皇甫和平 ， 許文博 ， 石冬梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046)

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奶牛蜂窩織炎奇異變形桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

皇甫和平 ， 許文博 ， 石冬梅

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院 ， 河南鄭州450046)

從奶牛蜂窩織炎病變組織中分離出1株細(xì)菌，通過菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢，以及16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增和序列分析，證實分離到的細(xì)菌為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，PM)。藥敏試驗結(jié)果顯示，該菌株對慶大霉素、左氧氟沙星、氨芐西林、阿米卡星、氯霉素和磺胺甲氧嘧啶敏感，但同時也產(chǎn)生了一定的耐藥性，對頭孢曲松、頭孢噻肟和四環(huán)素耐藥。提醒今后在奶牛外科感染的治療中，應(yīng)注意耐藥性問題。

奶牛 ； 蜂窩織炎 ； 奇異變形桿菌 ； 分離鑒定 ； 藥敏試驗

蜂窩織炎是機體疏松結(jié)締組織內(nèi)發(fā)生的一種急性彌漫性化膿性感染，屬于一種嚴(yán)重的外科感染。引起蜂窩織炎的病原菌種類很多，常見的有金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和大腸桿菌等。

奇異變形桿菌(Proteusmirabilis，PM)是一種條件致病菌，屬于腸桿菌科變形桿菌屬，能引起人、禽、羊和豬等多種動物感染。近幾年國內(nèi)變形桿菌引起奶牛感染的病例陸續(xù)增多，其可引起子宮內(nèi)膜炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎和呼吸道感染等[1-4]。但奶牛蜂窩織炎中奇異變形桿菌的分離未見報道。筆者在2014 年的奶牛疾病臨床診療中，見1例典型的蜂窩織炎病例。病牛腹壁皮下發(fā)生大范圍蜂窩織炎，病牛表現(xiàn)精神沉郁，食欲不振，體溫升高，臥地不愿行走，腫脹由乳腺前部的腹壁皮下至胸壁部皮下，剖檢在相應(yīng)部位可見大量化膿肉芽組織。本實驗室從蜂窩織炎病料中分離出1 株細(xì)菌，通過形態(tài)觀察、顯微鏡鏡檢、16SrRNA 基因的PCR 擴(kuò)增及序列分析，鑒定為奇異變形桿菌。隨后利用11 種藥物對分離菌株進(jìn)行了敏感性試驗。

1 材料

1.1 主要試劑TaqPCR Master Mix、DNA Mark.er、4S Green 核酸染料、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；藥敏紙片由英國OXOID 公司生產(chǎn)；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器 ETC-811 PCR 儀由北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)；Universal Hood II 凝膠成像系統(tǒng)由美國伯樂(BIO-RAD)公司生產(chǎn)；HR40-IIB2 生物安全柜由青島海爾特種電器有限公司生產(chǎn)；3-30K 高速冷凍離心機由德國Sigma 公司生產(chǎn)；900 系列超低溫冰箱由美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn)。1.3 病料及參考菌株 病變?nèi)庋拷M織由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院臨床獸醫(yī)實驗室收集。參考菌株信息見表1。

1.4 引物 根據(jù)Weisburg[12]介紹的方法合成16SrRNA基因引物，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：16S-F(5′-CCG AATTCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CAT GGC TCAG-3′)、16S-R(5′-CCC GGG ATC CAA GCT TACGGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 無菌方法采集化膿性肉芽組織，直接劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。再挑取直徑1～3mm 的單克隆菌落劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行純化。再次挑取單克隆菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢觀察菌體形態(tài)，同時接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃ 180 r/min震蕩培養(yǎng)18 h，4 ℃存放備用。

2.2 菌體DNA制備 水煮法：取1 000 μL菌液于1.5 mL 離心管中，10 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，加入600 μL TE 緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 值8.0)重懸沉淀，100 ℃沸水浴10 min，立即冰浴2 min，1 2 000 r/min 離心10 min，上清液即為DNA 溶液，立即使用或-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 PCR 反應(yīng) 反應(yīng)體系(50 μL)：Tap PCR Mas.ter Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，16S-F 2 μL，16S-R 2μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5min；95 ℃預(yù)變性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE 電泳液中電泳，用4SGreen Nucle Acid 染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR結(jié)果。

2.4 DNA 測序及序列分析 PCR 產(chǎn)物電泳檢測后，直接提交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將序列進(jìn)行BLAST 比對。以多殺性巴氏桿菌Kobe6 為外群，將分離株和表1 中其他變形桿菌的16S rRNA 基因序列，利用DNAStar 軟件中的MegAlign 計算種間相似性(Jotun hein 法)。最后利用phylip3.67 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用1 000個重復(fù)。

表1 菌株序列信息

-：信息不詳

2.5 藥敏試驗 選取11種藥敏紙片，根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)(M100-S23)，對分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗。測量抑菌圈后，根據(jù)抑菌圈的大小判定細(xì)菌對藥物的耐藥與敏感情況。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 經(jīng)過24 h 培養(yǎng)，在普通瓊脂平板上形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤、灰白色的菌落。在普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h 后，呈均勻渾濁，管底可見絮狀沉淀物。細(xì)菌涂片染色鏡檢，可見兩端鈍圓，有的近似球桿狀，多數(shù)散在排列的革蘭陰性短桿菌。

3.2 16S rRNA 基因PCR結(jié)果 以分離株基因組DNA 為模板，進(jìn)行16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增，獲得約1 400 bp的電泳條帶(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符。分離株的序列已經(jīng)提交GenBank，收錄號為KP973965。

圖1 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物檢測

B：空白對照； 1：分離菌株； P：陽性對照； M：DL-2 000 DNA Marker

3.3 測序結(jié)果分析 分離菌株16S rRNA 基因序列的BLAST 比對結(jié)果顯示，與分離株親緣關(guān)系最近的3 株參考菌株均為奇異變形桿菌，相似性為100%。基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)顯示，分離株與奇異變形桿菌親緣關(guān)系最近，明顯位于同一分支中；與奇異變形桿菌關(guān)系最近的為彭氏變形桿菌(Proteuspenneri)，位于同一分支內(nèi)，而豪氏變形桿菌(Proteushauseri)和普通變形桿菌(Proteusvulgaris)則位于更高一級的分支；基于16S rRNA 基因序列進(jìn)行的同源性分析結(jié)果見圖3，由表2 可知，分離菌株與奇異變形桿菌參考株的相似性介于99.4%～100%，彭氏桿菌參考株與奇異變形桿菌的相似性為98.8%～99.3%，分離株與另外兩種變形桿菌的相似性分別為98.5%和98.6%。

圖2 16S rRNA 基因遺傳進(jìn)化樹

圖3 基于16S rDNA序列的同源性關(guān)系

3.4 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果見表2，結(jié)果顯示分離菌株對慶大霉素、左氧氟沙星、氨芐西林、阿米卡星、氯霉素和磺胺甲氧嘧啶敏感；對頭孢曲松、頭孢噻肟和四環(huán)素耐藥；對妥布霉素和環(huán)丙沙星中度敏感。

表2 藥敏試驗結(jié)果

S：敏感； I：中介； R：耐藥

4 小結(jié)與討論

根據(jù)細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果、顯微鏡鏡檢特征，以及16S rRNA 基因序列比對結(jié)果，初步證實分離到的細(xì)菌為奇異變形桿菌，命名為PMYU3?；?6S rRNA 基因的序列分析結(jié)果顯示，分離菌株與奇異變形桿菌參考株的相似性介于99.4%～100%，符合判定標(biāo)準(zhǔn)，即細(xì)菌的16S rRNA基因序列相似性大于99%時，判定為一個種[13]；同時，進(jìn)化樹結(jié)果表明，分離株與所有奇異變形桿菌參考株位于一個分支。因此可以判定分離菌株屬于奇異變形桿菌。這是國內(nèi)首例在奶牛蜂窩織炎中分離出奇異變形桿菌的報道，應(yīng)引起臨床獸醫(yī)工作者的重視。

因為rRNA 基因保守性極強，進(jìn)化緩慢，其被認(rèn)為是細(xì)菌的“活化石”，通過該基因的序列分析來對細(xì)菌進(jìn)行分類和鑒定也已得到公眾的認(rèn)可。相較于傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法，16S rRNA 基因的序列分析簡單快速，更適合于普通獸醫(yī)實驗室對臨床分離菌株的快速鑒定，尤其是細(xì)菌16SrRNA 通用型PCR 引物的使用[6]，極大方便了該基因的體外擴(kuò)增，值得在普通獸醫(yī)實驗室推廣應(yīng)用。

耐藥性試驗結(jié)果表明，分離的奇異變形桿菌對11 種藥物的3 種產(chǎn)生了耐藥性，這也解釋了奶牛臨床中有些外科感染病例不易控制的原因，提醒獸醫(yī)工作者今后應(yīng)更加重視外科感染病原菌耐藥性的問題，加強獸醫(yī)外科感染致病菌種類的調(diào)查和耐藥性問題的研究。

在當(dāng)代規(guī)?；曫B(yǎng)模式下，奶牛發(fā)生外科感染的幾率更大。規(guī)模化牧場中引起奶牛外科感染的主要病因如下：頻繁的防疫注射，針頭消毒不嚴(yán)引起感染；飼養(yǎng)管理中的外傷：刮糞板、臥床擋板、固定前擋板的螺絲等對皮膚的損傷；糞道污穢不潔等引起蹄部的感染。因此，蜂窩織炎等外科感染的預(yù)防，首先要加強牛舍衛(wèi)生管理，保持牛體、臥床等的衛(wèi)生干燥；其次，嚴(yán)格注射時的無菌操作；再次，對于老化的刮糞板、鋼絲繩要及時更換；最后，對于手術(shù)后的病牛要加強護(hù)理。

相較于其他普通外科感染，蜂窩織炎感染發(fā)展迅速、范圍廣泛，具有明顯的全身癥狀。因此，針對該病，在局部治療的同時，應(yīng)注重全身治療，選用敏感的抗菌藥物，嚴(yán)重的病牛靜脈輸液增強體質(zhì)及對癥治療。

[1] 王國卿，王洪海，郭夢堯，等.奶牛產(chǎn)后急性子宮內(nèi)膜炎病原的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46(10)：10-12.

[2] 馮超.呼和浩特地區(qū)某奶牛場奶牛乳腺炎病原菌的分離鑒定和藥敏試驗[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

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2015-03-23

河南省教育廳科技攻關(guān)計劃項目(13B230335)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院博士科研啟動資金項目(5040610)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院第五批學(xué)術(shù)帶頭人培養(yǎng)項目

皇甫和平(1977-)，男，講師，博士，主要從事動物疾病發(fā)病機理研究，E-mail：hepinghf@163.com

石冬梅，E-mail：dongmeishi126@126.com

S858.23

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0529-6005(2016)10-0032-03