唐 紅，唐曉琴，鄧 飛，李 昕，陳 波，唐明希，阮思蓓

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川 瀘州 646000；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518102；3.西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)解剖教研室，四川 瀘州 646000)

?

研究報告

presenilin-1/presenilin-2雙基因敲除小鼠的壽命觀察

唐 紅1，唐曉琴1，鄧 飛2，李 昕1，陳 波3，唐明希1，阮思蓓1

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川 瀘州 646000；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518102；3.西南醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)解剖教研室，四川 瀘州 646000)

目的觀察Presenilin-1/Presenilin-2 雙基因敲除小鼠(dKO mice)的生存曲線，為進一步繁殖及使用該模型對阿爾茨海默病(AD)進行研究提供實驗設(shè)計等提供參考。方法將dKO mice雌性50只，雄性30只，及野生型同系小鼠雌、雄各20只分為4組，觀察正常喂養(yǎng)情況下4組間小鼠2年以內(nèi)各自的生存情況及壽命，繪制生存曲線進行生存分析。結(jié)果dKO mice隨著時間的延長，雌、雄性生存概率分別低于野生型雌、雄性小鼠，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.001；P<0.001；P<0.001)；dKO mice雌、雄性之間的生存概率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論條件性敲除presenilin-1與presenilin-2 雙基因可能會縮短小鼠的壽命，其生存概率顯著低于野生型小鼠，而dKO mice雌、雄性之間的生存概率則無統(tǒng)計學(xué)差異。本實驗結(jié)果可為借助此模型的實驗設(shè)計應(yīng)用提供有益參考。

dKO mice；條件性基因敲除；小鼠；壽命

早老素1(presenilin-1，PS1)基因與早老素2(presenilin-2，PS2)基因分別位于14號染色體和1號染色體上，其基因突變是引發(fā)家族型阿爾茨海默病(familial Alzheimer’s disease，F(xiàn)AD)的重要原因之一[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，PS1/PS2雙基因敲除小鼠(dKO mice)模型具有年齡依賴性的一系列類似阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的神經(jīng)退行性病癥，如神經(jīng)元變性、壞死、膠質(zhì)增生及后期的癡呆行為等[3-5]。本研究通過觀察dKO mice的生存曲線，以期對該模型的生存期有更進一步的了解，對實驗動物選擇、繁殖，以及應(yīng)用本模型對AD研究的實驗設(shè)計等提供有益參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

親代小鼠(基因型為fPS1/fPS1，PS2-/-，Cre+/-)由美國Ya-Ping Tang教授(Louisiana State University，USA)惠贈，品系為B6CBAF1，利用Cre/loxP系統(tǒng)，即Cre的啟動子α鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ，來驅(qū)動Cre在整個前腦興奮性神經(jīng)元的特異性表達(dá)，但γ-氨基丁酸 (GABA)能神經(jīng)元并不表達(dá)Cre，因此PS1在此神經(jīng)元里并沒被敲除，這種將前腦中的PS1基因進行特異性敲除稱為條件性敲除，所得雜合子與基因打靶技術(shù)將PS2基因進行全身性敲除所得雜合子雜交而來[5]。子代dKO mice的繁殖與基因型鑒定如我們報道所述[6]。動物分組：基因型鑒定合格的實驗組dKO mice雌性50只、雄性30只，對照組野生型同系小鼠(購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】)雌、雄各20只。

1.2 實驗環(huán)境

實驗動物飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障設(shè)施內(nèi)【SYXK(川)2013-065】，每盒不超過4只，溫度控制在(18～22)℃，濕度控制在40%～60%，12 h/12 h光照周期，全程喂飼成都達(dá)碩實驗動物有限公司生產(chǎn)的SPF級大小鼠生長繁殖飼料。鼠盒、墊料、飼料及飲水均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理，每周更換鼠盒及墊料2次，保證充足的飼料和飲水，飼養(yǎng)過程嚴(yán)格按照屏障設(shè)施SOP操作。

1.3 觀察方法

dKO mice和野生型小鼠按性別分籠飼養(yǎng)，生存時間以小鼠的出生時間為觀察起點，觀察每只小鼠自然衰老的過程及生存到2年時的死亡情況，記錄出生日期及自然死亡日期，并繪制生存曲線。在規(guī)定實驗的時間內(nèi)仍然存活的數(shù)據(jù)為刪失數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，生存時間以中位生存時間表示，采用非參數(shù)估計法Kaplan-Meier法(K-M法)進行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲線的比較

實驗期間，雌性野生型小鼠有4只由于打架受傷等原因死亡，實驗組有45只不明確切原因死亡。對雌性dKO mice和雌性野生型小鼠的生存情況進行統(tǒng)計分析，兩種小鼠的刪失情況如(表1)所示。雌性dKO mice生存概率隨著時間的延長逐漸降低，顯著低于雌性野生型小鼠的生存概率(χ2=33.737，P<0.001)。兩種小鼠的生存曲線如(圖1)所示。

2.2 雌性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲線的比較

實驗期間，雄性野生型小鼠有3只由于打架受傷等原因死亡。對雌性dKO mice和雄性野生型小鼠的生存情況進行統(tǒng)計分析，兩種小鼠的刪失情況如(表2)所示。經(jīng)比較雌性dKO mice生存概率低于雄性野生型小鼠的生存概率，兩種小鼠的生存時間存在顯著差異(χ2=34.486，P<0.001)。兩種小鼠的生存曲線如(圖2)所示。

表1 雌性dKO mice和雌性野生型小鼠刪失情況Tab.1 Case processing summary of female dKO mice and female wild-type mice

表2 雌性dKO mice和雄性野生型小鼠刪失情況Tab.2 Case processing summary of female dKO mice and male wild-type mice

圖1 雌性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲線比較Fig.1 Survival curves of female dKO mice and female wild-type mice

圖2 雌性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲線比較Fig.2 Survival curves of female dKO mice and male wild-type mice

2.3 雄性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲線的比較

實驗期間，雄性dKO mice有26只不明確切原因死亡。對雄性dKO mice和雌性野生型小鼠的生存情況進行統(tǒng)計分析，兩種小鼠的刪失情況如(表3)所示。經(jīng)比較雄性dKO mice生存概率顯著低于雌性野生型小鼠的生存概率(χ2=25.971，P<0.001)，兩種小鼠的生存曲線如(圖3)所示。

圖3 雄性dKO mice和雌性野生型小鼠生存曲線比較Fig.3 Survival curves of male dKO mice and female wild-type mice

2.4 雄性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲線的比較

對雄性dKO mice和雄性野生型小鼠的生存情況進行統(tǒng)計分析，兩種小鼠的刪失情況如(表4)所示。經(jīng)比較雄性dKO mice生存概率低于雄性野生型小鼠的生存概率，兩種小鼠的生存時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=28.278，P<0.001)。兩種小鼠的生存曲線如(圖4)所示。

圖4 雄性dKO mice和雄性野生型小鼠生存曲線比較Fig.4 Survival curves of male dKO mice and male wild-type mice

表3 雄性dKO mice和雌性野生型小鼠刪失情況Tab.3 Case processing summary of male dKO mice and female wild-type mice

表4 雄性dKO mice和雄性野生型小鼠刪失情況Tab.4 Case processing summary of male dKO mice and male wild-type mice

表5 不同性別的dKO mice刪失情況Tab.5 Gender difference of case processing summary in the dKO mice

圖5 不同性別dKO mice生存曲線比較Fig.5 Gender difference of survival curves in the dKO mice

2.5 dKO mice不同性別的生存曲線比較

對不同性別的dKO mice生存情況進行比較，刪失情況如(表5)所示。雌性dKO mice中位生存時間為542 d、雄性為583 d，經(jīng)比較不同性別之間dKO mice的生存曲線無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=1.892，P=0.169)。不同性別dKO mice的生存曲線如(圖5)所示。

3 討論

在對AD進行研究過程中，由于人腦組織獲得的困難性決定了利用動物模型的重要性，尤其針對像AD等與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性病變的研究更為重要。研究表明，敲除PS1基因的小鼠將出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育缺陷以及胚胎致死，而利用Cre/loxP系統(tǒng)將前腦中的PS1基因進行條件性敲除的小鼠可以存活和繁殖；而敲除PS2基因的小鼠僅表現(xiàn)出輕微的肺纖維化[4-5]。本實驗所用的親代小鼠如Feng R等[5]所述，將前腦中的PS1基因進行條件性敲除的小鼠與PS2基因敲除的小鼠雜交得到，該動物模型存活情況良好，雖然腦中缺乏Aβ的沉積，但表現(xiàn)出AD樣神經(jīng)退行性疾病的其他表型，如學(xué)習(xí)記憶能力下降、認(rèn)知功能減退、大腦皮質(zhì)與海馬萎縮、側(cè)腦室和第三腦室的擴大、大量神經(jīng)元凋亡、以及神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白高度磷酸化等[3,6]。dKO mice的成功繁殖與飼養(yǎng)是利用其作為研究AD動物模型的基礎(chǔ)，對其壽命的了解是順利進行AD研究，尤其對其晚期(≥18月齡)的發(fā)病機制研究及藥物干預(yù)等試驗設(shè)計具有重要的參考價值。

基因敲除小鼠是把小鼠的一個或幾個基因敲除后，培養(yǎng)出用于基礎(chǔ)及臨床實驗的動物模型，從而更全面的模仿、認(rèn)識以及研究人類疾病。在利用動物模型進行人類疾病研究的同時，對其生存、行為、代謝等研究也不容忽視[7]。動物的壽命因種別、品系不同而長短不一，敲除不同的基因?qū)π∈髩勖挠绊懸部赡軙煌u N等[8]發(fā)現(xiàn)條件性敲除成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)基因會導(dǎo)致小鼠的壽命縮短；Hellekant G等[9]通過對鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白1(CALHM1)基因研究發(fā)現(xiàn)，敲除CALHM1基因的小鼠生存時間比野生型小鼠長近1年的時間；Kawai H等[10]研究發(fā)現(xiàn)敲除GD3合酶基因?qū)π∈蟮陌l(fā)育和壽命都沒有影響。敲除雙基因?qū)π∈蟮膲勖部赡軙杏绊?，如Koval M等[11]發(fā)現(xiàn)敲除小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的連接蛋白Cx40 和Cx43基因會導(dǎo)致小鼠肺自發(fā)性功能障礙和纖維化，使其壽命明顯縮短。本實驗通過觀察dKO mice和野生型小鼠的生存狀況，發(fā)現(xiàn)dKO mice中位生存時間雌性為542 d，雄性為583 d，隨著時間的延長，雌、雄性dKO mice生存概率逐漸降低，均分別顯著低于雌、雄性野生型小鼠的生存概率(P<0.001；P<0.001；P<0.001；P<0.001)，而dKO mice不同性別之間的生存曲線無統(tǒng)計學(xué)差異。

可見，敲除presenilin-1/-2 雙基因可能會縮短小鼠的壽命，但對其不同性別間的影響無明顯差別。此信息有助于我們利用此模型對AD，尤其是對于大于18月齡的dKO mice(晚期AD)動物實驗的實驗設(shè)計等具有重要的參考價值。當(dāng)然，在自然狀態(tài)下，雌、雄小鼠共同生活，有兩性間的親密接觸、情感交流及相互依賴，還會發(fā)生交配、繁殖生育、哺乳等不同情況，而本實驗中的dKO mice和野生型小鼠均按性別分籠飼養(yǎng)，與自然狀態(tài)下有所不同，這些都有可能對小鼠，尤其對dKO mice的病情及壽命可能會有一定的影響。另外，我們的實驗設(shè)計數(shù)量不是很多，這也有可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此，在今后的工作中對于dKO mice的生存情況有待進一步觀察與研究。

[1] 黃少軒,婁季宇,白宏英. 阿爾茨海默病相關(guān)基因研究進展[J]. 中國實用神經(jīng)疾病雜志, 2016, 04: 82-84.

[2] Xia D, Watanabe H, Wu B,etal. Presenilin-1 knockin mice reveal loss-of-function mechanism for familial Alzheimer’s disease [J]. Neuron. 2015, 85(5): 967-981.

[3] 薛小琳,王霆,孟博,等. Presenilin-1/2雙基因條件性敲除小鼠作為阿爾茲海默病動物模型的研究進展 [J]. 中國新藥雜志, 2013, 13: 1530-1537.

[4] Chen Q, Nakajima A, Choi SH,etal. Loss of presenilin function causes Alzheimer’s disease-like neurodegeneration in the mouse [J]. J Neurosci Res. 2008, 86(7): 1615-1625.

[5] Feng R, Wang H, Wang J,etal. Forebrain degeneration and ventricle enlargement caused by double knockout of Alzheimer’s presenilin-1 and presenilin-2 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004, 101(21): 8162-8167.

[6] 張元,郭慶喜,劉勇,等. Presenilin-1/Presenilin-2雙基因敲除小鼠的繁育及基因型鑒定 [J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2014, 11: 2052-2054.

[7] 石宏,何偉,王曉宇,等. TRPV1和ASIC3基因敲除小鼠的壽命觀察 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 10: 78-81+89.

[8] Su N, Xu X, Li C,etal. Generation of Fgfr3 conditional knockout mice [J].Int J Biol Sci. 2010, 6(4): 327-332.

[9] Hellekant G, Schmolling J, Marambaud P, et al. CALHM1 Deletion in Mice Affects Glossopharyngeal Taste Responses, Food Intake, Body Weight, and Life Span [J]. Chem Senses. 2015, 40(6): 373-379.

[10] Kawai H, Allende ML, Wada R,etal. Mice expressing only monosialoganglioside GM3 exhibit lethal audiogenic seizures [J]. J Biol Chem. 2001, 276(10): 6885-6888.

[11] Koval M, Billaud M, Straub AC,etal. Spontaneous lung dysfunction and fibrosis in mice lacking connexin 40 and endothelial cell connexin 43 [J]. Am J Pathol, 2011, 178(6): 2536-2546.

Investigation on life span of presenilin-1/presenilin-2 conditional double knockout mice

TANG Hong1,TANG Xiao-qin1, DENG Fei2, LI Xin1,CHEN Bo3, TANG Ming-xi1, RUAN Si-bei1

(1.Department of Pathology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000, Chian; 2.Department of Pathology, the Affiliated Shenzhen Hospital of Southern Medical University, Guangdong Shenzhen 518102, Chian; 3.Department of Anatomy, Southwest Medical University, Sichuan Luzhou 646000, China)

Objective To analyze the survival curves of presenilin-1/presenilin-2 conditional double knockout mice (dKO mice), and provide a reference for further breeding of this strain of mice and studying the pathogenesis of Alzheimer’s disease (AD). Methods dKO mice (50 females and 30 males) and wild-type controls (20 females and 20 males) were included in this study. The survival of all the mice was observed under the same condition of feeding and nutrition for two years. Life span of each mouse was calculated, survival curves were drawn, and their survival was analyzed. Results With the passing of time, the survival probability was decreased in dKO mice. The survival probabilities of female and male dKO mice were significantly worse than that of wild-type controls, respectively (P<0.001,P<0.001;P<0.001,P<0.001). No significant difference was observed between the males and females of dKO mice. Conclusions Double knockout presenilin-1 and presenilin-2 genes may shorten the life span of mice, but there is no significant gender difference between the males and females of dKO mice.

dKO mice; Conditional knockout; Mice; Life span

四川省科技廳科技支撐計劃(2012SZ0172)；四川省教育廳重點項目(16ZA0196)；西南醫(yī)科大學(xué)-瀘州市科技局聯(lián)合資助項目(2015LZCYD-S06(6/11))；西南醫(yī)科大學(xué)重點項目(2015-YJ002)；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院科研項目(15056，15087)。

唐紅，女，副教授。E-mail:136810735@qq.com；唐曉琴為共同第一作者。

阮思蓓(1988-)，女，醫(yī)師。 研究方向：臨床及實驗病理學(xué)。 E-mail: 294834533@qq,com；唐明希，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0006-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.002

2016-07-28