分子信標-TaqMan探針法實時熒光定量PCR新型探針及引物

姜文燦岳素文江洪葛素君王成彬

（1. 中國人民解放軍總醫(yī)院臨檢科，北京 100853；2. 北京泰格瑞分子檢驗有限公司，北京 100085；3. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325000）

分子信標-TaqMan探針法實時熒光定量PCR新型探針及引物

姜文燦1，3岳素文2江洪2葛素君1王成彬1，3

（1. 中國人民解放軍總醫(yī)院臨檢科，北京 100853；2. 北京泰格瑞分子檢驗有限公司，北京 100085；3. 溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325000）

在TaqMan探針法實時熒光定量PCR中，排除由引物探針聚合延伸引起的假陽性問題以及由引物二聚體（Primer Dimer，PD）引起的假陰性問題。首先對不同探針進行引物探針聚合實驗；然后通過雙重PCR的干擾實驗選擇合適的內(nèi)標基因，并使用內(nèi)標質(zhì)粒檢測驗證中部同序引物排除PD干擾的實用性；最后比較探針法不同體系檢測HBV基因的靈敏度。結(jié)果表明，引物與探針聚合實驗中，含有反義堿基的HBVP4在重復(fù)實驗中未出現(xiàn)假陽性；競爭性雙重PCR和非競爭性雙重PCR兩模板開始出現(xiàn)干擾作用的濃度差分別為20倍和100倍；對于內(nèi)標基因，使用中部同序引物對以及普通引物對分別可以檢測到10-9和10-8稀釋度；3種HBV基因檢測體系，使用普通引物對可以檢測到Ct33左右，加入內(nèi)標系統(tǒng)和使用中部同序引物對均可檢測到Ct35左右。在TaqMan-分子信標結(jié)構(gòu)調(diào)整的基礎(chǔ)上引入反義堿基可以在排除由引物和探針聚合延伸引起的假陽性問題；在探針法中，使用中部同序引物對和加入內(nèi)標系統(tǒng)均可降低PD的干擾程度，提升檢測的靈敏度。

實時熒光定量PCR；TaqMan探針；反義堿基；引物二聚體；內(nèi)標系統(tǒng)

目前實時熒光定量PCR技術(shù)主要分為染料法和探針法［1］。染料法是在PCR體系中加入能結(jié)合雙鏈核酸分子發(fā)光的熒光染料，因此其面臨著非特異性擴增產(chǎn)物尤其是引物二聚體（primer dimer，PD）引起的假陽性問題［2-5］。TaqMan探針法中探針的引入繞過了PD引起的假陽性問題，但其干擾作用仍存在，PD可以通過競爭性抑制作用使?jié)舛葘?yīng)Ct值在34以后的靶模板無法擴增而出現(xiàn)假陰性問題［6］。一般認為，探針法的假陰性問題主要由抑制劑引起，為排除假陰性，現(xiàn)多采用加入內(nèi)標系統(tǒng)作為內(nèi)質(zhì)控的雙重PCR體系完成定量檢測［7-11］。內(nèi)標系統(tǒng)的加入，在一定程度上排除了假陰性問題，同時提升了檢測的靈敏度［12，13］，但內(nèi)標系統(tǒng)也增加了反應(yīng)體系的復(fù)雜程度，將單重PCR中由引物探針聚合延伸和氣霧膠污染引起的假陽性問題進一步加重［14，15］。

現(xiàn)階段探針法中使用較多的為5'端標記熒光基團3'端標記淬滅基團的TaqMan探針，在反應(yīng)過程中，探針先于引物結(jié)合到模板上，伴隨引物延伸被Taq酶水解而發(fā)光，該類型設(shè)計簡單但探針熒光本底較高。對此，分子信標則是在寡核苷酸兩端人為添加了一段互補的序列形成含有自身莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針，利用構(gòu)象的變化完成熒光的讀取，但由于莖部不與模板結(jié)合，在一定程度上降低了探針與模板的結(jié)合效率，使體系整體表現(xiàn)出的擴增效率較低［16］。為了提升探針與模板的結(jié)合力，鎖核酸、肽核酸等有了一定程度的應(yīng)用，但尚未有針對引物探針聚合問題在探針中引入新型堿基的研究［17］。

本研究首先使用不同的引物和探針進行無模板的聚合實驗；然后以乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）為靶模板，在TaqMan-分子信標的基礎(chǔ)上，設(shè)計不同類型的探針對不同反應(yīng)條件下假陽性積累情況進行比較，并進一步使用引入反義堿基的改良TaqMan-分子信標探針作比對，用于印證新型探針的實用性；對于PD引起的假陰性問題，則在使用中部同序引物的基礎(chǔ)上，根據(jù)競爭性和非競爭性雙重PCR的干擾關(guān)系選擇濃度適宜的管家基因作內(nèi)標，并設(shè)計干擾實驗用于澄清內(nèi)標系統(tǒng)提升檢測靈敏度的機制，以期了解決引物探針聚合延伸引起的假陽性問題和由PD干擾引起的假陰性問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 5 mmol/L dNTPs（U代替T），5 U/μL Taq DNA聚合酶，10×buffer（10 mmol/L Tris HCl，pH 8.3，1.6 mmol/L MgCl2，50 nmol/L KCl，20% 葡聚糖），PCR增效劑，dH2O，乙肝質(zhì)粒。以上試劑均由北京泰格瑞分子檢驗有限公司提供。

1.1.2 儀器 SLAN實時熒光定量PCR儀購自上海宏石有限公司。

1.1.3 引物和探針設(shè)計 以HBV DNA作為研究對象，從GenBank中獲取其全基因序列，通過序列比對，選擇其核心C區(qū)的一段高保守序列作為靶模板，利用引物和探針設(shè)計軟件DNAMAN和Primer Premier 5設(shè)計引物對。并設(shè)計普通TaqMan-分子信標探針HBVcP1，序列調(diào)整的改良TaqMan-分子信標探針HBVcP2和HBVcP3以及含有反義堿基的改良探針HBVcP4（圖1），以BLAST中隨機的基因序列設(shè)計探針P1和P2，各探針序列見表1。并選擇不同基因作為靶序列設(shè)計各引物。

圖1 四種探針結(jié)構(gòu)

表1 探針序列

1.2 方法

1.2.1 假陽性和探針改良

1.2.1.1 引物探針聚合實驗 （1）同探針不同引物：為了找出決定引物探針聚合的關(guān)鍵因素，分別對P1和P2使用一對和兩對不同的引物對進行引物探針聚合實驗，50 μL反應(yīng)體系，使引物的終濃度為0.1 μmol/L，探針的終濃度為0.05 μmol/L。（2）同引物不同靶探針：現(xiàn)在多采用儀器熱蓋和礦物油封閉的策略用以保證反應(yīng)液不揮發(fā)和光路通暢。在找出影響引物探針聚合的主要因素之后，為了驗證改良探針的實用性和優(yōu)選礦物油、熱蓋的應(yīng)用，分別使用相同的引物，對4種HBV靶探針在熱蓋、礦物油封閉加熱蓋和礦物油封閉不加熱蓋3種條件下進行連續(xù)重復(fù)聚合實驗。

1.2.1.2 四種靶探針性能比較 （1）淬滅效率測定：分別借助50 μL反應(yīng)體系檢測HBVcP1、HBVcP2、HBVcP3和HBVcP4的淬滅效率，重復(fù)檢測3次，計算結(jié)果。（2）靈敏度比較：分別使用HBVcP1、HBVcP2、HBVcP3和HBVcP4對系列稀釋的HBV質(zhì)粒模板進行測定，反應(yīng)條件如前，記錄其擴增曲線。

1.2.2 假陰性和引物改良 對于TaqMan探針法中的假陰性問題，現(xiàn)多采用加入內(nèi)標組成雙重PCR的方式，為了選擇內(nèi)標系統(tǒng)的類型和體系濃度，分別對競爭性和非競爭性雙重PCR作干擾實驗。在同一反應(yīng)體系中，競爭性雙重PCR為靶模板和內(nèi)標基因共用同一對引物，非競爭性雙重PCR則是指靶模板和內(nèi)標基因使用不同的引物對。

1.2.2.1 競爭性雙重PCR干擾實驗 選擇乙肝表面抗原基因質(zhì)粒和其突變模板，分別設(shè)計不同探針，使用相同引物進行干擾實驗。

1.2.2.2 非競爭性雙重PCR干擾實驗 選擇HBV表面抗原質(zhì)粒作為靶模板，突變HBV核心區(qū)模板作為內(nèi)標基因，二者使用不同引物對，進行干擾實驗。

1.2.2.3 內(nèi)標基因的選擇及克隆 查取多種管家基因序列，分別設(shè)計引物檢測其天然濃度，選擇合適管家基因作為內(nèi)標基因，根據(jù)其基因序列設(shè)計克隆引物完成克隆，并對克隆產(chǎn)物進行基因測序。

1.2.2.4 中部同序引物實用性驗證 對選定的內(nèi)標基因設(shè)計中部同序引物對和普通引物對以及探針，檢測10倍系列稀釋的內(nèi)標質(zhì)粒，50 μL反應(yīng)體系：5 μmol/L上下游引物各1 μL、2.5 μmol/L內(nèi)標探針1 μL、5 mmol/L dNTP 1 μL、Taq酶2 μL、10×buffer 5 μL、PCR增效劑2 μL、dH2O 27 μL，50 μL礦物油封閉后上機檢測。反應(yīng)程序如下：95℃ 2 min，50℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，進行45個循環(huán)，58℃處讀取熒光。

1.2.2.5 雙重PCR內(nèi)標引物和探針濃度優(yōu)化 在確定靶引物濃度為5 μmol/L、靶探針濃度為2.5 μmol/L的前提下，對引物和探針的濃度進行系列優(yōu)化。

1.2.3 不同體系檢測HBV梯度比較 對HBV陽性血清標準品提取DNA進行2倍倍比稀釋，分別使用探針法結(jié)合普通引物對、普通引物對加內(nèi)標和中部同序引物對種3體系檢測；并使用染料法檢測3種體系PD形成情況。

2 結(jié)果

2.1 引物探針聚合實驗結(jié)果

2.1.1 同探針不同引物 分別對探針P1和P2使用一對和兩對不同引物進行聚合實驗，結(jié)果如表2所示，對于探針P1，不同的引物對均出現(xiàn)了假陽性，Ct值大小不等；而對于探針P2，各引物對均未出現(xiàn)假陽性。

2.1.2 四種靶探針與靶引物假陽性測試 分別使用4種靶探針和同一對靶引物在熱蓋、礦物油加熱蓋及礦物油無熱蓋3種條件下進行假陽性聚合實驗，并同時檢測另外加入引物對的假陽性情況，結(jié)果如表3所示。HBVcP1和HBVcP2開始即產(chǎn)生假陽性，并隨著實驗次數(shù)的增多逐漸加重；HBVcP3開始的時候不出現(xiàn)假陽性，隨著重復(fù)假陽性逐漸產(chǎn)生；含有反義堿基的探針HBVcP4始終沒有出現(xiàn)可檢測到的假陽性（圖2）。

表2 同探針不同引物測試

表3 各探針假陽性重復(fù)檢測（Ct值）

單獨使用礦物油嚴重程度低于其他兩組（圖3）。另外，引物和探針聚合產(chǎn)生假陽性的熒光曲線的熒光值較低，隨著重復(fù)實驗的積累，其擴增曲線的熒光強度逐漸增加。

圖2 熱蓋條件下各探針假陽性

圖3 不同條件假陽性積累情況

2.2 不同探針性能比較

2.2.1 淬滅效率測試 分別對HBVcP1、HBVcP2、HBVcP3和HBVcP4檢測淬滅效率，計算公式為Eff=［1-（Fq-Fb）/（Fuq-Fb）］×100%［18］，其中Fq為探針自身的熒光強度，F(xiàn)uq為探針水解之后的熒光強度，F(xiàn)b為反應(yīng)液自身的熒光強度。結(jié)果（表4）顯示，4種探針淬滅效率都較高。

表4 四種探針淬滅效率比較

2.2.2 靈敏度比較 使用4種探針對系列稀釋度的HBV質(zhì)粒模板進行檢測，記錄擴增曲線并對各探針的熒光強度進行比較，重復(fù)檢測3次，其熒光強度無明顯差別。如表5所示，各探針檢測靈敏度在同一數(shù)量級。

2.3 假陰性和引物改良

2.3.1 競爭性雙重PCR干擾實驗 分別對乙肝表面抗原基因質(zhì)粒和其突變模板設(shè)計探針，使用相同引物在同一反應(yīng)管進行擴增。結(jié)果（表6）顯示，使用競爭性內(nèi)標基因時，將靶模板作稀釋，控制內(nèi)標模板濃度在Ct30左右。當二者濃度相差10-20倍時出現(xiàn)干擾，相差50倍時嚴重抑制，相差100倍時低濃度模板會徹底抑制。

表5 不同探針檢測靈敏度對比

表6 競爭性內(nèi)標與靶模板干擾實驗

2.3.2 非競爭性內(nèi)標干擾實驗 選擇HBV表面抗原質(zhì)粒作為靶模板，HBV核心抗原質(zhì)粒作為內(nèi)標基因，二者使用不同引物對，進行干擾實驗。結(jié)果（表7）顯示，當靶模板與內(nèi)標模板濃度相差超過100倍時，基本沒有影響或出現(xiàn)一些較小干擾，當二者濃度相差超過1 000倍時，開始出現(xiàn)較嚴重的干擾作用。

表7 非競爭性內(nèi)標與靶模板干擾實驗

2.3.3 內(nèi)標基因的選擇及克隆 分別針對各管家基因設(shè)計引物，使用染料法檢測其濃度，為了保證數(shù)個靶模板完成準確定量（Ct約36），根據(jù)結(jié)果（未呈現(xiàn)）選擇濃度對應(yīng)Ct值在30左右的β-globin做為內(nèi)標基因，克隆后對克隆產(chǎn)物進行測序，與BLAST中的基因序列進行比對，符合率100%（圖4）。

圖4 β-globin測序結(jié)果

2.3.4 中部同序引物驗證 使用中部同序引物對和普通引物對結(jié)合探針檢測系列稀釋的β-globin模板，結(jié)果顯示，普通引物對可以檢測到10-8稀釋度（圖5-A），中部同序引物對可以檢測到10-9稀釋度（圖5-B），TaqMan探針法中使用中部同序引物對檢測靈敏度相比于普通引物對好一個數(shù)量級。

2.3.5 雙重PCR體系內(nèi)標引物和探針濃度優(yōu)化 在確定靶引物濃度為5 μmol/L、靶探針濃度為2.5 μmol/L的前提下，對系列濃度的引物和探針進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當內(nèi)標引物濃度為4 μmol/L、內(nèi)標探針為2.5 μmol/L時，對確定濃度的靶模板擴增有最小的Ct值和最大的熒光增值。

圖5 不同引物檢測靈敏度比對

2.4 不同體系檢測靈敏度比較

對HBV陽性血清標準品提取DNA進行2倍倍比稀釋，分別使用探針法聯(lián)合普通引物對、普通引物對加內(nèi)標和中部同序引物對進行檢測。檢測結(jié)果如表8所示，對于單重TaqMan探針法檢測體系，同β-globin，使用中部同序引物對靈敏度較普通引物對提升近一個數(shù)量級。對于普通引物對，引入內(nèi)標系統(tǒng)之后增加了檢測的靈敏度。但PD含量有所增加，Ct值由31.34變?yōu)?0.07。

3 討論

TaqMan探針法實時熒光定量PCR的使用，使分子檢測技術(shù)的實用性得到了進一步的提升，但該方法也存在普通檢測技術(shù)面臨的非特異性問題。在這一反應(yīng)體系中引物和探針聚合延伸產(chǎn)生的假陽性則是其非特異性問題的主要來源之一。

使用相同的引物與不同的探針進行聚合實驗，結(jié)果顯示有的探針在首次檢測即出現(xiàn)假陽性，而有的探針是隨著實驗次數(shù)的增多積累產(chǎn)生假陽性；使用相同的探針分別與不同的引物聚合則顯示不同的引物之間結(jié)果較一致。兩對引物與探針聚合擴增，相比于一對引物，既存在加重的現(xiàn)象，又存在抑制的現(xiàn)象。這說明引物和探針之間能否聚合更多取決于探針，引物也有一定的影響。另外，引物和探針聚合的初期擴增曲線熒光值較低，但Ct值多在32-36之間，隨著實驗次數(shù)的增多，其熒光強度逐漸增加，Ct值也逐漸減小。對于存在假陽性問題的探針，可以對其序列結(jié)構(gòu)在TaqMan-分子信標（HBVcP1）的基礎(chǔ)上調(diào)整（HBVcP2、HBVcP3），同時引入反義堿基（HBVcP4）用以杜絕引物和探針聚合的現(xiàn)象。分別使用一對引物和兩對引物對4種探針在不同條件下進行了引物探針聚合實驗。說明相對于原始結(jié)構(gòu)的TaqMan-分子信標，結(jié)構(gòu)調(diào)整的改良探針對于減少假陽性問題更有意義；在一段核酸序列中，反義堿基可以被Taq酶水解但不可以作為擴增的模板，其應(yīng)用則徹底解決了引物和探針聚合延伸的問題。結(jié)構(gòu)調(diào)整的HBVcP2與原始探針HBVcP1假陽性情況相當，說明探針3'端添加序列與自身互補的位置同樣重要，互補部位不合適并不能杜絕假陽性問題。而對4種探針的性能驗證結(jié)果表明，探針中反義堿基的使用，在排除假陽性問題的同時，還保證了探針的淬滅效率、反應(yīng)體系的擴增效率和靈敏度，這無疑顯示了其強大的優(yōu)勢。

表8 HBV單重和雙重PCR檢測

在實時熒光定量PCR檢測中，為了確保反應(yīng)液不蒸發(fā)和儀器光路通暢，多使用儀器熱蓋或礦物油封閉的策略［19，20］。在進行引物和探針聚合實驗時，分別在使用儀器熱蓋、礦物油加熱蓋和礦物油無熱蓋的條件下進行重復(fù)，發(fā)現(xiàn)單獨使用礦物油的假陽性積累速度比礦物油加熱蓋更慢。所以，對于TaqMan探針法，單獨使用礦物油封閉反應(yīng)液而不使用儀器熱蓋是保證檢測結(jié)果準確性的前提條件。

另外，對于TaqMan探針法中面臨的引物二聚體引起的假陰性問題，現(xiàn)在更多的使用加入內(nèi)標作為內(nèi)質(zhì)控的方法［21，22］。兩種類型雙重PCR干擾實驗結(jié)果顯示，使用非競爭性雙重PCR內(nèi)標基因和靶模板的相互干擾更弱；為了保證數(shù)個靶模板的準確定量，應(yīng)選擇濃度對應(yīng)Ct值在30左右的管家基因β-globin作為內(nèi)標基因。對于β-globin基因，使用中部同序引物對聯(lián)合探針，其檢測的靈敏度相比于普通引物對好一個數(shù)量級，無疑說明染料法中解決PD問題的中部同序引物對在探針法中同樣適用。

在完成靶模板內(nèi)標系統(tǒng)雙重PCR體系的優(yōu)化之后，使用普通引物對、普通引物對加內(nèi)標系統(tǒng)、中部同序引物對3種檢測體系對系列稀釋的HBV標準品進行檢測。類似于β-globin基因，使用中部同序引物對檢測的靈敏度高于普通引物對。對于普通引物對體系，內(nèi)標系統(tǒng)的引入，提升了對HBV檢測的靈敏度，而PD的含量有所增加。這說明，引入內(nèi)標系統(tǒng)之后，增加了反應(yīng)體系中引物二聚體的總量，但分散了與靶模板存在競爭性抑制作用的PD的指數(shù)性，使其干擾作用推后，從而提升了檢測的靈敏度。因此，對于TaqMan探針法中的假陰性問題，使用中部同序引物對和加入內(nèi)標系統(tǒng)的策略均可以降低其產(chǎn)生。

4 結(jié)論

本研究通過研究引入反義堿基的TaqMan分子信標探針，解決了在探針法實時熒光定量PCR中由引物和探針聚合引起的假陽性問題。通過內(nèi)標基因和靶模板的相互干擾關(guān)系選擇β-globin作為內(nèi)標基因，在驗證中部同序引物實用性的同時，指出了其提升檢測靈敏度的真正機制。此外，通過不同條件下的引物探針聚合實驗發(fā)現(xiàn)單獨使用礦物油封閉反應(yīng)液而不使用儀器熱蓋是保證檢測結(jié)果準確性的前提條件。

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（責任編輯 馬鑫）

New Probe and Primer for Molecular Beacon-TaqMan Real Time Fluorescent Quantitative PCR

JIANG Wen-can1，3YUE Su-wen2JIANG Hong2GE Su-jun1WANG Cheng-bin1，3
（1. Department of Clinical Laboratory Medicine，Chinese People’s Liberation Army General Hospital & Postgraduate Medical School，Beijing 100853；2. Beijing Tag Array Molecular Test Co.，Ltd，Beijing 100085；3. College of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000）

Our purpose is to eliminate the false positive problem caused by primer-probe aggregation and extension，as well as the false negative problem caused by primer dimer（PD）. First，the primer and probe aggregation results were tested for different probes；then the appropriate internal control gene（IC）was selected based on the competitive interference experiments of duplex PCR，simultaneously，the practicability of central-home primer excluding the inference of PD was verified on the plasmid of the IC；and finally，the sensitivities of different systems for TaqMan method were compared. The probe HBVP4，containing an antisense base，did not produce false positive results in the repeated trials；the concentration difference at which interferences for the templates of competitive and non-competitive duplex PCR were noticed was 20 times and 100 times，respectively. The dilution that could detected by central-home primer and common primer was 10-9and 10-8，respectively. And for 3 HBV gene detection systems，the detection could be until Ct33 if using common primer，and Ct35 if using central-home primer and by the accession of IC. Based on adjustments of TaqMan-Molecular Beacon and introducing antisense，the false positive problem caused by primer-probe aggregation and extension was excluded. In probe method，the use of central-home primer and IC could both reduced the influences caused by PD，and therefore increase the sensitivity of detection.

real time fluorescent quantitative PCR；TaqMan probe；antisense base；primer dimer；internal control

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.029

2016-03-02

國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項（2012YQ03026107）

姜文燦，男，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：jiangwencan2014@126.com

王成彬，男，博士，研究方向：血液免疫學(xué)；E-mail：wangcb301@sina.com