朱科燕，蔡月琴，徐孝平，陳 誠(chéng)，馬全鑫，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

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技術(shù)方法

血液樣本處理方式對(duì)Wistar大鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的影響

朱科燕，蔡月琴，徐孝平，陳 誠(chéng)，馬全鑫，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053)

目的觀察血液樣本處理方式對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果的影響。方法取體重180～220 g的SPF級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，禁食不禁水12 h后，用3%戊巴比妥鈉麻醉后取全血和肝素抗凝血各3 mL。將每種血樣分別置于3個(gè)1.5 mL的離心管和肝素抗凝管中各1 mL，并分別在室溫放置1 h、2 h、4 h后進(jìn)行離心，測(cè)定血糖、血脂、蛋白、肝功能、腎功能、心肌酶等指標(biāo)。結(jié)果血液樣本類型和采集后離心前的放置時(shí)間對(duì)Wistar大鼠的血清或血漿TC、TG、TP、ALB、ALT、ALP、BUN和CREA等指標(biāo)均無(wú)明顯影響(P>0.05)。但血漿的GLU值顯著高于血清(P<0.05，P<0.01)，并隨著采集后離心前放置時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降。血清AST和CK、LDH值則均顯著高于血漿(P<0.05，P<0.01)，且隨采集后離心前放置的延長(zhǎng)呈現(xiàn)持續(xù)顯著的上升(P<0.05，P<0.01)。而采集后離心前放置時(shí)間對(duì)Wistar大鼠血漿AST和CK、LDH值均無(wú)明顯影響(P>0.05)。結(jié)論血液樣本類型對(duì)血脂、蛋白和腎功能指標(biāo)無(wú)明顯影響，但對(duì)GLU、AST、CK、LDH等檢測(cè)結(jié)果有一定影響。采集后離心前的放置時(shí)間延長(zhǎng)可導(dǎo)致血清血漿GLU下降，血清AST、CK、LDH升高，但對(duì)血漿AST、CK、LDH指標(biāo)無(wú)明顯影響。

Wistar大鼠；血清；血漿；血液生化指標(biāo)

血液生化指標(biāo)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最常用的生理學(xué)指標(biāo)，不僅對(duì)動(dòng)物正常生理狀態(tài)的判定及其飼養(yǎng)有指導(dǎo)意義，而且也是食品、藥品、以及化學(xué)物質(zhì)等毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)及人類疾病研究中探討發(fā)病機(jī)制、選擇動(dòng)物的重要依據(jù)和指標(biāo)。血液生化檢測(cè)結(jié)果易受諸多因素的影響，如動(dòng)物品種、來(lái)源、年齡、體重、飼養(yǎng)環(huán)境、檢測(cè)試劑等[1-4]。我們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)不同的血液樣本處理方式對(duì)大鼠的生化指標(biāo)檢測(cè)有一定影響，為進(jìn)一步證實(shí)這一現(xiàn)象，本文觀察了40只Wistar大鼠的血漿和血清以及采集后不同放置時(shí)間對(duì)血樣生化指標(biāo)的影響，為生物醫(yī)藥研究中進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的生化指標(biāo)檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

體重180-220 g的SPF級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2012-0002】。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心【SYXK(浙)2013-0184】，溫度20±2℃，相對(duì)濕度50%～60%，光照12 h明暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑：血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、肌酸激酶(CK)及乳酸脫氫酶(LDH)等檢測(cè)試劑盒，批號(hào)分別為07183/00001768、07129/00001506、07134/00001690、231068/50002194、022063/50002146、07167/00001867、07131/00001508、07186/00001857、07188/00001886、171035/50002289、19958/00001976、07146/00001670，由德國(guó)DiaSysDiagnotics Systems生產(chǎn)。1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器：全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI 7020)，冷凍高速離心機(jī)(BeckmanX-15R)。

1.3 方法

取體重為180～220 g的Wistar大鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥鈉麻醉后取血6 mL，分為2份血樣，一份為全血，置于3個(gè)1.5 mL的離心管中各1 mL，用于分離血清；另一份為肝素抗凝血，置于3個(gè)1.5 mL的肝素抗凝管中各1 mL，用于分離血漿。每份血樣的3個(gè)管分別在室溫(20℃～25℃)放置1 h、2 h、4 h后進(jìn)行離心，日立7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定 GLU、TC、TG、TP、AL、ALT、AST、ALP、BUN、CREA、CK、LDH等生化指標(biāo)。.其中，TP為雙縮脲法，ALB為溴甲酚氯法， ALT、AST為紫外連續(xù)監(jiān)測(cè)法，ALP為速率法，BUN為谷氨酸脫氫酶法，CREA為苦味酸法，GLU為葡萄糖氧化酶法；TC、TG為酶試劑法，CK為IFCC連續(xù)監(jiān)測(cè)法，LDH為乳酸底物法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對(duì)血糖血脂和蛋白指標(biāo)的影響

由表1可見(jiàn)，血液樣本類型和采集后離心前的放置時(shí)間對(duì)雄性和雌性Wistar大鼠的血清或血漿TC、TG、TP、ALB等指標(biāo)均無(wú)明顯影響(P>0.05)，但對(duì)血糖檢測(cè)結(jié)果有不同程度的影響。從圖1A-B可以看出，雌性Wistar和雄性Wistar大鼠的血漿的GLU值均高于血清GLU值，其中血樣在采集后離心前放置1 h、2 h后，血漿GLU顯著高于血清(P<0.05，P<0.01)。且血清和血漿的GLU值均隨著采集后離心前放置時(shí)間的延長(zhǎng)而呈持續(xù)下降(P<0.05，P<0.01)，其中，雄性Wistar大鼠的血漿的GLU值下降速度較快，血樣在采集后離心前放置4 h后，降至血清GLU同一水平值。

表1 血液樣本處理方式對(duì)血糖血脂和蛋白指標(biāo)的影響Tab.1 Effects of different sample process modes on blood glucose, lipid and protein

注：A：雌性大鼠，B：雄性大鼠。血清與血漿比較，*P<0.05，**P<0.01；與采集后離心前放置時(shí)間1h比，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 對(duì)肝腎功能指標(biāo)的影響

由表2可見(jiàn)，血液樣本類型和采集后離心前放置時(shí)間對(duì)雄性和雌性Wistar大鼠的血清ALT、ALP、BUN和CREA等指標(biāo)均無(wú)明顯(P>0.05)，但對(duì)AST有一定的影響。從圖2A-B可以看出，雄性Wistar大鼠和雌性Wistar大鼠的血清AST均顯著高于血漿AST水平(P<0.01)，且隨采集后離心前放置時(shí)間的延長(zhǎng)，血清AST值持續(xù)明顯上升(P<0.05，P<0.01)，而采集后離心前放置時(shí)間對(duì)Wistar血漿AST值無(wú)明顯影響(P>0.05)。

2.3 對(duì)心肌酶指標(biāo)的影響

由表3可見(jiàn)，血液樣本類型和采集后離心前放置時(shí)間對(duì)雄性和雌性Wistar大鼠的血清CK、LDH值有明顯影響。從圖3A-D可以看出，采集后離心前放置時(shí)間1 h、2 h、4 h后，雌性Wistar和雄性Wistar大鼠的血清CK、LDH值均顯著高于血漿CK、LDH值 (P<0.01)，且隨采集后離心前放置的延長(zhǎng)血清CK、LDH值呈現(xiàn)持續(xù)顯著的上升(P<0.01)，而采集后離心前放置時(shí)間對(duì)Wistar血漿AST值無(wú)明顯影響(P>0.05)。

表2 血液樣本處理方式對(duì)肝腎功能指標(biāo)的影響Tab.2 Effects of different sample process modes on indexes of liver and renal function

注：A：雌性大鼠，B：雄性大鼠。血清與血漿比較，*P<0.05，**P<0.01；與采集后離心前放置時(shí)間1h比，△P<0.05，△△P<0.01。

表3 血液樣本處理方式對(duì)心肌酶的影響Tab.3 Effects of different sample process modes on myocardial enzymes

3 討論

血液生化指標(biāo)是反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狀態(tài)的重要并且敏感的指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生的許多病變?cè)诓±斫M織與分子生物學(xué)指標(biāo)變化未完全表現(xiàn)出來(lái)時(shí)，可能提前在血液學(xué)及生化指標(biāo)中反映出來(lái)[5]。因此，可以根據(jù)血液學(xué)及其生化指標(biāo)的變化，來(lái)衡量受試藥物對(duì)動(dòng)物的影響程度，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

血糖、血脂、蛋白、肝功能、腎功能和心肌酶等指標(biāo)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中常用的重要血液生化指標(biāo)。我們?cè)诒敬螜z測(cè)中發(fā)現(xiàn)，不同的血液樣本處理方式對(duì)血脂、蛋白、腎功能的影響不大。不管在血清還是血漿樣本中，室溫放置不同的時(shí)間，TC、TG、TP、ALB、ALT、ALP、BUN和CREA含量均比較穩(wěn)定，沒(méi)有顯著性差異，并且血清中與血漿中的含量也比較一致。隨著血液樣本放置時(shí)間的延長(zhǎng)，白細(xì)胞降解、紅細(xì)胞對(duì)能量的消耗及葡萄糖的酵解，都可以使血液中的葡萄糖分解，從而降低血液中葡萄糖的濃度[6]。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著血液放置時(shí)間的延長(zhǎng)，血清、血漿中的GLU含量持續(xù)降低，血漿中GLU顯著高于血清，相對(duì)血清，血漿的GLU下降較快，這可能與血漿樣本在離心前，抗凝全血中的白細(xì)胞和紅細(xì)胞會(huì)消耗GLU有關(guān)。

不同的血液樣本處理方式對(duì)酶類指標(biāo)的影響較大，有文獻(xiàn)表明，血液標(biāo)本的保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，紅細(xì)胞中的物質(zhì)就會(huì)發(fā)生外滲透，使得血漿內(nèi)外濃度分布不均，從而導(dǎo)致酶類的測(cè)定結(jié)果異常[7]。有臨床資料表明LDH只能存放于室溫下，標(biāo)本置于4℃時(shí)LDH反而不穩(wěn)定, -20℃下過(guò)夜LDH4、LDH5將喪失全部活性[8]。在血清中，隨著血液放置時(shí)間的延長(zhǎng)，AST、CK和LDH含量持續(xù)增加，與臨床資料相一致[9]。但是在血漿中，血漿中AST、CK和LDH含量均顯著低于血清，不同時(shí)間組的AST、CK含量無(wú)顯著性差異，說(shuō)明血漿中這些酶的活性比較穩(wěn)定。

總之，血液樣本類型對(duì)血脂、蛋白和腎功能指標(biāo)無(wú)明顯影響，但對(duì)GLU、AST、CK、LDH等檢測(cè)結(jié)果有一定影響。采集后離心前的放置時(shí)間延長(zhǎng)可導(dǎo)致血清血漿GLU持續(xù)下降，血清AST、CK、LDH升高，但對(duì)血漿AST、CK、LDH指標(biāo)無(wú)明顯影響。

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[4] 王冬平, 隋麗華, 尚世臣, 等. 清潔級(jí)SD大鼠血液生理生化指標(biāo)的測(cè)定[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2009, 19(9):44-46.

[5] 樊軍，秦俊，劉春霞，等. 建立Wistar大鼠血液及生化指標(biāo)正常參考值范圍的探討[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué), 2010, 21(6):50-52.

[6] 鄭紅芬. 血液標(biāo)本處理方式對(duì)生化檢驗(yàn)結(jié)果的干預(yù)作用[J]. 醫(yī)藥前沿, 2016, 6(2): 349- 350.

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Effects of different sample process modes on blood biochemical indicator detection in Wistar rats

ZHU Ke-yan, CAI Yue-qin, XU Xiao-ping, CHEN Cheng, MA Quan-xin, CHEN Min-li

(Experimental Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,China)

Objective To observe the effects of different sample process modes on blood biochemical indicator detection in Wistar rats. Methods 40 Wistar rats of specific pathogen free(SPF)level, weighing 180～220 g, were took with half males and half females. After 12 h fasting, rats were anaesthetized by 3% pentobarbital sodium, blood was collected and divided into two samples. One of the samples was for whole blood and another for anticoagulation, with 3mL per serving. Each blood sample was put into three 1.5 mL centrifuge tubes and three heparin anticoagulative tubes with 1mL per, and centrifuged after putting 1 h, 2 h and 4 h in room temperature for testing blood glucose, blood lipid, protein, myocardial enzymes, indexes of liver and renal function. Results The types of blood samples and the standing time after collection and before centrifugation had no significant effect on TC, TG, ALB, ALT, ALP, BUN and CREA in serum or in plasma of Wistar rats(P>0.05).But the value of GLU in serum was significantly higher than that in plasma (P<0.05,P<0.01). With the extension of storage time after collection and before centrifugation, the value of GLU continued to decline. The values of AST, CK, LDH in serum were significantly higher than that in plasma (P<0.05,P<0.01). With the extension of storage time after collection and before centrifugation, the value of AST, CK, LDH continued to increase. However, there was no significant effect on the values of AST, CK, LDH by placing different time after collection and before centrifugation(P>0.05).Conclusion Types of blood samples had no significant effect on blood lipid, protein and indexes of renal function. However, detection value of GLU, AST, CK and LDH would be influenced on a certain degree. The extension of standing time after collection and before centrifugation resulted in plasma GLU decreasing and plasma AST, CK and LDH increasing, but has no obvious effect on the serum AST, CK and LDH.

Wistar rats；Serum；Plasm；Blood biochemical index

浙江省教育廳科研項(xiàng)目(Y201329481)，浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)( XTD201301)。

朱科燕(1982-)，女，，研究方向?yàn)閯?dòng)物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)檢測(cè)。

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: cmli991@aliyun.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0080-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.015

2016-07-01