伊六喜，斯欽巴特爾，侯建華，張輝，高風(fēng)云，周宇

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特010031）

亞麻花蕾發(fā)育中MS2－F基因的原位雜交

伊六喜1，2，斯欽巴特爾2，侯建華1，張輝2，高風(fēng)云2，周宇2

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特010019；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特010031）

本研究采用常規(guī)石蠟切片方法和原位雜交技術(shù)，以雄性可育株和雄性不育株亞麻為材料，利用T7和SP6引物對體外轉(zhuǎn)錄合成地高辛標(biāo)記的MS2－F基因特異cRNA探針，并與亞麻花蕾切片進行原位雜交，觀察MS2－F mRNA在亞麻花蕾內(nèi)的時空表達信號。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：亞麻MS2－F在四分體時期和小孢子發(fā)育早期的花蕾絨氈層中有雜交信號，而在四分體時期之前的絨氈層細(xì)胞中，沒有MS2－F雜交信號；該基因從四分體時期開始到形成小孢子早期的絨氈層細(xì)胞中表達，進一步證明了該基因在亞麻花蕾發(fā)育過程中起著非常重要的作用，但是否具有關(guān)鍵性的作用需要進一步的深入研究。

亞麻；花蕾；基因；原位雜交

亞麻（Linum musitatissimum）MS2－F基因是亞麻中首次克隆的核雄性不育相關(guān)基因。該基因與玉米、油菜、小麥、甜菜等多種植物雄性不育基因具有同源性，其中同源性最高是油菜的基因MS2Bnap和擬南芥MS2（male sterility 2），分別為59.65%、59.16%。另外水稻和小麥等作物的脂酞輔酶A還原酶的基因具有較高的同源性。諸多研究報道該基因具有脂酞輔酶A還原酶的作用［1］。其cDNA大小為1709 bp，該基因開放閱讀框架為1608 bp，編碼535個氨基酸，5′端非編碼區(qū)為70 bp，3′端非編碼區(qū)為3l bp。MS2－F基因含有兩個雄性不育保守區(qū)：NAD結(jié)合區(qū)的氨基酸序列從第52到第354；雄性不育C－末端區(qū)的氨基酸序列是從第468到第526。8個內(nèi)含子的大小分別為：385 bp，75 bp，76 bp，75 bp，69 bp，88 bp，130 bp和89 bp，共計990 bp。此基因的內(nèi)含子兩端均有明顯的GT／AG結(jié)構(gòu)［1］。Northern雜交結(jié)果表明，該基因只在花蕾中表達，而在根、莖、葉中未見表達。

組織原位雜交包括取材、固定、制片、RNase滅活、雜交和檢測等主要過程。組織原位雜交探針制備與Southern和Northern雜交相同。取材時應(yīng)取便于觀察細(xì)胞分裂的材料，如植物幼葉、莖尖、胚乳及花蕾等，有必要時可以用化學(xué)或物理方法對對材料進行預(yù)處理。植物原位雜交石蠟切片中通常選擇4%的多聚甲醛、卡爾諾氏和FFA固定液。樣品的固定時間和固定劑的量為樣品的大小以及固定劑的穿透速度而決定，一般植物組織器官的固定時間為24 h左右。固定后制片，用DEPC水處理實驗用具，盡量降低RNA的降解。雜交和自顯影過程中關(guān)鍵點多、程序復(fù)雜，通常出現(xiàn)靈敏性不高和非特異性等問題［2－4］。

地高辛是目前非放射性標(biāo)記物中應(yīng)用最多的一種。需注意探針制備過程必須在超凈工作臺上進行并所有地高辛試劑保持冰浴，避免RNA的降解。地高辛標(biāo)記的探針雜交體的檢出是利用抗地高辛抗體與地高辛發(fā)生免疫結(jié)合，抗地高辛抗體上帶有酶標(biāo)記可通過酶反應(yīng)檢出［5］。一個酶標(biāo)記抗體占據(jù)20個核甘酸的空間位置，所以標(biāo)記時要選取適宜的反應(yīng)條件，使每隔20～25個核苷酸摻入一個標(biāo)記的核苷酸［6］。

1 實驗材料

1.1 植物材料

供試材料為“亞麻（H919）”，將亞麻種子播種，在開花期，采集不同發(fā)育階段的幼花蕾，投入新配制的4%多聚甲醛（PFA）進行固定。

1.2 引物

T7引物，序列為：5′－TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG－3′

SP6引物，序列為：5′－ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA－3′

由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2 實驗方法

2.1 RNA酶的滅活

防止RNase污染是整個實驗成功與否的關(guān)鍵，實驗操作之前（包括樣品的固定、預(yù)雜交和雜交）雜交所用具和溶液都要進行RNase滅活。

2.2 花蕾切片的制作

采集亞麻花蕾迅速放入小瓶中，加入花蕾體積25倍左右的4%多聚甲醛。將蓋好瓶塞，用注射器多次抽氣直至花蕾全部沉入瓶底為止，除去氣泡。4℃固定過夜。脫水、透明、包埋：50%乙醇2 h→70%乙醇2 h→80%乙醇2 h→95%乙醇2 h→無水乙醇2 h→無水乙醇2 h→無水乙醇：二甲苯（3：1）2 h→無水乙醇：二甲苯（1：1）2 h→無水乙醇：二甲苯（1：3）2 h→二甲苯1 h→二甲苯1 h→二甲苯：石（1：1）60℃12 h，使二甲苯充分蒸發(fā)→純石蠟兩次。然后按常規(guī)石蠟包埋程序包埋。切片，切片厚度8 μm。切片用DEPC－H2O45℃展片和貼片，37℃烘烤過夜。

2.3 探針模板的制備

PCR擴增反應(yīng)：以亞麻MS2－F基因重組質(zhì)粒為模板，先擴增出兩端帶有T7和SP6啟動子的線性DNA（約1600 bp）為作探針合成與標(biāo)記的模板。PCR反應(yīng)體系：重組質(zhì)粒DNA 2 μl、2xTaq PCR Master Mix 25 μl、T7引物1 μl、Sp6引物1 μl、ddH2O21 μl、終體積50 μl。擴增參數(shù)為：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，46.5℃30 s，72℃2 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。

2.4 PCR產(chǎn)物的回收與體外轉(zhuǎn)錄

PCR產(chǎn)物需經(jīng)回收純化。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，切下1600 bp處條帶，用凝膠DNA回收試劑盒回收純化。以增出兩端帶有T7和SP6啟動子的線性DNA（約1600 bp）為作探針合成與標(biāo)記的模板，用T7和SP6 RNA聚合酶分別合成地高辛標(biāo)記的反義和正義MS2－F cRNA探針。轉(zhuǎn)錄體系：線性DNA模板10 μl、DEPC水3 μl、10xNTP標(biāo)記混合液2 μl、10x轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μl、RNase抑制劑1 μl、T7或SP6RNA聚合酶2 μl、終體積20 μl。

2.5 原位雜交

原位雜交技術(shù)不斷的完善和技術(shù)革新亦有了很大的發(fā)展，組織原位雜交日益受到廣泛重視，以往以Southern和Northern雜交為主的逐漸轉(zhuǎn)向以組織原位雜交，并繼續(xù)完善組織原位雜交技術(shù)的操作步驟，原位雜交實驗周期長，程序復(fù)雜，且關(guān)鍵點多，

本實驗參考國內(nèi)外其他研究人員相關(guān)研究方法［7－10］，并結(jié)合本實驗具體情況摸索調(diào)整。

具體操作步驟如下：

1）預(yù)處理取出切片復(fù)溫干燥至室溫后，經(jīng)二甲苯和不同梯度的乙醇脫蠟并復(fù)水，用DEPC水處理；PBS洗2次，每次3 min；然后用含2%TritonX－100的PBS處理10 min，再用PBS洗2次；再用含0.5%H2O2的甲醇室溫處理30 min，DEPC水清洗3次后于37℃用蛋白酶K消化15 min，PBS洗3次，每次5 min，室溫晾干。

2）預(yù)雜交和雜交每張切片滴加150 μl預(yù)雜交緩沖液，45℃避光溫育30 min；甩去預(yù)雜交緩沖液，每片滴加探針／雜交工作液100 μl，輕輕蓋上硅化的蓋玻片，置入盛有2×SSC緩沖液的濕盒內(nèi)，42℃過夜（16～18 h）。

3）雜交后處理雜交后的切片于37℃的2×SSC中漂洗，去除蓋玻片，然后于2×SSC中洗2次，每次5 min，0.5×SSC洗1次，每次15 min，0.2×SSC洗2次，每次15 min。

4）免疫反應(yīng)及顯色每片加100 μl封阻溶液37℃封阻30 min；去凈封阻溶液后，每片滴加100 μl兔抗地高辛－BSA抗體溶液，放入濕盒中，37℃避光溫育60 min。以0.05 mol／L的PBS洗4次，每次5 min；然后每片滴加100 μl AP－羊抗兔IgG溶液，放入濕盒中，37℃避光溫育60 min，0.05mol／L的PBS洗4次，每次5 min。每片滴加200 μl的NBT／BCIP顯色液于標(biāo)本上，37℃濕盒中避光顯色20 min，然后充分水洗。

5）封片及觀察將切片快速經(jīng)梯度乙醇脫水（30%、50%、70%、95%和100%），二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察拍攝。

3 結(jié)果與分析

3.1 亞麻MS2－F cRNA探針的合成及標(biāo)記結(jié)果

以亞麻MS2－F基因重組質(zhì)粒DNA為模板，用T7和SP6接頭引物與質(zhì)粒中目的基因兩端的T7和SP6啟動子序列結(jié)合進行PCR擴增，產(chǎn)生兩端帶有T7和SP6啟動子的線性DNA（1600 bp），以此DNA作為探針合成與標(biāo)記的模板，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后結(jié)果如圖1所示，擴增出的條帶清晰明亮，在其上方?jīng)]有明顯的非特異性條帶，對實驗結(jié)果不產(chǎn)生影響。利用PCR擴增得到的線性DNA作為模板，回收純化后通過體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)，用T7和SP6 RNA聚合酶分別合成地高辛標(biāo)記的反義和正義MS2－F探針。轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)物的電泳圖2，A泳道為轉(zhuǎn)錄后的初始產(chǎn)物，其中含有線性的DNA摸板；B泳道為經(jīng)無RNase的DNaseI消化后的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，已去除了質(zhì)粒DNA摸板。由圖可知，轉(zhuǎn)錄出的mRNA量大且農(nóng)度較高。

圖1 探針模板PCR擴增Fig.1 PCR amplification of probe template

圖2 RNA探針電泳圖Fig.2 Electrophoresis analysis of RNA probe

3.2 原位雜交結(jié)果

用地高辛標(biāo)記的亞麻MS2－F cRNA探針與亞麻花蕾切片進行原位雜交，檢測MS2－F mRNA在亞麻花蕾的時空表達。觀察雜交的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MS2－F基因在亞麻花粉發(fā)育的四分體時期之前花蕾中沒有表達信號，在四分體時期（圖3）和小孢子早期（圖4）絨氈層中有特異性表達信號。

從圖3a中可以看出，在四分體時期花蕾中有陽性雜交信號，信號主要分布在絨氈層細(xì)胞中；同步進行的陰性對照，即正義探針對照（圖3b）和空白對照（圖3c）未見雜交信號，說明陽性信號是特異性雜交的結(jié)果。

從圖4a中可以看到，在小孢子早期時的花蕾絨氈層中也有陽性雜交信號，信號分布在絨氈層，同步進行的陰性對照，即正義探針對照（圖4b）和空白對照（圖4c）未見雜交信號，說明陽性信號是特異性雜交的結(jié)果。

原位雜交結(jié)果表明，該基因在亞麻花粉發(fā)育過程中起著非常重要的作用，Aarts等人從擬南芥克隆出核雄性不育基因MS2之后在野生擬南芥花蕾切片組織原位雜交結(jié)果基本一致。但是否具有關(guān)鍵性的作用需要進一步的深入研究。

圖3 四分體時期雜交結(jié)果Fig.3 Expression of MS2－F mRNA in tetrad period

圖4 小孢子早期雜交結(jié)果Fig.4 Expression of MS2－F mRNA in microspore period

4 討論

亞麻是自花授粉作物，天然異交率很低，一般為1%左右。但可育株亞麻花由于顏色鮮艷、花冠張開，容易引誘昆蟲菜花，促進異花授粉；田間花粉也可以借助風(fēng)力進行花間傳送，造成異花授粉。而雄性不育亞麻的花瓣不能充分展開，幾乎沒有天然異交率，因而難以用于雜交種的生產(chǎn)［7－9］。近幾年，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，促進了分子水平上研究亞麻雄性不育。1975年顯性雄性核不育亞麻發(fā)現(xiàn)之后又首次克隆亞麻雄性不育基因MS2－F，為獲得轉(zhuǎn)雄性不育基因亞麻提供了珍貴的材料，將進一步廣泛應(yīng)用于亞麻遺傳育種方面［10］。利用組織原位雜交技術(shù)進一步檢測研究在亞麻花蕾與其他組織細(xì)胞內(nèi)雄性不育相關(guān)基因的表達模式，為雜交優(yōu)勢以及亞麻改良中奠定理論依據(jù)［11，12］。

為了深入了解MS2－F基因的生物學(xué)功能，本研究用地高辛標(biāo)記的亞麻MS2－F RNA探針雜交體的檢出亞麻花蕾中的具體表達部位和時間，從亞麻花粉母細(xì)胞發(fā)育到成熟花粉過程中的MS2－F mRNA進行雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞麻MS2－F在四分體時期和小孢子早期的花蕾絨氈層中有特異性表達，而表達量在花蕾的不同發(fā)育階段有所不同，具有階段性：在四分體時期之前的絨氈層細(xì)胞中，沒有MS2－F雜交信號；從四分體時期開始到形成小孢子早期，信號主要分布在絨氈層細(xì)胞中，且逐漸減弱。從MS2－F時空表達信號上看，本研究與Aarts等人從擬南芥克隆出核雄性不育基因MS2之后在野生擬南芥花蕾切片組織原位雜交結(jié)果即絨氈層和四分體時期與剛從四分體釋放的小孢子時期表達結(jié)果基本一致［13］。原位雜交結(jié)果表明，該基因在亞麻花粉發(fā)育過程中起著非常重要的作用，但是否具有關(guān)鍵性的作用需要進一步的研究。

5 結(jié)論

了解了MS2－F基因的在亞麻花蕾中的具體表達模式，亞麻MS2－F基因在四分體時期和小孢子早期的花蕾中有特異性表達，信號主要分布在絨氈層細(xì)胞中。該基因在亞麻花粉發(fā)育過程中起著非常重要的作用。通過對常規(guī)石蠟切片技術(shù)和組織原位雜交的熟練掌握和對RNA探針合成體系及原位雜交體系的摸索優(yōu)化，總結(jié)建立了一套完整的從切片到探針合成，再到原位雜交的技術(shù)體系，為其它基因的表達研究提供了很好的借鑒。

［1］斯琴巴特爾，李強，張輝，等.顯性核不育亞麻可育、不育花蕾mRNA差異表達研究及差異片段分析［J］.生物技術(shù)通報，2009，（8）：67－70

［2］向正華，劉厚奇.核酸探針與原位雜交技術(shù)［M］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2001：29－30

［3］Bischoff F，Vahlkamp L，Molendijk A，et al.Localiza－tion of AtROP4 and AtROP6 and interaction with the guanine nucleotide dissociation inhibitor AtRhoGDI1 from Arabidopsis［J］.Plant Mol Biol，2000，42（3）：515－530

［4］Nadeau J A，Zhang X S，Li J，et al.Ovule development identification of stage－specific and tissue－specific cDNAs［J］.Plant Cell，1996，（8）：213－239

［5］Liang W H，Tang C R，Wu N H，et al.Cloning and characterization of a new actin gene from Oryza sativa L［J］.Progress in Natural Science，2004，14（10）：867－874

［6］Coen E S，Romero J M，Doyle S，et al.Floricaula：a homeotic gene required for flower development in Antirrhinum majus［J］.Cell，1990，63：1311－1322

［7］Dang Z H，Zhang J P，She X C，et al.Induction male sterility in linseed by Antibiotics treatment［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2000，22（1）：46－48

［8］Worrall D，Hird D L，Hodge R，et al.premature dissolution of the micr－Osporocyte callose wall cause male sterility in transgenic tobacco［J］.Plant cell，1992（4）：759－771

［9］Colcombet J，Boisson D A，Ros P R，et al.Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASES1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation［J］.Plant Cell，2005，17（12）：3350－3361

［10］Sorensen A M，Krober S，Unte U S，et al.The Arabidopsis A BORTED MICROSPORES（A M S）gene encodes a M Y C class transcription factor［J］.Plant J，2003，33（2）：413－423

［11］李雪林，楊書化，張澤民，等.植物雜種優(yōu)勢遺傳機制的分子遺傳學(xué)研究進展［J］.植物學(xué)通報，2003，23（3）：62－65

［12］姜文，伊六喜，高鳳云，等.亞麻花蕾發(fā)育相關(guān)基因的表達研究［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2015，30（5）：104－107

［13］Aarts M，Dirksc W G，Stekema W J，et al.Transposon tagging of a male sterility gene in Arabidopsis［J］，Nature，1993，（363）：715－717

Hybridization of Gene MS2－F in Flax Anther

YI Liuxi1，2，SIQIN Bateer2，HOU Jianhua1，ZHANG Hui2，GAO Fengyun2，ZHOU Yu2
（1.Institute of Agronomy，Inner Mongolia Agriculture University，Huhhot 010019，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Husbandry Sciences，Hohhot 010031，China；）

In the study，the conventional paraffin method was applied to explore the period and process of pollen aborsion in dominant nuclear sterile flax using male fertile and male sterile flax separated from the dominant nuclear sterile flax line as material.Temporal and spatial expression of male sterility related gene MS2－F in flax anther was studied.Digoxin labeled MS2－F specific cRNA probe was synthesized in vitro using T7 and SP6 primers，and was hybridized with flax anther slice.Strong hybridization signal was observed in the tapetum from the period of tetrad to the early period of microspore development，and no hybridization signal was observed during pre－tetrad period，proving that MS2－F was specifically expressed in tapetum during the period of tetrad and microspore early development.

flax；flower bud；gene；in situ hybridization

S563.2

A

1671－3532（2016）06－0263－05

2016－8－30

內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科技創(chuàng)新基金（2011CXJJM01－2）；國家自然科學(xué)基金（31160288）

伊六喜（1986－），男，助理研究員，在讀博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。yiliuxivip＠163.com

*通訊作者：斯欽巴特爾（1965－），研究員，男，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。nmgbaater＠163.com