POD酶活性和花青素含量與Col-0野生型植株的沒有顯著差異。這說明SNC1基因突變嚴(yán)重影響了擬南芥植株的細(xì)胞分生和抗氧化性能力，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目大幅度減少，株型矮小。

擬南芥；SNC1；細(xì)胞分生；抗氧化性狀

植物抗性(Resistance，R)基因編碼蛋白能有效針對(duì)病原菌快速誘導(dǎo)防御反應(yīng)，從而保證植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育[1]。植物和病原菌的相互識(shí)別會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧，由于病原菌的無毒基因和植株抗性基因識(shí)別后的型號(hào)傳遞激活了各類防衛(wèi)反應(yīng)，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)迸發(fā)是過敏性反應(yīng)的特征，因此，植物的抗病性一定程度上會(huì)影響到植物的抗氧化性。在沒有病原菌攻擊時(shí)，抗性蛋白水平須受嚴(yán)格控制，以防止抗性途徑不必要激活而導(dǎo)致自身免疫的潛在傷害與生長(zhǎng)缺陷[1]。在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，植物體內(nèi)存在一個(gè)完備的清除ROS的防御機(jī)制，其體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除會(huì)維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡之中[2]。然而當(dāng)植物遇到脅迫時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被破壞，而隨著植物受到脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)和受脅迫程度加重，體內(nèi)ROS清除系統(tǒng)的功能會(huì)逐漸降低，ROS會(huì)逐漸累積而導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過氧化并發(fā)生自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，膜功能受到傷害[3]。ROS酶促清除系統(tǒng)主要是超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等，通過這些酶活性的高低可以在一定程度上反應(yīng)出植物抗性的強(qiáng)弱?；ㄇ嗨匾彩且环N自由基清除劑，它能和蛋白質(zhì)結(jié)合防止其過氧化，在同等生長(zhǎng)情況下花青素的含量也能一定程度上反應(yīng)出植株的抗氧化性[4]。

擬南芥SNC1(suppressorofnpr1-1，constitutive1)是植物細(xì)胞內(nèi)的一種TIR-NB-LRR (Toll/interleukin-1 receptor-Nucleotide Binding-Leucine Rich Repeat)類R蛋白編碼基因，其序列中的一個(gè)堿基點(diǎn)突變導(dǎo)致SNC1蛋白氨基酸序列中的一個(gè)谷氨酸(Glu)變成了賴氨酸(Lys)，從而組成型激活了病程相關(guān)蛋白如PR1和PR2的持續(xù)高表達(dá)，導(dǎo)致snc1突變體植株株型矮小，葉片卷曲，屬于獲得功能型突變體[5]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，snc1的一個(gè)抑制子突變可部分抑制其抗病途徑的組成型激活與SNC1介導(dǎo)的抗病表型，使mos4 (modifierofsnc1-1，4)植株恢復(fù)野生型表型[6，7]。為進(jìn)一步深入探討SNC1基因持續(xù)激活對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究以擬南芥snc1突變體、其抑制子突變體mos4snc1和野生型Col-0植株為材料，通過檢查其生長(zhǎng)表型、葉片細(xì)胞數(shù)目、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)酶活性與花青素含量，一定程度上反映出SNC1基因突變對(duì)snc1植株細(xì)胞分生增殖與抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為野生型擬南芥(Col-0生態(tài)型)；snc1突變體和mos4snc1雙突變體，由加拿大UBC李昕實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

NBT(Nitro Blue Tetrazolium Chloride，硝基四氮唑藍(lán))、MET(L-Methionine，L-甲硫氨酸)、愈創(chuàng)木酚等購(gòu)自博美生物科技有限責(zé)任公司；碘化丙啶(PI)、四鹽酸精胺購(gòu)自Sigma公司；正丙醇、核黃素、MES(Methyl Methanesulfonate，甲磺酸甲酯)、纖維素酶(cellulose R10)、離析酶(macerozyme R10)、甘油和β-巰基乙醇購(gòu)自鵬程生物有限公司；其他常規(guī)藥品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)所需試劑：種子消毒液使用15%NaClO + 0.1% Tween20進(jìn)行配置。0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)，首先配置好AB貯備液，分別為貯備液A：0.2 mol/L NaH2PO4溶液，貯備液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液，然后分別取貯備液A 87.7 mL與貯備液B 12.3 mL，充分混勻并稀釋定容至200 mL。POD反應(yīng)混合液的配置是使用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50 mL，過氧化氫(H2O2)28 μL和愈創(chuàng)木酚19 μL充分混勻得到。0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.8)的配置是分別取貯備液A 8.5 mL與貯備液B 91.5 mL，充分混勻并稀釋至200 mL。其他使用到的藥劑還有0.026 mol/L蛋氨酸(Met)磷酸鈉緩沖液；7.5×104mol/L硝基四氮唑藍(lán)(NBT)溶液；2×10-5mol/L核黃素溶液含1.0 μmol/L EDTA；0.05 mol/L pH7.8磷酸鈉溶液；0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.0)等。花青素提取液的配置是由正丙醇∶鹽酸∶水=18∶1∶81混合；0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液；0.2 mol/L H2O2溶液：30% H2O211.36 mL溶于磷酸緩沖液中，定量至250 mL。細(xì)胞數(shù)目檢測(cè)用到的試劑按照文獻(xiàn)[8]方法配制。

1.2 種子的播種與管理

按照Xia等[9，10]的方法，將適量擬南芥種子用種子消毒液殺菌消毒3～5 min后，用蒸餾水清洗兩次，加入0.1%的瓊脂糖使種子重懸，在4℃下避光春化3～4 d。分散種入培養(yǎng)缽后再將培養(yǎng)缽放置在光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為16 h光照(23℃) + 8 h(21℃)黑暗、濕度40%～50%。

當(dāng)幼苗長(zhǎng)出2～3片真葉時(shí)，將幼苗移栽至小培養(yǎng)缽中，每缽4株，并根據(jù)土壤水分蒸發(fā)情況，每隔2～3 d澆一次水，保持土壤濕潤(rùn)，移盆后約35 d可進(jìn)行各種生理指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞數(shù)目測(cè)定方法

取苗齡約35 d的擬南芥真葉葉片，參照文獻(xiàn)[8]的方法用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)。

1.4 酶活性檢測(cè)方法

過氧化物酶(POD)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]方法略作修改。幼苗移栽后約35 d，選取長(zhǎng)勢(shì)、大小、形態(tài)一致的snc1、mos4snc1和Col-0野生型植株幼苗，每株取第3～8片新鮮真葉共約0.2 g放入研缽中，加入1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液，在冰上將其研磨成勻漿，用移液器將勻漿轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，再以1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入同一EP管中。4000 rpm離心5 min，再取上清1 mL至5 mL離心管中，加入3 mL pH7.8磷酸緩沖液，顛倒混勻。而后取1 mL酶液和3 mL POD反應(yīng)液置于石英比色皿中混勻，反應(yīng)5 min后測(cè)定OD470的光密度值。

超氧化物歧化酶(SOD)的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]方法略作修改。選取長(zhǎng)勢(shì)、大小、形態(tài)較為一致、移栽后約35 d的snc1、mos4snc1和Col-0野生型植株幼苗，每株取第3～8片新鮮真葉共約0.2 g置于研缽中，加入1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液，于冰上將其研磨成勻漿，用移液器將勻漿轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，再用1 mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸緩沖液沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入2 mL離心管。然后用冷凍離心機(jī)在4℃10 000 g離心30 min，取上清定容至4 mL。然后取潔凈且干燥的5 mL的微燒杯編號(hào)，按表1的順序加入酶液及各試劑，反應(yīng)系統(tǒng)總體積為3 mL。充分混勻后，取1個(gè)不加酶液的微燒杯對(duì)照組置于暗處，作為空白對(duì)照調(diào)零，再取2個(gè)對(duì)照組與試驗(yàn)組微燒杯一塊放在溫度為25℃，光強(qiáng)為6500 Lux的光照箱內(nèi)，照光處理20 min，然后立即遮光終止反應(yīng)。在560 nm波長(zhǎng)下用暗處理的溶液調(diào)零，測(cè)定試驗(yàn)組光密度值。

表1 反應(yīng)系統(tǒng)中各試劑及酶液的加入量(mL)Table 1 The amount of each reagent and enzyme liquid for the reaction system (mL)

過氧化氫酶(CAT)含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]方法略作修改。幼苗移栽后約35 d，選取長(zhǎng)勢(shì)、大小、形態(tài)較為一致的snc1，mos4snc1和Col-0野生型植株幼苗，每株取第3～8片新鮮真葉共約0.2 g放入研缽中，加入1 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液，在冰上將其研磨成勻漿，用移液器將勻漿轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，再用1 mL 0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液沖洗研缽，一并轉(zhuǎn)入2 mL離心管中。4000 rpm離心5 min，取上清1 mL至5 mL離心管中，加入3 mL pH7.0磷酸緩沖液，顛倒混勻。取0.1 mL酶液，加入0.05 mol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液1.4 mL和40 mmol/L H2O21.5 mL，于石英比色皿中，立即在波長(zhǎng)240 nm處檢測(cè)光密度值，每30 s讀數(shù)一次，共測(cè)定4 min。以不含酶液的待測(cè)液作為空白對(duì)照。

花青素含量的測(cè)定參照Shan等[13]方法稍作修改。幼苗移栽后約35 d，選取長(zhǎng)勢(shì)、大小、形態(tài)較為一致的snc1、mos4snc1和Col-0野生型植株，去根，清洗去泥沙，再用濾紙吸干多余水分。取10株植物做為一個(gè)樣品，稱重后放入2 mL帶扣的防爆離心管中。加入1 mL提取液，100℃水浴3 min(當(dāng)心爆管)，用鑷子取出樣品，遮光暗處理至少12 h。用分光光度計(jì)測(cè)定樣品的A535與A650光密度值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Col-0野生型、snc1和mos4snc1突變體植株形態(tài)特征

在同樣培養(yǎng)條件下，snc1突變體植株幼苗與Col-0野生型和其抑制子突變體mos4snc1植株幼苗明顯不同，snc1突變體幼苗株型矮小，葉片卷曲，成株果莢較Col-0野生型的短，種子較少。而snc1的抑制子突變體mos4snc1植株恢復(fù)了其野生型表型(圖1)。

為量化這種差異特征，統(tǒng)計(jì)分析了移栽后約60 d的Col-0野生型、snc1和mos4snc1突變體植株的株高，葉片長(zhǎng)度、寬度，果莢長(zhǎng)度和每果莢種子數(shù)目等。結(jié)果snc1植株比Col-0植株平均矮65.05%，其第3、4片真葉平均長(zhǎng)度比Col-0的短53%，葉片

圖1 Col-0野生型、snc1和mos4snc1突變體幼苗的形態(tài)Fig.1 Morphology of wild type (Col-0)，snc1 and mos4 snc1 seedlings

平均寬度比Col-0的窄51%，角果莢平均短9.48%，平均種子數(shù)量少20.69%(表2)。而snc1的抑制子突變體mos4snc1則恢復(fù)了野生型表型，與Col-0野生型植株沒有顯著差異。說明snc1基因突變嚴(yán)重影響了擬南芥植株生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植株矮小，葉片變小，果莢變短等表型。

表2 Col-0野生型、snc1和mos4snc1突變體植株的形態(tài)指標(biāo)比較Table 2 Morphological parameters of the wild type Col-0，snc1 and mos4snc1 plants

2.2 SNC1基因突變對(duì)snc1植株細(xì)胞分生增殖的影響

為進(jìn)一步檢測(cè)snc1突變體植株的矮小株型主要是細(xì)胞數(shù)目減少引起的還是由單個(gè)細(xì)胞體積變小所引起的，分別檢測(cè)了植株的第1、2片和第3、4片真葉的細(xì)胞數(shù)目(圖2)。結(jié)果表明，野生型Col-0第1、2片真葉的細(xì)胞數(shù)目平均約為每葉4.95×104個(gè)，snc1突變體平均約為每葉2.32×104個(gè)，Col-0野生型植株的第1、2片真葉的平均細(xì)胞數(shù)目是snc1突變體的2.13倍，而mos4snc1突變體平均約為每葉4.39×104個(gè)，與野生型植株的第1、2片真葉的平均細(xì)胞數(shù)目沒有顯著性差異。Col-0第3、4片真葉的平均細(xì)胞數(shù)目(平均約為每葉1.12×105)是snc1第3、4片真葉的平均細(xì)胞數(shù)目(約為每葉4.27×104)的2.62倍，而mos4snc1第3、4片真葉的平均細(xì)胞數(shù)目約為每葉9.49×104。這表明snc1基因突變導(dǎo)致了葉片細(xì)胞數(shù)目大幅度減少，其中第1、2葉細(xì)胞平均減少了53.14%，而第3、4葉細(xì)胞平均減少了61.88%，說明snc1基因突變削弱了植株細(xì)胞分裂的增生能力。

圖2 野生型(Col-0)、snc1和mos4snc1突變體植株真葉細(xì)胞核數(shù)目Fig.2 Cell nuclei numbers of the leaves in wild type(Col-0)，snc1 mutant and mos4snc1 mutant plants

2.3 SNC1基因突變對(duì)snc1植株細(xì)胞抗氧化脅迫酶活性的影響

植物抗性反應(yīng)的激活常伴隨著細(xì)胞內(nèi)氧化還原性狀的改變?nèi)缁钚匝醣虐l(fā)。為深入分析SNC1基因突變對(duì)植株細(xì)胞的抗氧化脅迫性狀的影響，分別檢測(cè)了生長(zhǎng)約35 d的擬南芥Col-0野生型、snc1和mos4snc1突變體植株葉片的SOD、POD和CAT酶活性，結(jié)果如表3。由表3可知，在同樣生長(zhǎng)條件下，snc1突變體的SOD、POD、CAT酶活性顯著高于Col-0野生型植株的，表明snc1體內(nèi)因病程相關(guān)蛋白的組成型表達(dá)導(dǎo)致持續(xù)的氧脅迫，因此在一定程度上需要高活性SOD、POD、CAT酶來清除ROS，以幫助突變體植株適應(yīng)這種氧化脅迫環(huán)境。而mos4snc1突變體則抑制了SNC1的組成型表達(dá)，恢復(fù)了其野生型表型，植株生長(zhǎng)也恢復(fù)正常，因此mos4snc1突變體的POD、SOD酶活性與野生型植株的POD、SOD酶活性沒有顯著差別。

2.4 SNC1基因突變對(duì)snc1植株細(xì)胞花青素積累的影響

植株的抗氧化脅迫能力可能影響到植株體內(nèi)花青素的積累。統(tǒng)計(jì)分析表明，同等生長(zhǎng)條件下，snc1、mos4snc1植株中花青素含量顯著高于Col-0植株體內(nèi)花青素含量，而mos4snc1的花青素含量則低于snc1突變體植株，但兩者之間沒有顯著差別(表3)。

表3 SNC1基因突變植株的POD、SOD、CAT酶活性和花青素含量Table 3 Effects of SNC1 gene mutation on enzyme activities of POD，SOD，CAT and Anthocyanins content

3 結(jié)論與討論

擬南芥snc1 (suppressorofnpr1-1，constitutive1)是在研究植物先天免疫反應(yīng)，篩選npr1(nonexpresserofPRgenes)的抑制子突變體時(shí)找到的一個(gè)功能獲得型點(diǎn)突變體。該突變體中病程相關(guān)蛋白如PR1和PR2等持續(xù)高表達(dá)，對(duì)病原微生物的抗性顯著增強(qiáng)，并導(dǎo)致snc1突變體葉片卷曲，株型矮小[5]。圖位克隆結(jié)果表明，該突變基因編碼蛋白是植物中的一種TIR-NB-LRR (Toll/interleukin-1 receptor-Nucleotide Binding-Leucine Rich Repeat)類R蛋白，其基因的突變導(dǎo)致氨基酸序列中的一個(gè)谷氨酸(Glu)變成了賴氨酸(Lys)，導(dǎo)致SNC1蛋白在snc1突變體中的穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而組成型激活了snc1植株中PR1和PR2等病程相關(guān)蛋白高表達(dá)。為了探討SNC1基因突變對(duì)植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究以擬南芥野生型Col-0、突變體snc1植株與其抑制子雙突變體mos4snc1為材料，檢測(cè)基因突變對(duì)植物細(xì)胞分生增殖的影響和細(xì)胞抗氧化性狀的影響，發(fā)現(xiàn)基因突變導(dǎo)致snc1植株第3、4片真葉平均比Col-0野生型植株的第3、4片真葉短53%、窄51%，植株比野生型植株平均矮65.05%，其角果莢平均短9.48%，平均種子數(shù)量少20.69%。說明SNC1基因突變嚴(yán)重影響了擬南芥植株生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致葉小，植株矮小，果莢變短。而其抑制子突變體mos4snc1則與Col-0野生型植株沒有顯著差異。

為進(jìn)一步分析snc1的矮小株型是否由細(xì)胞體積變小所引起，本研究通過葉片酶解，細(xì)胞裂解和細(xì)胞核收集后染色，用流式細(xì)胞儀詳細(xì)檢測(cè)了Col-0野生型、snc1和mos4snc1雙突變體植株的細(xì)胞數(shù)目，結(jié)果顯示Col-0植株的第1、2片真葉平均細(xì)胞數(shù)目是snc1植株第1、2片真葉平均細(xì)胞數(shù)目的2.13倍，第3、4片真葉的平均細(xì)胞數(shù)目是snc1第3、4片真葉的2.62倍。而抑制子植株mos4snc1與野生型植株之間沒有顯著差別，證明SNC1基因突變削弱了植株細(xì)胞的分生增殖能力，從而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目減少，植株變矮。

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Effects ofSNC1 Gene Mutation on Cell Proliferation and Antioxidation Character inArabidopsisthaliana

MO Xudong1，2，DENG Dongjing3，QIN Lei1，2，CAI Sangji2，MO Yi2，XIA Shitou1，2*

(1 Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development，Changsha，Hunan 410128，China；2 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；3 International College，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

Wild type Col-0，snc1 mutant and its suppressormos4snc1 double mutant plants was used as materials to study the effects ofSNC1 gene mutation on cell proliferation and antioxidation character inArabidopsisthaliana.The results showed that the average plant height ofsnc1 was 65.05% shorter than that of Col-0 wild type plants，with the average blade length and width of the third and 4thtrue leaf reduced by 53% and 51%，average silique length and numbers of seeds per silique reduced by 9.48% and 20.69%，respectively.Compared with the wild type plants，cell number of the first and second true leaves decreased 53.14%，and that of the third and 4thleaves insnc1 mutants decreased 61.88%.The activity of superoxide dismutase (SOD)，peroxidase (POD) and catalase (CAT) enzyme insnc1 mutants was significantly higher than that of the wild type plants.The accumulation of anthocyanin in snc1 was also significantly higher than that of the wild type plants.The mutated phenotype was restored to wild type inmos4snc1 double mutant.As a result，there is no significant difference for the activity of SOD and POD betweenmos4snc1 double mutant and wild type plants.It is suggested that the cell proliferation and antioxidation character is severely affected bySNC1 gene mutation which leads to the cell number reduction and plant drawf with snc1 gene.

Arabidopsis；SNC1；cell division and proliferation；oxidation resistance

2016-05-05

莫旭東(1989-)，男，碩士研究生。 *通信作者：夏石頭，教授，Email：xstone0505@163.com。

湖南省自然科學(xué)杰出青年基金項(xiàng)目(11JJ1007)。

Q786

A

1001-5280(2016)05-0557-06

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.05.18