短小芽孢桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選

賀婷停 宋婷 王超 張長(zhǎng)斌 王海燕

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065）

短小芽孢桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選

賀婷停 宋婷 王超 張長(zhǎng)斌 王海燕

（四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065）

為了利用熒光定量PCR方法分析短小芽孢桿菌的基因表達(dá)水平，需要首先確定適合該菌株的熒光定量PCR分析內(nèi)參基因。以短小芽孢桿菌的16S rRNA、mecA、cadR、rpoB及sphP 共5個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析這5個(gè)候選基因在短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)情況，再用geNorm和NormFinder 軟件評(píng)估它們的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，利用geNorm軟件分析得出16S rRNA和mecA是表達(dá)最穩(wěn)定的基因，最適內(nèi)參基因數(shù)為2。NormFindr軟件分析得出mecA為最穩(wěn)定的基因。對(duì)短小芽孢桿菌3個(gè)功能基因的差異表達(dá)分析結(jié)果表明，16S rRNA和mecA都是合適的內(nèi)參基因，而mecA基因由于表達(dá)豐度適中，更適合于作為內(nèi)參基因研究結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。為了得到更準(zhǔn)確的差異表達(dá)結(jié)果，也可用兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行校正。

短小芽孢桿菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；內(nèi)參基因；geNorm；NormFinder

近年來(lái)，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于不同生物基因表達(dá)的絕對(duì)定量和相對(duì)定量研究，這項(xiàng)技術(shù)因具有高靈敏性、高效性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好等特點(diǎn)，已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域基因表達(dá)分析的重要方法之一，被大量用于分析基因在不同發(fā)育時(shí)期以及經(jīng)過(guò)不同處理的樣本間的表達(dá)差異等［1］。

有效的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析取決于很多因素，如提取的RNA的質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄的效率、引物特異性以及數(shù)據(jù)處理方法等［2］，而采用穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因來(lái)控制實(shí)驗(yàn)誤差也是非常重要的。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該是在各種類(lèi)型的組織、細(xì)胞和不同的實(shí)驗(yàn)因素條件下均能恒定表達(dá)。在真核生物中已經(jīng)鑒定出一些表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因用于定量表達(dá)分析，如廣泛使用的β-actin和GAPDH［3］，但在原核生物中還沒(méi)有找到廣泛穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。大量的研究結(jié)果表明，任何一種管家基因的所謂恒定表達(dá)都只是在一定類(lèi)型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素作用下“有范圍”的恒定，并沒(méi)有表達(dá)絕對(duì)穩(wěn)定的基因［4］。Sun等［5］研究了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin 4個(gè)內(nèi)參基因在茶樹(shù)中的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在不同成熟度的葉片和愈傷組織中表達(dá)最穩(wěn)定的是GAPDH基因，在不同組織器官中表達(dá)最穩(wěn)定的基因則是β-actin。在細(xì)菌的基因差異表達(dá)分析中，23S rRNA和16S rRNA［6，7］是經(jīng)常使用的定量PCR的內(nèi)參基因，但有研究表明核糖體RNA的表達(dá)水平高度依賴(lài)于細(xì)菌細(xì)胞的生理狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞處于熱激、營(yíng)養(yǎng)匱乏或生長(zhǎng)速率發(fā)生改變的條件下，核糖體RNA的表達(dá)水平發(fā)生改變［8，9］，有研究表明，大腸桿菌在碳源［10-12］或無(wú)機(jī)離子［10，11］饑餓情況下，16S rRNA發(fā)生降解。因此，研究不同的實(shí)驗(yàn)材料和不同的實(shí)驗(yàn)條件下目標(biāo)基因的表達(dá)時(shí)，有必要對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行重新篩選，并且隨著對(duì)定量要求的不斷提高，為了得到更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中可選擇1個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正［12，13］。

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）是一種廣泛存在的土壤細(xì)菌，在許多生物技術(shù)領(lǐng)域有重要的用途：如工業(yè)化生產(chǎn)胞外堿性蛋白酶、拮抗植物病源菌等。開(kāi)展短小芽孢桿菌的基因表達(dá)研究，不僅可以豐富芽孢桿菌的基因表達(dá)調(diào)控理論，也可為菌株的開(kāi)發(fā)和利用提供重要的指導(dǎo)。要精確分析短小芽孢桿菌的基因表達(dá)情況，確定合適的內(nèi)參基因是前提，但國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)關(guān)于其內(nèi)參基因篩選的報(bào)道。為了確定短小芽孢桿菌熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因，我們選擇了細(xì)菌定量PCR分析中常用的內(nèi)參基因16S rRNA和rpoB［14-16］，以及我們從短小芽孢桿菌SCU11轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出的3個(gè)穩(wěn)定表達(dá)基因（mecA、cadR和sphP），針對(duì)短小芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生堿性蛋白酶的培養(yǎng)過(guò)程，采用 geNorm［13］和NormFinder［17］軟件對(duì)這5個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行穩(wěn)定性分析，以期選擇出最適于短小芽孢桿菌基因表達(dá)水平研究的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 材料

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）SCU11為本實(shí)驗(yàn)室分離并誘變得到的一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化與發(fā)酵培養(yǎng) 將保存的菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜?；罨木阂?%的接種量轉(zhuǎn)種于發(fā)酵培養(yǎng)基（麩皮2.5%、黃豆粉2%、酵母膏0.3%、K2HPO40.4%、NaH2PO40.04%及CaCO30.3%），轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度34℃，在發(fā)酵培養(yǎng)的不同時(shí)間取樣。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 在菌株生長(zhǎng)的不同時(shí)期，對(duì)應(yīng)于發(fā)酵過(guò)程的發(fā)酵前期（0 h）、遲緩期（2 h）、對(duì)數(shù)期（6 h）、轉(zhuǎn)換期（12 h和14 h）、穩(wěn)定期（24 h）、衰退期（36 h）、酶活最高點(diǎn)（48 h）、酶活下降點(diǎn)（60 h）取樣，離心收集菌體，液氮冷凍后于-80℃保存。凍存的菌體取出后加入15 mg/mL的溶菌酶在37℃下溫浴10 min，利用TRIzol?Reagent（Life Technologies）提取樣品總RNA。RNA的濃度采用Thermos 公司的Nanodrop-2000測(cè)定，RNA的完整性通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

利用PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Biotechnology，Japan）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA于-20℃保存，用于熒光定量PCR分析。為了驗(yàn)證RNA樣品中是否存在基因組DNA的污染，從反轉(zhuǎn)錄之前的反應(yīng)體系中取出1 μL作為模板進(jìn)行PCR驗(yàn)證，沒(méi)有擴(kuò)增出條帶，說(shuō)明基因組DNA去除完全。

1.2.3 候選內(nèi)參基因的選擇與引物設(shè) 本研究選擇了5個(gè)基因進(jìn)行比較分析：16S rRNA、mecA、rpoB、cadR和sphP。其中16S rRNA和rpoB是常用的細(xì)菌看家基因，mecA、cadR、sphP是我們根據(jù)短小芽孢桿菌SCU11轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（結(jié)果待發(fā)表）中基因的RPKM值篩選而來(lái)：利用RPKM值計(jì)算變異系數(shù)CV（標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比值）和最大折疊倍數(shù)MFC（最大的RPKM值與最小的RPKM值的比值），選擇CV值小于4%且MFC值小于2的基因［18］。依據(jù)NCBI中短小芽孢桿菌BA06（SCU11的原始野生菌株）基因組中相應(yīng)基因序列，使用 Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，由成都擎科梓熙生物科技有限公司合成。引物序列，見(jiàn)表1。

表1 短小芽孢桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的基因引物序列

1.2.4 內(nèi)參基因熒光定量PCR分析 采用 TaKaRa公司的 SYBR Premix Ex TaqⅡ熒光定量 PCR 試劑盒和 Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR儀進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL；cDNA template 2 μL；引物（0.4 μmol/L）各0.5 μL；水7 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 1 min；95℃ 5 s，52.5℃ 30 s，72℃ 30 s（在延伸階段檢測(cè)熒光強(qiáng)度，收集信號(hào)），40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 s。熔解曲線(xiàn)：加熱樣品從65-95℃，每隔 0.5℃停留1 s檢測(cè)1次熒光強(qiáng)度變化。

引物擴(kuò)增效率驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：引物擴(kuò)增效率（E）與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率K相關(guān)，計(jì)算方程式為：E=（10-（1/K）-1）× 100%；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，將第1鏈cDNA模板依次稀釋5個(gè)梯度（1/5、1/25、1/125、1/625和1/3125），研究5個(gè)內(nèi)參基因在發(fā)酵的9個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)豐度，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。解鏈溫度等系列參數(shù)通過(guò)Bio-Rad CFX 熒光定量PCR 儀自動(dòng)獲得。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和分析 以不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的cDNA稀釋液作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)模板，反應(yīng)體系和條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)反應(yīng)體系相同。將獲得的Ct值輸入geNorm程序運(yùn)行，該程序能夠計(jì)算出每個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定度的平均值（M）并且根據(jù)M值的大小進(jìn)行排序，M值越小，表達(dá)就越穩(wěn)定，從而選出最優(yōu)內(nèi)參基因，再通過(guò)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異分析（Vn/n+1）判定內(nèi)參基因的最適數(shù)目。同時(shí)利用 NormFinder 程序選出最穩(wěn)定的基因，二者結(jié)合確定最合適的內(nèi)參基因用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)目的基因的分析。

1.2.6 目的基因的相對(duì)表達(dá)分析 以mecA和16S rRNA分別作為內(nèi)參基因，以6 h基因的表達(dá)量為校準(zhǔn)樣本（calibrator），12、24、36、48和60 h的表達(dá)量為實(shí)驗(yàn)樣本（sample），采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法分析spo0A、sinR和RNA_F_101三個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。方法如下：

實(shí)驗(yàn)樣本的△Ct值：△Ct1=Ctsample-Ctref；校準(zhǔn)樣本的△Ct 值：△Ct2= Ctcalibrator-Ctref；其次，用校準(zhǔn)樣本的△Ct 值歸一試驗(yàn)樣本的△Ct 值：△△Ct=△Ct1-△Ct2；最后，計(jì)算表達(dá)水平比率：表達(dá)量的比值=2-ΔΔCt。

2 結(jié)果

2.1 菌體培養(yǎng)及RNA提取

在短小芽孢桿菌蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)的不同生長(zhǎng)時(shí)期（0、2、6、12、14、24、36、48和60 h），分別收集菌體采用Trizol法提取RNA。提取的RNA經(jīng)Nanodrop-2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，所有樣品的 OD260/OD280的比值均在2.0左右，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，23S和16S條帶亮度清晰（圖1），說(shuō)明RNA完整性較好。提取的RNA樣品再進(jìn)行去基因組DNA處理，PCR檢測(cè)表明樣品中基因組DNA去除完全。將去除基因組DNA的RNA用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。

圖1 短小芽孢桿菌SCU11總RNA電泳圖譜

2.2 引物擴(kuò)增效率及特異性

以梯度稀釋的cDNA樣本作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制5個(gè)候選內(nèi)參基因（mecA、rpoB、cadR、sphP、16S rRNA）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到引物的相關(guān)參數(shù)（表2）。表2顯示，5個(gè)候選內(nèi)參基因的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（R2）變化范圍為0.992-0.997，顯示出較好的線(xiàn)性關(guān)系。同時(shí)根據(jù)E =（10-1/slope-1）× 100計(jì)算擴(kuò)增效率，這5個(gè)候選內(nèi)參基因均表現(xiàn)出良好的擴(kuò)增效率（均大于90%），說(shuō)明定量結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)擴(kuò)增效率的要求。從5個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線(xiàn)看（圖2），都只出現(xiàn)單一的信號(hào)峰，說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體和非特異性條帶產(chǎn)生。為了進(jìn)一步證實(shí)5個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增特異性，將擴(kuò)增片段經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示每對(duì)引物均擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，且沒(méi)有出現(xiàn)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增條帶，說(shuō)明引物的特異性較好。

表2 短小芽孢桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增參數(shù)

根據(jù)5個(gè)候選內(nèi)參基因在不同時(shí)間點(diǎn)的平均Ct值（圖4）可以看出，在發(fā)酵培養(yǎng)的不同時(shí)期5個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平都有一定的變化；其中16S rRNA 作為傳統(tǒng)內(nèi)參基因的表達(dá)豐度相對(duì)較高，而sphP表達(dá)豐度最低。

2.3 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定分析

圖2 候選內(nèi)參基因的熔解曲線(xiàn)

通過(guò)geNorm軟件評(píng)估5個(gè)候選內(nèi)參基因在短小芽孢桿菌SCU11不同發(fā)酵時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性（M），該軟件默認(rèn)的穩(wěn)定性值M=1.5，基因的表達(dá)穩(wěn)定值M越小，表明穩(wěn)定性越高。根據(jù)geGorm軟件計(jì)算，短小芽孢桿菌中5個(gè)內(nèi)參基因在發(fā)酵不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定值M排列順序?yàn)閟phP（0.099）＞ rpoB（0.081）＞ cdaR（0.072）＞mecA= 16S rRNA（0.060）（圖5），說(shuō)明表達(dá)最穩(wěn)定的基因是16S rRNA和mecA。

圖3 候選內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

圖4 五個(gè)候選內(nèi)參基因在發(fā)酵不同時(shí)期的表達(dá)豐度Ct值

圖5 geNorm軟件分析各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M

在基因的表達(dá)分析中，有時(shí)需要使用2個(gè)或2個(gè)以上的內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行校正以減少實(shí)驗(yàn)誤差，從而得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。利用geNorm程序分析了內(nèi)參基因的配對(duì)差異值 Vn/n + 1，結(jié)果（圖6）顯示V2/3值為0.024，小于程序推薦值0.15，即無(wú)需加入第3個(gè)基因進(jìn)行校正，最合適的內(nèi)參基因數(shù)目是2個(gè)，分別是表達(dá)最為穩(wěn)定的mecA和16S rRNA。

圖6 geNorm軟件分析確定用作校準(zhǔn)的最適內(nèi)參基因的數(shù)目

進(jìn)一步使用NormFinder軟件對(duì)5個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，M值越小基因表達(dá)就越穩(wěn)定。通過(guò) NormFinder 程序分析熒光定量數(shù)據(jù)得出每個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定值（M），同時(shí)還提供當(dāng)使用此基因校正時(shí)所引用的系統(tǒng)誤差值（表3）。M值的大小順序?yàn)閏adR（0.113）＞rpoB（0.077）＞sphP（0.073）＞16SrRNA（0.021）＞mecA（0.019）。結(jié)果表明，mec-A的M值最小，是表達(dá)最穩(wěn)定的基因。

表3 NormFinder軟件分析各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值

2.4 目的基因差異表達(dá)分析

根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在短小芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，geNorm軟件分析得出16S rRNA和mecA的穩(wěn)定性最高。NormFinder軟件分析的穩(wěn)定性最高的內(nèi)參基因是mecA。為了對(duì)這兩個(gè)基因作為熒光定量PCR分析內(nèi)參基因的可靠性和適應(yīng)性進(jìn)行驗(yàn)證，選擇sinR、spo0A和RNA_F_101三個(gè)基因進(jìn)行差異表達(dá)分析。

結(jié)果（表4）顯示，針對(duì)我們的cDNA樣本，候選內(nèi)參基因16S rRNA的Ct值在10-13之間，而mecA基因的Ct值在24-26，表明16S rRNA基因的表達(dá)水平大大高于mecA基因。從3個(gè)目的基因的表達(dá)水平以及我們的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析來(lái)看，絕大多數(shù)基因的表達(dá)水平更接近于mecA。

表4 短小芽孢桿菌SCU11候選內(nèi)參基因與目的基因不同時(shí)間點(diǎn)的平均Ct值

分別以mecA和16S rRNA為內(nèi)參基因，6 h為對(duì)照樣本，采用2-ΔΔCt相對(duì)定量法得出目的基因的相對(duì)表達(dá)量（表5）。從表中的數(shù)據(jù)可以看出，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，sinR在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的表達(dá)水平相對(duì)比較穩(wěn)定。另外兩個(gè)基因RNA_F_101和spo0A，分別用兩個(gè)內(nèi)參基因計(jì)算出的目的基因表達(dá)水平，雖然具體的變化倍數(shù)略有變化，但趨勢(shì)完全一致，說(shuō)明mecA和16S rRNA基因均可以作為短小芽孢桿菌熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因。

3 討論

近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、基因表達(dá)譜芯片等的迅速發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)成為驗(yàn)證基因表達(dá)水平變化的重要技術(shù)手段，而選擇合適的內(nèi)參基因做校正是很關(guān)鍵的。理想的內(nèi)參基因一般應(yīng)該滿(mǎn)足：選擇的內(nèi)參基因不能為假基因［19］；在不同的發(fā)育階段及脅迫條件下表達(dá)穩(wěn)定；表達(dá)水平與目標(biāo)基因相近。然而，不同物種不同生理?xiàng)l件下使用的內(nèi)參基因各不相同，即使廣泛使用的內(nèi)參基因Actin和 GAPDH在不同的條件下其表達(dá)也會(huì)發(fā)生改變或受到其他基因的調(diào)控［20-23］。因此，研究者需要根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件篩選不同的內(nèi)參基因。

為了減少選擇內(nèi)參基因的誤差，本研究采用了兩種不同卻又互補(bǔ)的軟件進(jìn)行分析：geNorm和NormFinder，這兩種軟件被廣泛的應(yīng)用于熒光定量PCR 中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)［24，25］。geNorm軟件是根據(jù)候選基因中表達(dá)量最高的內(nèi)參基因與其他候選基因的配對(duì)表達(dá)水平比值經(jīng)對(duì)數(shù)變換，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定值M，其可以對(duì)多個(gè)管家基因同時(shí)進(jìn)行比較篩選，選出兩個(gè)及以上的內(nèi)參基因，有助于減小系統(tǒng)誤差，得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，尤其是對(duì)微小表達(dá)差異的基因的表達(dá)研究具有重要的意義。當(dāng)然，目的基因有較大表達(dá)差異時(shí)則不必選擇較多的內(nèi)參基因，這需要視具體實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)條件而定。NormFinder軟件也是常用的一種評(píng)估基因表達(dá)穩(wěn)定性的方法，原始數(shù)據(jù)經(jīng)△Ct法將其轉(zhuǎn)換成線(xiàn)性表達(dá)量，然后通過(guò)方差分析得出基因的表達(dá)穩(wěn)定值M，它可以平衡兩個(gè)變異的來(lái)源，但它不能忽略樣品制備過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，然而統(tǒng)計(jì)方法可以通過(guò)大量數(shù)據(jù)處理來(lái)克服這一缺點(diǎn)，所以當(dāng)不能明確地細(xì)分樣品時(shí)，可以選擇這種方法。

表5 短小芽孢桿菌SCU11各目的基因不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量

目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有對(duì)短小芽孢桿菌內(nèi)參基因篩選及評(píng)價(jià)的文獻(xiàn)報(bào)道。在研究短小芽孢桿菌基因表達(dá)分析時(shí)，應(yīng)首先考慮選擇與目的基因表達(dá)水平較為接近的內(nèi)參基因作為參比。實(shí)驗(yàn)利用geNorm和NormFinder兩個(gè)軟件篩選出兩個(gè)比較穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因：mecA和16S rRNA。同時(shí)，利用這兩個(gè)候選內(nèi)參基因?qū)inR、spo0A和RNA_F_101的表達(dá)量進(jìn)行了分析。sinR基因是一種DNA結(jié)合蛋白，它不僅是蛋白酶基因的負(fù)調(diào)控因子，還參與芽孢生成、鞭毛基因、自溶素生產(chǎn)和感受態(tài)的形成等多種細(xì)胞內(nèi)部調(diào)控作用［26］。Spo0A是磷酸激活應(yīng)答調(diào)控蛋白家族的成員之一［27］，在孢子的初始形成階段起主要的調(diào)控功能。RNA_F_101是我們從短小芽胞桿菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（待發(fā)表）中預(yù)測(cè)出的功能未知的差異表達(dá)非編碼RNA。結(jié)果表明這兩個(gè)內(nèi)參基因計(jì)算出的3個(gè)目的基因的表達(dá)水平的變化趨勢(shì)是完全一致的，說(shuō)明16S rRNA和mecA都可以作為短小芽孢桿菌熒光定量PCR分析的內(nèi)參基因。但是，需要注意的是，雖然16S rRNA有較高的表達(dá)穩(wěn)定性，但是由于16S rRNA具有很高的表達(dá)水平，其表達(dá)量通常顯著高于細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)基因。在熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中，基線(xiàn)通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，是由于測(cè)量的偶然誤差引起的，因此，對(duì)熒光定量的結(jié)果一般取Ct值在15-35個(gè)循環(huán)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，太大或太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。在表4的實(shí)驗(yàn)中，16S rRNA的Ct值在11-12左右，如果降低模板濃度將16S rRNA的Ct值控制在理想的15-35個(gè)循環(huán)之間，目的基因RNA_F_101的Ct值就會(huì)大于35個(gè)循環(huán)，導(dǎo)致結(jié)果難以分析。從我們所做的20多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的熒光定量PCR分析結(jié)果以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果來(lái)看，大多數(shù)基因的表達(dá)量都顯著低于16S rRNA基因，因此，需要使用一個(gè)表達(dá)豐度較低的內(nèi)參基因，mecA就是一個(gè)合適的基因。MecA屬于MecA 家族蛋白的成員之一，是ClpC六聚體形成及其進(jìn)一步激活的重要的接頭蛋白。當(dāng)MecA過(guò)表達(dá)時(shí)，會(huì)抑制孢子的形成，是孢子形成的負(fù)調(diào)控因子［28-30］。通過(guò)3個(gè)功能基因的差異表達(dá)分析進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明16S rRNA和mecA都可以作為研究短小芽孢桿菌基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，mecA基因由于表達(dá)豐度適中，更適合于作為內(nèi)參基因研究結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。為了得到更準(zhǔn)確的差異表達(dá)結(jié)果，也可用兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行校正。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)geNorm和Normfinder軟件對(duì)5個(gè)熒光定量PCR分析的候選內(nèi)參基因在短小芽孢桿菌的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估，篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因并

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Screening of Reference Genes in Bacillus pumilus by Real-time Fluorescence Quantitative PCR

HE Ting-ting SONG Ting WANG Chao ZHANG Chang-bin WANG Hai-yan
（College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610065）

In order to study the gene expression in Bacillus pumilus through real-time fluorescence quantitative PCR，we need to determine the appropriate reference gene firstly. The expressions of five candidate reference genes（16S rRNA，mecA，cadR，rpoB，and sphP）under different fermentation phases of B. pumilus were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR，and their expression stabilities were evaluated by geNorm and NormFinder software. According to the analysis by geNorm software，16S rRNA and mecA were the most stable genes and the number of optimal reference genes were 2. Analysis by NormFinder software revealed that mecA was the most stable gene. The differential expressions of 3 functional genes of B. pumilus indicated that 16S rRNA and mecA were appropriate reference genes，moreover，expression abundance of mecA was moderate，thus it was more suitable to be used as a reference gene in studying structural gene. Additionally，2 reference genes can also be used for calibration in order to acquire more accurate results.

Bacillus pumilus；real-time fluorescence quantitative PCR；reference gene；geNorm；NormFinder

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.11.028

2016-03-31

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）（2012AA022204）

賀婷停，女，碩士研究生，研究方向：分子進(jìn)化；E-mail：305795664@qq.com

王海燕，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：分子遺傳學(xué)及基因工程；E-mail：hayawang@scu.edu.cn