韓析言

(上海市浦東新區(qū)東方醫(yī)院，上海 200120)

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研究報告

加味丹參飲體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化的實驗研究

韓析言

(上海市浦東新區(qū)東方醫(yī)院，上海 200120)

目的探討加味丹參飲體外誘導骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)向心肌樣細胞分化的實驗研究。方法采用貼壁法獲取大鼠BMSCs，流式細胞術檢測細胞表面抗原。MTT法檢測加味丹參飲對BMSCs最大無毒濃度，用第3代細胞分組誘導：正常對照組，加味丹參飲組，5-氮胞苷組，加味丹參飲+5-氮胞苷組，應用western blot檢測各組細胞結(jié)合蛋白(Desmin)，α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)，心肌肌鈣蛋白T(cTnT)蛋白表達，RT-PCR法檢測各組細胞GATA-4，縫隙連接蛋白43(CX43)及Nkx2-5 mRNA表達。結(jié)果大鼠BMSCs表面CD90陽性率高于95%，CD34及CD45陽性率低于5%。加味丹參飲對BMSCs最大無毒濃度為0.625 g/L。與正常對照組比較，加味丹參飲組，5-氮胞苷組，加味丹參飲+5-氮胞苷組中Desmin，α-MHC及cTnT蛋白表達量上調(diào)，GATA-4，CX43及Nkx2-5 mRNA表達量上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與加味丹參飲組或5-氮胞苷組比較，加味丹參飲+5-氮胞苷組中Desmin，α-MHC及cTnT蛋白表達量上調(diào)，GATA-4，CX43及Nkx2-5 mRNA表達量上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論加味丹參飲能夠誘導BMSCs向心肌樣細胞轉(zhuǎn)化，與5-氮胞苷聯(lián)合給藥具有協(xié)同作用。

加味丹參飲；骨髓間充質(zhì)干細胞；心肌樣細胞；5-氮胞苷；分化

冠心病是危害人類健康的世界性問題，在治療中所產(chǎn)生的心肌缺血再灌注，使得心肌損傷嚴重，心肌細胞數(shù)量減少，并最終發(fā)展為缺血性心力衰竭甚至死亡[1-4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)，胚胎干細胞等外源性干細胞對于心肌、肝、腎等器官缺血再灌注損傷具有顯著的治療效果[5-7]。其中BMSCs是一種來源于中胚層的間充質(zhì)干細胞，1976年由Friedenstein等發(fā)現(xiàn)，1991年由Caplan正式命名。BMSCs存在于骨髓，肝臟，臍帶及胎盤等組織器官中，具有自我更新，多向分化潛能，亦具有低免疫源性，易獲取、易擴增、易保存等特點，可以在不同誘導因子及環(huán)境下分化為心肌細胞，軟骨細胞，成骨細胞，脂肪細胞，神經(jīng)元細胞等多種組織細胞，可塑性極強[5-7]。同時近年來研究還發(fā)現(xiàn)三七總皂苷，黃芪甲苷，加味丹參飲，淫羊藿苷等中醫(yī)藥能夠與BMSCs共培養(yǎng)，從而提高BMSCs的誘導分化能力，并且二者在移植過程中發(fā)揮了減毒增效的作用[5, 7]。其中加味丹參飲是黃政德教授在清代陳念祖《時方歌括》中丹參飲藥方中演化出來的，臨床上已用于治療血瘀證不穩(wěn)定心絞痛，缺血性心肌病并等[8-9]，藥理實驗也表明加味丹參飲誘導的BMSCs移植能顯著改善大鼠心肌缺血再灌注損傷(IRI)[10-11]。而結(jié)合蛋白(Desmin)，α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)，心肌肌鈣蛋白T(cTnT)，GATA-4，縫隙連接蛋白43(CX43)及Nkx2-5是心肌特異性蛋白，促進上述蛋白的表達，能一定程度上的恢復心肌細胞形態(tài)及數(shù)量。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

100±20 g的SD雄性大鼠20只，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司【SCXK(滬)2012-0002】。所有大鼠均在同濟大學附屬東方醫(yī)院動物實驗室【SYXK(滬)2016-0001)】清潔環(huán)境下飼養(yǎng)觀察，適應性喂養(yǎng)1周后使用。

1.2 主要試劑及儀器

5-氮胞苷購自美國sigma公司；兔抗結(jié)合蛋白(Desmin)，α-肌球蛋白重鏈(α-MHC)多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗心肌肌鈣蛋白T(cTnT)多克隆抗體購自美國Abcam公司；FITC標記CD34，CD45，CD90抗體購自加拿大Cedarlane公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，胎牛血清，DMEM養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；BCA試劑盒，小鼠抗GAPDH單克隆抗體購自碧云天生物技術有限公司；trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀購自北京六一儀器廠；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國BD公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀購自瑞士TECAN公司。

1.3 大鼠骨髓來源的MSCs的分離、培養(yǎng)及純化[12-14]

將SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉后脫頸處死，75%乙醇消毒體表，PBS沖洗后置于超凈臺，取下脛骨和股骨，并剔除周圍結(jié)締組織，PBS沖洗。組織鉗剪掉脛骨和股骨的骨端，使骨髓腔暴露，利用7號針頭穿刺，反復用含DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，1500 r/min，離心10 min，并用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，以1×106/mL密度接種于50 cm2培養(yǎng)瓶中，在37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)。48 h首次換液，去除未貼壁細胞，以后每隔3 d換液，并每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)及拍照。重復上述操作，當細胞生長密度達到80%～90%的時候，進行1∶2傳代，傳代到第3代。

1.4 BMSCs表面抗原鑒定

取生長密度達到80～90%的第3代BMSCs細胞，0.25%胰酶消化后配制成單細胞懸液，將Falcon管編號，并按順序加入FITC熒光標記的CD34，CD45，CD90單克隆抗體20 μL，室溫孵育20～30 min，PBS洗滌未標記抗體，并離心，最后1 mL PBS重懸細胞，并用4%多聚甲醛固定，在流式細胞儀上檢測上述抗原表達。

1.5 加味丹參飲提取物的獲取[10]

加味丹參飲由丹參20 g，檀香6 g，川芎6 g，當歸6 g，紅花6 g，赤芍10 g，生地黃12 g組成。所有藥材均由我院藥劑科提供。將上述藥材按比例稱取250 g，并回流提取2次，時間依次為2 h，1 h，提取液于37℃恒溫水浴箱中濃縮，并1200 r/min，離心15 min，同時于無菌條件下，用0.22 μm膜過濾，收集濾液，并用培養(yǎng)基調(diào)整生藥濃度為1 g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MTT法檢測加味丹參飲對BMSCs的細胞毒性

取生長密度達到80%～90%的第3代BMSCs細胞，0.25%胰酶消化后配制成單細胞懸液，并以5×104/mL密度接種于96孔板，每孔200 μL，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，實驗組分別每孔加入20 μL(10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.156，0.078，0.039，0.019)g/L，后加入含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基180 μL，另設細胞對照組，只含細胞及15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL，同時設空白對照組，不含細胞，只有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基200 μL。每個濃度設4個復孔。培養(yǎng)48 h后，加入50 μL 1×MTT，4 h后棄上清液，每孔加 150 μL DMSO，在 570 nm 波長處檢測每孔的光密度(OD值)，細胞增殖抑制率=(細胞對照組OD值-實驗組OD值)/(細胞對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.7 實驗分組

將第3代的BMSCs誘導分組：總共4組，第1組為正常對照組(只含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，第2組為加味丹參飲組(加味丹參飲提取物最大無毒濃度)，第3組為5-氮胞苷組(5-氮胞苷10 μmol/L)，第4組為(加味丹參飲提取物最大無毒濃度+5-氮胞苷10 μmol/L)。24 h去除培養(yǎng)基，PBS洗滌后，按上述分組進行誘導培養(yǎng)，72 h后，進行western blot及RT-PCR實驗。

1.8 Western blot

按“1.7”分組誘導細胞后，收集細胞，加入RAPI裂解液裂解細胞30 min，1200 r/min離心10 min，收集的上清液即是蛋白樣品。BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白煮沸變性10 min，定量，上樣，進行SDS凝膠電泳1～2 h，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌3次。次日加二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，并滴加ECL曝光液，于凝膠成像系統(tǒng)曝光。用“Quantity one”軟件分析各蛋白灰度值。

1.9 RT-PCR

按“1.7”分組誘導細胞后，收集細胞，參考trizol試劑盒說明書提取總RNA，并利用紫外分光光度計檢測RNA純度。采用一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著擴增，最后將獲得的擴增產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳，并拍照。引物分別加入25 μL PCR反應體系中，反應條件為94℃變性45 s，59℃復性45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。 引物如下，GATA-4上游引物：5’-CCAACTGCCAG ACTACCACC-3’，下游引物：5’-CAAACCCAGCAC CCTTATCC-3’。 CX-43上游引物：5’-CTATGTGA TGCGAAAGGA-3’，下游引物：5’-AGGAAACAGTC CACCTGA-3’。 Nkc2-5上游引物：5’-CCGAGCTCC CAGGAGAAGGGCGAGA-3’，下游引物：5’-GCTCT AGAGGTCCTGTTGGGTCCGT-3’。GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物的：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學變化

原代細胞剛接種時呈圓形亮點，懸于培養(yǎng)液中，24 h大部分貼壁。48 h首次換液，去除未貼壁細胞，此時細胞形態(tài)不一，有小突起，呈多角形，短梭形或者多邊形。5-6 d細胞增殖迅速，大部分呈扁平狀。10-12 d細胞融合呈單層。傳代到第3代，細胞形態(tài)較為一致，呈紡錘形，并平行樣或漩渦樣生長(如圖1所示)。

圖1 BMSCs形態(tài)學(第3代)Fig.1 The morphology of BMSCs (the third-passage)

2.2 BMSCs表面抗原鑒定

如圖2所示，經(jīng)流式細胞術檢測結(jié)果表明細胞表面抗原CD90陽性率高于95%，CD34及CD45陽性率低于5%，從而說明本實驗獲得高純度的BMSCs，能用于后續(xù)實驗。

2.3 加味丹參飲對BMSCs的細胞毒性

如表1所示，當加味丹參飲提取物濃度高于1.25 g/L，且隨著藥物濃度的增高，細胞增殖抑制率逐漸提高，而當加味丹參飲提取物濃度低于0.625 g/L，且隨著藥物濃度降低，細胞增殖抑制率降低，且在此濃度時，細胞增值率為-1.55%，即為加味丹參飲提取物對細胞無毒性最大濃度。

2.4 加味丹參飲誘導后BMSCs中Desmin，α-MHC及cTnT蛋白的表達

如圖3所示，與正常組比較，加味丹參飲組，5-氮胞苷組及加味丹參飲+5-氮胞苷組中Desmin，α-MHC及cTnT蛋白表達量顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與加味丹參飲組或5-氮胞苷組比較，加味丹參飲+5-氮胞苷組中Desmin，α-MHC及cTnT蛋白表達量顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖2 BMSCs表面抗原鑒定Fig.2 Results of BMSCs surface antigen identification

表1 加味丹參飲對BMSCs的細胞毒性Tab.

注：A：正常對照組；B：加味丹參飲組；C：5-氮胞苷組；D：加味丹參飲+5-氮胞苷組。與正常對照組比較，**P<0.01；與加味丹參飲組或5-氮胞苷組比較，##P<0.01。

2.5 加味丹參飲誘導后BMSCs中GATA-4，CX43及Nkx2-5 mRNA的表達

如圖4所示，與正常組比較，加味丹參飲組，5-氮胞苷組及加味丹參飲+5-氮胞苷組中GATA-4，CX43及Nkx2-5 mRNA表達量顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與加味丹參飲組或5-氮胞苷組比較，加味丹參飲+5-氮胞苷組中GATA-4，CX43及Nkx2-5 mRNA表達量顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注： A：正常對照組；B：加味丹參飲組；C：5-氮胞苷組；D：加味丹參飲+5-氮胞苷組。與正常對照組比較，**P<0.01；與加味丹參飲組或5-氮胞苷組比較，##P<0.01。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷在中醫(yī)學中歸屬于“胸痹心痛”“真心痛”等范疇。因此許多學者將中醫(yī)藥同BMSCs等干細胞相結(jié)合，借助中藥多靶點，毒副作用小，在BMSCs的增殖，分化及移植過程中發(fā)揮減毒增效作用，通過提高BMSCs體外存活率，促進BMSCs增殖，并誘導BMSCs定向分化，減少BMSC移植過程中的毒副作用及不良反應[5, 7]。中醫(yī)藥如三七總皂苷，丹酚酸B，淫羊藿苷，黃芪甲苷，加味丹參飲在BMSCs定向分化為心肌細胞中起重要作用[5-7]。其中加味丹參飲是黃政德教授結(jié)合自身經(jīng)驗，并參考清代經(jīng)典名方《時方歌括》中的丹參飲從而演化出來的，其方主要包括丹參入血，檀香行氣化滯，生地黃，當歸正濡養(yǎng)之本，全方具有行氣活血，通絡止痛之功效。臨床上已證實加味丹參飲對血瘀證不穩(wěn)定心絞痛具有顯著改善作用[8]，此外黃政德教授課題組還發(fā)現(xiàn)加味丹參飲能夠聯(lián)合動員大鼠骨髓干細胞，從而提高心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌功能及治療作用，另外還發(fā)現(xiàn)加味丹參飲血清誘導的BMSCs移植對于心肌缺血再灌注大鼠具有顯著的治療作用，與促進大鼠壞死心肌組織心肌特異性蛋白表達有關[10-11]。從而說明加味丹參飲能通過誘導BMSCs向心肌細胞分化，進而恢復壞死心肌細胞數(shù)量，達到心肌IRI治療作用。

本研究首先通過貼壁法培養(yǎng)純化大鼠BMSCs，并通過流式細胞術檢測BMSCs純度，流式細胞術結(jié)果顯示造血前體細胞標志抗原CD34及白細胞標志抗原CD45陽性率皆小于5%，而CD90陽性率高于95%，說明我們獲得了高純度的BMSCs，可以用于后續(xù)的實驗研究。我們采用MTT法檢測不同濃度加味丹參飲[(10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.156，0.078，0.039，0.019)g/L]對BMSCs的細胞毒性，結(jié)果表明0.625 g/L是加味丹參飲提取物對BMSCs的最大無毒性濃度，所以此濃度被我們用于后續(xù)研究。同時5-氮胞苷是國內(nèi)外通用的BMSCs定向誘導成心肌細胞的誘導劑，其是一種去甲基化合物，在一定劑量范圍能顯著的誘導BMSCs，并移植到缺血心肌，從而提高BMSCs向心肌遷移及分化的能力[15-17]。因此5-氮胞苷被我們用來作為陽性對照。

Desmin，α-MHC，cTnT，CX43是心肌特異性蛋白，其中Desmin是一種中間絲蛋白，是肌細胞中肌絲的主要成分，在肌纖維形態(tài)，細胞核與細胞膜連接，及肌小節(jié)信號間傳遞中起重要作用。α-MHC是肌球蛋的重鏈，其表達水平是BMSCs等干細胞分化成心肌細胞的重要標志[18]。cTnT是心肌膠原纖維主要的收縮調(diào)節(jié)蛋白，能夠調(diào)節(jié)粗、細肌絲的滑行，是檢測心肌源性細胞的特異標志物。CX43主要存在于心房及心室肌內(nèi)，能夠與橋粒，中間連接組成閏盤，當CX43呈陽性表達，說明心肌細胞具有閏盤結(jié)構，能夠維持細胞間化學信號傳遞及信息交流，并能維持心肌細胞電生理活動，對心肌功能的發(fā)揮起重要作用[19]。因此檢測上述心肌特異性蛋白的表達，能一定程度上反映加味丹參飲誘導BMSCs分化成心肌細胞的能力，western blot及RT-PCR結(jié)果表明與正常對照組比較，加味丹參飲組，5-氮胞苷組及加味丹參飲+5-氮胞苷組Desmin，α-MHC及cTnT蛋白表達量顯著上調(diào)，CX43 mRNA表達量顯著上調(diào)，且聯(lián)合作用組優(yōu)于單獨給藥組，說明加味丹參飲具有顯著誘導BMSCs向心肌細胞分化的能力，且與5-氮胞苷具有協(xié)調(diào)作用。

另外GATA-4是與心臟發(fā)育密切相關的轉(zhuǎn)錄因子，最早在心前期中胚層表達，后表達于心內(nèi)膜和心肌中，對心肌細胞的發(fā)生分化起調(diào)節(jié)作用。有研究顯示GATA-4陽性表達是胚胎干細胞向心肌細胞分化的啟動因素，是心肌細胞發(fā)育的前提條件，是心肌前體細胞最早標志之一[20]。Nkx-2.5也是心肌前體細胞的標志基因之一，與GATA-4之間存在相互調(diào)控作用，能共同調(diào)節(jié)心臟發(fā)育，心肌發(fā)生等過程[21]。有研究證實外源性表達Nkx2-5基因能夠誘導P19細胞向心肌細胞分化，同時上調(diào)GATA-4，α-MHC，cTnT等心肌特異性蛋白表達[22]。因此本研究進一步通過RT-PCR檢測GATA-4及Nkx-25 mRNA表達，結(jié)果證實加味丹參飲及5-氮胞苷單獨或者聯(lián)合誘導皆能上調(diào)GATA-4及Nkx-25 mRNA表達。

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Experimental study of Jiawei Danshen Yin on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into myocardium-like cells in vitro

HAN Xi-yan

(The Oriental Hospital of Pudong, Shanghai 200120, China)

Objective To explore experimental study of Jiawei Danshen Yin on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) into myocardium-like cells in vitro. Methods Rat BMSCs were isolated by adherent method, and their surface antigen were detected by flow cytometry. The maximal non-toxic concentration of Jiawei Danshen Yin was measured by MTT method. The isolated and purified BMSCs were divided into four groups: normal control group, Jiawei Danshen Yin group, 5-azacitidine group, Jiawei Danshen Yin plus 5-azacitidine group. The expression of desmin, α-myosin heavy chain (α-MHC) and cardiac troponin T (cTnT) protein was detected by western blot. The expression of GATA-4, gap junction connexin 43 (CX43) and Nkx2-5 mRNA was detected by RT-PCR. Results The percentage of CD90 positive cells in the rat BMSCs was higher than 95%, and the proportions of CD34 positive and CD45 positive cells was lower than 5%. The maximum toxic concentration of Jiawei Danshen Yin on BMSCs was 0.625 g/L. Compared with the normal control group, the expression of desmin, α-MHC and cardiac cTnT protein was up-regulated, the expression of GATA-4, CX43 and Nkx2-5 mRNA was up-regulated in Jiawei Danshen Yin group, 5-azacitidine group and Jiawei Danshen Yin plus 5-azacitidine group. The difference was statistically significant (P<0.01). Compared with Danshen Yin group or 5-azacitidine group, the expression of desmin, α-MHC and cardiac cTnT protein was up-regulated, the expression of GATA-4, CX43 and Nkx2-5 mRNA was up-regulated in Jiawei Danshen Yin plus 5-azacitidine group. The difference was statistically significant (P<0.01). Conclusion Jiawei Danshen Yin could induce BMSCs differentiation into myocardium-like cells, which had a synergistic effect with 5-azacitidine.

Jiawei Danshen Yin; Bone marrow mesenchymal stem cells; Myocardium-like cells; 5-azacitidine; differentiation

韓析言(1989-)，男，碩士生，研究方向：中藥及干細胞治療心血管疾病。E-mail:jc0554@163.com。

R-332

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1671-7856(2016)11-0043-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.008

2016-05-23