王鑫 白倩 徐奎 裘秀春 范清宇 馬保安

高強度周期性靜水壓對人軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及II 型膠原分泌的影響

王鑫 白倩 徐奎 裘秀春 范清宇 馬保安

目的 體外觀察高強度周期性靜水壓對人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)及其 II 型膠原分泌水平的影響。方法 取正常成人膝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用兩步酶消化法體外分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，分為 2 組：對照組，不施加壓力；高壓實驗組，應(yīng)用多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力加載裝置施加 10.0 mPa 壓力，共 5 天，每日 2 h。甲苯胺藍染色法鑒定軟骨細(xì)胞；倒置相差顯微鏡觀察加壓后軟骨細(xì)胞形態(tài)的變化；利用透射電鏡觀察加壓后軟骨細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的變化。II 型膠原免疫組織化學(xué)染色法檢測并半定量分析加壓后軟骨細(xì)胞 II 型膠原分泌水平的變化。結(jié)果 經(jīng)高強度壓力作用后，與對照組相比，高壓實驗組軟骨細(xì)胞從形態(tài)上由多邊形或不規(guī)則形變?yōu)殚L梭形，胞膜、胞質(zhì)回縮，細(xì)胞量明顯減少，生長稀疏；透射電鏡觀察顯示，高壓實驗組軟骨細(xì)胞出現(xiàn)染色體分布不均、染色體邊集等細(xì)胞凋亡指征；II 型膠原免疫組織化學(xué)染色及半定量分析顯示，高壓實驗組軟骨細(xì)胞染色面積 ( 43.76±5.61 ) %，較對照組染色面積 ( 61.64±6.19 ) % 相比，大小和程度均明顯降低 ( P＜0.05 )。結(jié)論 超過人生理范圍的高強度壓力作用，可視為一種機械應(yīng)力損傷，會引起軟骨細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的改變，并導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡和蛋白分泌的下降，以上實驗數(shù)據(jù)的獲取，為進一步研究壓力損傷與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的聯(lián)系奠定了實驗基礎(chǔ)。

軟骨細(xì)胞；壓力；超微結(jié)構(gòu)；透射電鏡；顯微鏡檢查，電子，透射；II 型膠原

現(xiàn)今已發(fā)現(xiàn)的骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA ) 病因雖然只有一部分，仍有許多未涉及的領(lǐng)域，但承重關(guān)節(jié)的負(fù)荷因素已經(jīng)得到肯定，關(guān)節(jié)內(nèi)頻繁的壓力作用和創(chuàng)傷性力量的損傷都會增加關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的風(fēng)險[1]。關(guān)節(jié)軟骨組織主要的生理作用就是支持體重和各種負(fù)載，以及減少關(guān)節(jié)活動時關(guān)節(jié)骨頭之間的摩擦。關(guān)節(jié)軟骨始終暴露在來源于體重、肌肉張力、姿勢維持和身體活動所造成的各種壓力負(fù)荷下。關(guān)節(jié)軟骨具備承受這些壓力負(fù)荷的能力主要依賴其軟骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和成分。軟骨基質(zhì)是由軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的，因此它是軟骨細(xì)胞充分發(fā)揮功能的基礎(chǔ)[2]。II 型膠原 ( type II co1lage ) 作為軟骨細(xì)胞基因表達的特異性產(chǎn)物，是軟骨基質(zhì)的主要有機成分，其質(zhì)和量的改變都會對關(guān)節(jié)軟骨的生物力學(xué)特性造成直接影響，與骨關(guān)節(jié)炎有著密切關(guān)系[3-4]。許多體外實驗研究都顯示機械應(yīng)力或靜水壓力 ( HP )對軟骨細(xì)胞代謝起到重要的調(diào)節(jié)作用，靜水壓力的加載強度、作用頻率和持續(xù)時間的變化也對體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的生物合成具有重要影響[5-10]。本研究通過給體外培養(yǎng)的人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞施加高強度的周期性靜水壓力，探討高壓力刺激對人軟骨細(xì)胞的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，及其 II 型膠原分泌水平的影響。

材料與方法

一、標(biāo)本取備

實驗標(biāo)本均取自第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科手術(shù)室急診截肢患者或骨腫瘤截肢患者的手術(shù)廢棄標(biāo)本，從中獲得無菌的正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織，標(biāo)本獲取均經(jīng)患者知情同意，共 12 例，其中男 9 例，女3 例，患者平均年齡 ( 27.60±14.53 ) 歲，均無關(guān)節(jié)病史。

二、實驗儀器與試劑

倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng) ( Olympus，Japan )；透射電子顯微鏡 ( JEM-2000EX，Japan )；多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力加載裝置；細(xì)胞培養(yǎng)箱 ( Thermo，USA )；DMEM / F12 培養(yǎng)基、胎牛血清 ( FBS，PAA，Austria )；鼠抗－人 II 型膠原一抗( Abcam，UK )；二抗試劑盒 ( Gene Tech，China )；甲苯胺藍 ( Sigma，USA )；胰蛋白酶 ( Gibco，USA )；II 型膠原酶 ( Sigma，USA )。

三、試驗方法

1.關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)與鑒定：將人膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本移至超凈臺，去除多余組織，剪切成 1 mm3左右碎塊，PBS 沖洗 3 遍；加入 0.25%胰蛋白酶，37 ℃ 消化 30 min，加入含血清培養(yǎng)液終止消化，1000 r / min 離心 5 min，收集細(xì)胞；再加入 0.2% II 型膠原酶，37 ℃ 消化 16 h，收集細(xì)胞，過濾收集細(xì)胞，PBS 洗 2 遍，加入含 10% 血清DMEM / F-12 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)。置于 37 ℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取軟骨細(xì)胞進行甲苯胺藍染色鑒定，在 6 孔板的玻片上進行細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，PBS 清洗 2 遍，4% 多聚甲醛固定，1% 甲苯胺藍( Sigma，USA ) 染色 30 min，無水乙醇脫水，中性樹膠封片。倒置相差顯微鏡下觀察并照相記錄。

2.實驗分組和壓力處理：本實驗采用自行設(shè)計并已申請國家實用新型專利 ( 專利號：CN20322 9539U ) 的多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力加載裝置進行壓力處理。該系統(tǒng)以培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液作為媒介將壓力傳遞給軟骨細(xì)胞[11-12]，以注入壓縮氣體來升高容器內(nèi)壓力。本實驗分為 2 組：正常對照組 ( Control )、高壓實驗組 ( 10.0 mPa )。將實驗用軟骨細(xì)胞濃度調(diào)整為 1×106/ml，待細(xì)胞貼壁約20%～30% 時，將高壓實驗組細(xì)胞放入高壓恒溫靜水壓加載系統(tǒng)中，加載 10.0 mPa 高強度壓力，恒溫加壓培養(yǎng)，每天加壓培養(yǎng) 2 h，共 5 天；正常細(xì)胞組為不施加壓力的對照組，常規(guī)條件下培養(yǎng)。

3.倒置相差顯微鏡觀察：倒置相差顯微鏡觀察壓力實驗前后對照組和實驗組軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化和生長情況，并照相記錄。

4.透射電鏡的標(biāo)本制備與觀察：取正常對照組和高壓實驗組軟骨細(xì)胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化3 min，充分吹打使細(xì)胞完全離壁，置離心管內(nèi)，3000 r / min，離心半徑 14.5 cm，離心 15 min，輕輕吸出上清液，加入 3% 戊二醛固定液，將細(xì)胞團( 1 mm3大小 ) 固定 3 h。用 0.1 mol / L 磷酸緩沖液漂洗細(xì)胞團 3 次，每次 10 min，加入 1% OsO4固定液后固定 2 h。以 0.1 mol / L 磷酸緩沖液洗 3 次，每次 10 min。用 50%、70%、95% 丙酮系列脫水各10 min。100% 丙酮脫水 2 次，各 10 min。100% 丙酮與包埋劑 ( Epon812 ) 按 1∶1 混合，浸透細(xì)胞團30 min，換純包埋劑過夜。60 ℃ 聚合 24 h，超薄切片 ( 厚度約 50 nm )，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色。標(biāo)本用 JEM-2000EX 透射電鏡 ( Bar 2.0 μm ) 觀察、照相。

5.II 型膠原免疫組織化學(xué)染色：取正常對照組和高壓實驗組軟骨細(xì)胞，分別在 6 孔板中的玻片上進行細(xì)胞爬片，細(xì)胞濃度 1×105/ml。細(xì)胞貼壁后，取出并沖洗玻片，4% 多聚甲醛室溫固定 20 min，雙蒸水沖洗 10 min；1% Tritonx-100 處理 10 min，PBS洗 3 次；3% H2O2處理 15 min，PBS 洗 3 次。血清封閉 20 min，去除血清，滴加 1∶100 稀釋的 II 型膠原單克隆抗體，濕盒 4 ℃ 孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，溫室孵育 1 h。滴加 DAB 顯色 3 min，雙蒸水沖洗，蘇木素復(fù)染 30 s，無水乙醇脫水，中性樹膠封片，倒置相差顯微鏡下觀察并照相記錄。采用圖像分析系統(tǒng) image-pro plus 對兩組軟骨細(xì)胞的染色面積及程度進行半定量分析。每組 10 張片子的染色面積百分比取平均值統(tǒng)計分析對比。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、甲苯胺藍染色鑒定軟骨細(xì)胞

實驗用軟骨細(xì)胞經(jīng)甲苯胺藍染色后，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞周圍可見藍紫色異染顆粒，單層生長的軟骨細(xì)胞區(qū)域呈淺藍色，集落生長或多層生長的軟骨細(xì)胞區(qū)域呈深藍色 ( 圖 1 )。

二、倒置相差顯微鏡觀察

壓力加載實驗后，正常對照組軟骨細(xì)胞膜伸展，呈多邊形或不規(guī)則形，細(xì)胞間接觸緊密，呈典型鋪路石樣 ( 圖 2a )。高壓實驗組軟骨細(xì)胞多呈長梭形，細(xì)胞膜不夠舒展，胞質(zhì)回縮，細(xì)胞量較少，且生長稀疏 ( 圖 2b )。

三、軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

壓力加載實驗后，正常對照組軟骨細(xì)胞細(xì)胞核大，核膜完整，核內(nèi)陷，有 1～3 個大小不等的核仁，核仁明顯，主要為常染色質(zhì)；細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)育良好，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少見，線粒體結(jié)構(gòu)正常；胞膜完整，胞質(zhì)內(nèi)偶見溶酶體、脂滴，胞漿豐富、糖原顆粒密集分布 ( 圖 3a )。高壓實驗組軟骨細(xì)胞染色體分布不均勻、出現(xiàn)染色體邊集等細(xì)胞凋亡指征；細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，呈囊泡狀，線粒體擴張、嵴消失、空泡化；胞膜不完整，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量的溶酶體和脂肪滴，部分細(xì)胞內(nèi)可見到空泡，糖原顆粒失去正常密度 ( 圖 3b )。

圖1 甲苯胺藍染色鑒定軟骨細(xì)胞 ( × 200 )Fig.1 Identification of chondrocytes by toluidine blue staining ( × 200 )

圖2 a～b：光學(xué)顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞 ( × 100 )Fig.2 a - b: To observe the chondrocytes by light microscopy ( × 100 )

圖3 a～b：透射電鏡觀察軟骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) ( Bar 2.0 μm )Fig.3 a - b: The ultrastructure of chondrocytes were observed by transmission electron microscopy ( Bar 2.0 μm )

四、II 型膠原免疫組織化學(xué)染色

壓力加載實驗后，觀察染色圖發(fā)現(xiàn)，兩組軟骨細(xì)胞 II 型膠原免疫組織化學(xué)染色均呈陽性反應(yīng)，細(xì)胞核為蘇木素襯染的藍色，胞漿及細(xì)胞外基質(zhì)染色為棕黃色，且正常對照組軟骨細(xì)胞 ( 圖 4a ) 的染色面積及程度明顯高于高壓實驗組軟骨細(xì)胞 ( 圖 4b )。采用 image-pro plus 系統(tǒng)對兩組棕黃色染色面積進行圖像分析，正常對照組軟骨細(xì)胞染色面積百分比為( 61.64±6.19 ) %，高壓實驗組軟骨細(xì)胞染色面積百分比為 ( 43.76±5.61 ) %，配對 t 檢驗結(jié)果顯示 ( t＝6.726 )，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )。

圖4 a～b：II 型膠原免疫組織化學(xué)染色 ( × 100 )Fig.4 a - b: Collagen type II immunohistochemical staining ( × 100 )

討 論

在各種體力活動和體育運動中，承重關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)軟骨表現(xiàn)出優(yōu)良的力學(xué)性能。有研究表明，關(guān)節(jié)內(nèi)適當(dāng)?shù)臋C械應(yīng)力刺激對關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和功能保持具有重要意義[13-14]。與此相反，異常的機械應(yīng)力( 如持續(xù)不斷的壓力或沖擊性壓力 ) 會導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡和軟骨基質(zhì)的降解，并可能最終導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[15]。另外，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的代謝能力也取決于機械應(yīng)力因素的影響[16-17]。體外實驗研究顯示了壓力負(fù)荷作為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)器的重要性。

在機械應(yīng)力的作用下，軟骨細(xì)胞通過改變其代謝水平和力學(xué)傳導(dǎo)過程來合成和維持軟骨基質(zhì)。軟骨細(xì)胞對這些機械應(yīng)力刺激的反應(yīng)引起了關(guān)節(jié)軟骨基因表達的變化、蛋白質(zhì)的合成、基質(zhì)的組成和最終的生物力學(xué)性能。Nerucci 等[18]研究了周期性靜水壓力及持續(xù)性靜水壓力對骨關(guān)節(jié)炎和正常軟骨形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的影響，在接近生理狀態(tài)的周期性靜水壓力下正常軟骨細(xì)胞沒有任何改變，骨關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞在形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)方面均表現(xiàn)出修復(fù)，而受持續(xù)靜水壓力的正常及骨關(guān)節(jié)炎軟骨則表現(xiàn)出不同程度的退變，證實靜水壓力會影響蛋白、細(xì)胞骨架和細(xì)胞器，壓力對軟骨細(xì)胞的壓縮導(dǎo)致細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的變形，以及物理化學(xué)方面的改變，包括基質(zhì)液體含量的改變、固定電荷密度的改變、流動離子濃度和滲透壓的改變等，且軟骨的這種反應(yīng)會根據(jù)壓力加載的強度、頻率和持續(xù)時間來進行調(diào)整[5-6,13,19-20]。有研究證實，較低的循環(huán)靜水壓 ( 1～5 mPa ) 對軟骨細(xì)胞的新陳代謝[21-22]和形態(tài)維持有積極的作用[23]，在人的日常生活中，正常步態(tài)情況下其膝關(guān)節(jié)經(jīng)常遇到的壓力水平約為 3～5 mPa，這種強度的壓力并沒有改變軟骨細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞器和骨架結(jié)構(gòu)，而在一些劇烈活動或高負(fù)荷損傷中，壓力可以達到甚至超過 8～10 mPa[17]。我們采用壓力的時間盡可能短 ( 2 h )，以盡量模擬生理條件下人膝關(guān)節(jié)內(nèi)的壓力環(huán)境，目的在于研究周期性高強度靜水壓 ( 10 mPa ) 對體外培養(yǎng)的人承重關(guān)節(jié)正常軟骨細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞器和蛋白分泌的影響。本實驗利用多功能恒溫體外細(xì)胞培養(yǎng)中高壓靜水壓力加載裝置對軟骨細(xì)胞施加高強度的周期性靜水壓力后，與未施加壓力的對照組比較，在已超出人正?；顒酉リP(guān)節(jié)軟骨所受壓力范圍上限的高強度壓力( 10 mPa ) 作用下，高壓實驗組軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)改變，并在微觀結(jié)構(gòu)上出現(xiàn)染色體分布不均、染色體邊集等細(xì)胞凋亡指征。有研究發(fā)現(xiàn)，軟骨承受壓力后會引起軟骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)，如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器含量、結(jié)構(gòu)的變化[24-25]，這些變化會直接影響軟骨細(xì)胞合成基質(zhì)的功能，軟骨細(xì)胞胞質(zhì)主要由不同的膠原成分、蛋白酶、蛋白多糖組成，其中 II 型膠原含量最多并且也是最具特征的指標(biāo)，可以通過其來確定軟骨細(xì)胞的表型。II 型膠原免疫組織化學(xué)染色見軟骨細(xì)胞及胞外基質(zhì)呈棕黃色則為陽性，高壓實驗組軟骨細(xì)胞的 II 型膠原分泌和表達量明顯減少。說明模擬人生理條件下膝關(guān)節(jié)在劇烈活動和承受高負(fù)荷時關(guān)節(jié)內(nèi)所受壓力的高強度周期性靜水壓力可能造成對軟骨細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞器和骨架結(jié)構(gòu)的損傷，影響其關(guān)鍵蛋白的分泌，促進軟骨細(xì)胞的凋亡與壞死。本研究通過體外模擬人負(fù)重關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過度受壓情況，試從微觀層面和關(guān)鍵蛋白分泌的角度對軟骨細(xì)胞的壓力損傷機制進行探索，除上述結(jié)論外，通過實驗我們還發(fā)現(xiàn)在高強度靜水壓力作用下，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加的同時伴有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞壞死，對此現(xiàn)象本實驗將繼續(xù)進一步研究。本研究通過已建立的壓力實驗?zāi)Ｐ涂捎行У貙㈧o水壓力的力學(xué)信號傳導(dǎo)給細(xì)胞，但力學(xué)信號是如何轉(zhuǎn)化為細(xì)胞的生物學(xué)信號，從而發(fā)揮作用的，其機制和通路目前尚不明確，也是下一步實驗研究的方向。

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( 本文編輯：李貴存 )

Effects of high-intensity cyclical hydrostatic pressures on the ultrastructure and type II collagen expression of chondrocytes of knee joint in human

WANG Xin, BAI Qian, XU Kui, QIU Xiu-chun, FAN Qing-yu, MA Bao-an.
Lintong Sanatorium, Lanzhou Military Command of Chinese People’s Liberation Army ( PLA ), Xi’an, Shanxi, 710600, PRC

Objective To investigate the effects of high-intensity cyclic hydrostatic pressures on the ultrastructure and type II collagen contents of chondrocytes of the knee joint cultured in vitro in human.Methods The normal chondrocytes of human knee joint were isolated and cultured in vitro.The 3rd generation of chondrocytes were treated with high-intensity cyclical hydrostatic pressures ( 10.0 mPa ) by the multifunctional thermostatic high-insensitive hydrostatic pressure loading device for 2 h per day lasting for 5 days.Toluidine blue staining and immunohistochemical staining of type II collagen were employed to identify the chondrocytes.Cell morphology was observed by light microscopy.The ultrastructure of chondrocytes were observed by transmission electron microscopy ( TEM ).Type II collagen immunohistochemical staining and semi-quantitative analysis were performed to measure contents and expression of type II collagen of chondrocytes in 2 groups.Results Compared with the control group, cell morphology changed from irregular polygon into long spindle, membrane and cytoplasm retracted, the number of cells was reduced significantly and grew sparsely in the 10.0 mPa group.TEM showed that various apoptosis indications such as uneven distribution and margination of chromosomes in the 10.0 mPa group.Collagen type IIimmunohistochemistry and semi-quantitative analysis showed that the percent of stained area of control group and 10.0 mPa group was ( 61.64 ± 6.19 ) % and ( 43.76 ± 5.61 ) %, compared with the control group, the stained area and extent of chondrocytes were significantly decreased in the 10.0 mPa group ( P ＜ 0.05 ).Conclusions The highintensity pressure over human physiological range can be regarded as a mechanical injury to result in cell apoptosis, morphology and intracellular ultrastructural changes of human chondrocytes, and also decrease protein expression ofhuman chondrocytes.These data provide the experimental basis for studying the relationship between stress injury and pathogenesis of osteoarthritis.

Chondrocytes; Pressure; Ultrastructure; Transmission electron microscopy; Collagen type IIchondrocytes pressure; Microscopy, electron, transmission; Collagen type II

10.3969/j.issn.2095-252X.2016.12.009

Q256

710600 西安，中國人民解放軍臨潼療養(yǎng)院 ( 王鑫 )；710005 西安，中國人民解放軍第 518 醫(yī)院骨科 ( 白倩 )；710038 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院全軍骨科中心暨全軍骨腫瘤研究所 ( 徐奎、裘秀春、范清宇、馬保安 )

馬保安，Email: maban@fmmu.edu.cn

2016-07-27 )