鄭 婧

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽 550001)

?

研究報(bào)告

自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織microRNA-97a與TGF-β 1蛋白表達(dá)的改變及意義

鄭 婧

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽 550001)

目的觀察 Micro RNA-97a(miRNA-97a)與TGF-β 1蛋白在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)心肌組織中的表達(dá)改變和關(guān)系。方法取8只8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠為 SHR 組，8只8周齡雄性 Wistar大鼠為對(duì)照組，通過無創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)大鼠尾動(dòng)脈血壓，8 周后股動(dòng)脈放血處死大鼠，HE染色觀察大鼠心臟形態(tài)學(xué)改變,PCR法檢測(cè)大鼠心臟中miRNA-97a的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)TGF-β1、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)蛋白和I 型膠原(Col-Ⅰ)和Ⅲ型膠原(Col-Ⅲ)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果SHR組的收縮壓和舒張壓明顯升高，心肌CVF 和 PVCA 明顯升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平明顯升高，miRNA-97a表達(dá)水平明顯降低，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 01)。PCR結(jié)果顯示，SHR 組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平為對(duì)照組的(24. 6 ±4. 7)%，SHR 組心肌組織miRNA-97a與TGF-β 1 蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0. 785，P<0. 01)。結(jié)論SHR心肌組織 miRNA-97a表達(dá)下調(diào)，伴隨 TGF-β 1 蛋白表達(dá)升高和膠原合成增加。miRNA-97a 與TGF-β 1 可能參與 SHR 大鼠的心肌纖維化。

Micro RNA-97a; 轉(zhuǎn)化生長因子β 1; 自發(fā)性高血壓大鼠; 心肌纖維化

高血壓，冠心病等疾病在心內(nèi)科最常見[1-2]。這兩年有報(bào)道，微小核糖核酸(microRNA)可以通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后控制基因表達(dá)調(diào)控方式[3]。也有研究說明miRNA參與心肌纖維化和動(dòng)脈硬化等病理過程[4]。最近一段時(shí)間，有不少的醫(yī)務(wù)工作者稱microRNA的重要成員之一miRNA-97a與心肌重構(gòu)關(guān)系密切，很有可能成為高血壓、冠心病等疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)[5-6]。目前為止，我們對(duì)于miRNA-97a在心血管重構(gòu)中的作用及機(jī)制沒有完全清楚。本次研究探討了SHR大鼠心肌組織microRNA-97a與TGF-β1蛋白表達(dá)的改變及意義。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

表1 試劑和儀器Tab.1 Reagent and instrument

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及血壓測(cè)定

8周齡雄性 SHR16 只和Wistar 大鼠8只，均購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心【SCXK(粵) 2011-0034】，體質(zhì)量230 ± 15 g，所有大鼠均在貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(黔) 2012-0001】的清潔環(huán)境下飼養(yǎng)觀察。將SHR大鼠隨機(jī)分為 SHR 卡托普利組(SHR 干預(yù)組，n=8)、SHR 對(duì)照組(n=8)，Wistar大鼠為正常對(duì)照組;分別給予SHR大鼠卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司)10 mg/(kg·d)和蒸餾水灌服，共持續(xù)8周。成功制作SHR干預(yù)組和SHR對(duì)照組大鼠模型。

1.3 大鼠心肌組織 Masson 染色和SP法觀察TGF-β 1 蛋白表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)SP法，取出蓋玻片上用于免疫組化的大鼠心肌組織，0.01molPL PBS 漂洗2 次,并予4% 甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，并行脫蠟、水化, 對(duì)部分切片進(jìn)行PBS沖洗并加聚合物增強(qiáng)劑和大鼠抗人 TGF-β1多克隆抗體等試劑,在室溫下孵化,最后加入DAB顯色液, 用蘇木素復(fù)染色,并用中性樹脂封片。封片完畢后將切片放置顯微鏡下觀察 TGF-β1在兩組大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況, 陽性顯色為棕黃色。另一部分石蠟切片常規(guī)脫蠟后行Masson 膠原染色。每張切片任選 3 支小動(dòng)脈，測(cè)量血管周圍膠原面積比率(PVCA )。

1. 4 Western Blot 檢測(cè) TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ 蛋白表達(dá)水平

提取大鼠心臟組織的總蛋白，在100℃加熱 10 min 以使蛋白質(zhì)變性。電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，5% 的脫脂奶粉封閉 2 h，加入TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等一抗，4℃孵育過夜，選擇TGF-β1、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等酶標(biāo)二抗和稀釋濃度，孵育 1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光，拍照，分析顯影條帶。

1.5 Real-time PCR 檢測(cè)miRNA-97a表達(dá)水平

根據(jù)其mRNA 序列,設(shè)計(jì)引物。miRNA-97a引物:上游:5′ -TAC CCT ACT ACC AAT ATT-3′;下游:5′ -CCT TTC CAT CTT CCT TCG ATT-3′;產(chǎn)物長度:327 bp。AngⅡ引物:上游:5′ -ATCGGGACC AAT CAC ACT ACA -3′; 下游:5′ -CGT CTC TTCCGG CTG CTT CAA-3′;產(chǎn)物長度: 216 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物2% , 瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠分析系統(tǒng)測(cè)定各條帶積分光密度值。采用2-ΔΔCt 方法對(duì)實(shí)時(shí)定量 PCR 結(jié)果進(jìn)行分析,顯示miRNA-137、AngⅡRNA 的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血壓和心肌膠原含量的變化

與對(duì)照組比較，SHR組大鼠的收縮壓和舒張壓明顯升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平明顯升高，miRNA-97a表達(dá)水平明顯降低(P<0. 01)(表2)。

表2 兩組大鼠的資料與心肌膠原含量的變化(mean ± SD. n=10)Tab.2 Information and myocardial collagen changes of two groups

2.2 兩組大鼠心肌組織 Masson 染色結(jié)果

SHR 組大鼠心肌細(xì)胞間可見大量藍(lán)色膠原纖維沉積，細(xì)胞數(shù)量減少，體積增大，細(xì)胞排列紊亂，對(duì)照組大鼠可見紅色心肌細(xì)胞間隙散在少量藍(lán)色膠原纖維，細(xì)胞排列整齊緊密，數(shù)量，體積大致正常(圖1)。

注：A:對(duì)照組;B :SHR組。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠心肌組織 TGF-β 1 蛋白表達(dá)

TGF-β 1主要在成纖維細(xì)胞表達(dá)，分布在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞間隙，SHR 組心肌可見 TGF-β 1 大量表達(dá)，對(duì)照組心肌有僅有少量TGF-β 1 表達(dá)(圖 2)。SHR組心肌TGF-β 1 蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(1. 29±0.22vs 0. 70±0. 11，P<0. 01)。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)大鼠心肌組織 miRNA-97a 表達(dá)

SSHR組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平為對(duì)照組的 (24. 6 ±4. 7)%，其 miRNA-97a 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0. 01)，

2.5 組間 TGF-β1，Smad3 蛋白和Col-Ⅰ/ Col-Ⅲ蛋白表達(dá)比較

SHR對(duì)照組大鼠心臟表達(dá)TGF-β1/Smad3蛋白和Col-Ⅰ/ Col-Ⅲ蛋白均較正常對(duì)照組明顯升高(P<0. 01)(圖4)。

注：A:對(duì)照組;B :SHR 組。

圖3 大鼠心肌組織 TGF-β1 蛋白表達(dá)改變Fig.3 TGF-β1 expression changes of myocardium

注： 1.正常對(duì)照組，2.SHR 對(duì)照組，3.SHR 干預(yù)組，SHR對(duì)照組組與正常對(duì)照組比較P<0. 05。

2.6 大鼠心肌組織 miRNA-97a 與 TGF-β 1 蛋白表達(dá)

水平相關(guān)性分析Pearson 直線相關(guān)分析顯示，SHR 組心肌組織miRNA-97a 表達(dá)水平與 TGF-β1蛋白表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0. 785，P<0. 01)。

3 討論

高血壓是冠心病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7],冠心病癥狀為胸腔中央發(fā)出疼痛，而且可蔓延到手臂、頷、頸、后背及胃部。冠心病發(fā)作的其他癥狀有氣促、眩暈、寒顫、出汗、惡心及昏厥。嚴(yán)重的一些患者會(huì)因?yàn)樾牧λソ叨鴮?dǎo)致死亡[8-9]。

據(jù)報(bào)道結(jié)果[11-13]表明，miRNA-9和miRNA-97a能影響心肌細(xì)胞的增殖與分化并且可以通過TLX和周期蛋白D1調(diào)控心肌細(xì)胞分化。這次實(shí)驗(yàn)是為了研究miRNA-97a在心肌重構(gòu)中的影響，讓miRNA-97a成為高血壓、冠心病等疾病的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織 miRNA-97a 表達(dá)：Real-time qPCR 結(jié)果顯示,SHR 組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P < 0. 01),SHR組心肌 miRNA-97a 表達(dá)水平為對(duì)照組的 (24. 6 ±4. 7)%。大鼠心肌組織 miRNA-97a 與 TGF-β 1 蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0. 785,P<0. 01)。

同時(shí)，在本研究中，兩組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果顯示：SHR 組大鼠心肌細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列紊亂，體積增大，可見大量藍(lán)色膠原纖維。SHR組大鼠收縮壓和舒張壓顯著升高，細(xì)胞肥大，體積增大，心肌細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，胞核變圓畸形。同時(shí)，SHR對(duì)照組表達(dá)TGF-β1蛋白表達(dá)均上調(diào)，表明TGF-β1在 Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表達(dá)中有了正性的調(diào)節(jié)作用。本研究?jī)山M大鼠血壓和心肌膠原含量的變化顯示，和正常組相比，SHR組的收縮壓和舒張壓明顯升高，TGF-β 1 蛋白，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達(dá)水平明顯升高，miRNA-97a表達(dá)水平明顯降低。

TGF-β 1是公認(rèn)的促纖維化細(xì)胞因子,能促進(jìn)心肌纖維化[14]，本研究顯示，特異低表達(dá)心臟 miRNA-97a 可促進(jìn)TGF-β 1 蛋白合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì) Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ大量增生和過度積聚，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，纖維化，出現(xiàn)心肌病理性重構(gòu)[17]。由于在心肌重構(gòu)過程中參與調(diào)控TGF-β 1、AngII表達(dá)的機(jī)制非常復(fù)雜, miRNA-97a具體通過下調(diào)哪一種信號(hào)通路來抑制細(xì)胞的增殖, 還需要我們進(jìn)一步研究。

[1] Pinto YM，Philipp T，Engler S，etal. Reduction in left ventricular messenger RNA for transforming growth factorβ1 attenuates left ventricular fibrosis and improves survival without lowering blood pressure in the hypertensive TGR (mRen2) 27 rat[J]. Hypertension，2000，36(5): 747-754.

[2] Ziada AM. Additional salutary effects of the combination of exercise training and an angiotensin-converting enzyme inhibitor on the left ventricular function of spontaneously hypertensive rats[J]. Hypertens，2009，27(6): 1 309-316.

[3] He JF，Luo YM，Wan XH，etal. Biogenesis of miRNA-137 and Its Role in Biogenesis，the Cell Cycle，and Apoptosis[J]. J Biochem Mol Toxicol，2011，25(6) : 404-408.

[4] Weber KT，Brilla CG. Signals for the remodeling of the cardiac interstitium in systemic hypertension[J]. Cardiovase Pharmacol，1991，17(Suppl 1): 14-19.

[5] Weber KT，Brilla CG. Myocardial fibrosis and the rennin-angiotensin-aldosterone system[J]. Cardiovase Pharmacol，1992，20(Sup-pl 1): 14-19.

[6] 刁雪紅，申鍔，等. 糖尿病小鼠心肌組織 microRNA 表達(dá)譜分析[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，10(2): 1194-198.

[7] Wang YS，Wang HY，Liao YC，etal. MicroRNA-137 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and prevents neointimal formation[J]. Cardiovascular Res，2012，95(4) : 517-526.

[8] Akiyama-Uchida Y，Ashizaua N，Chtwuyu A，etal. Norepinephrine enhances fibrosis mediated by TGF-beta in cardiac fibroblasts[J].Hypertension，2002，40(2): 148-154.

[9] Li JZ，Peng J，Wang CJ，etal. Calcitonin gene-related peptide suppresses isoprenaline-induced cardiomyocyte apoptosis through regulation of microRNA-1 and microRNA-133a expression[J]. J Cent South Univ(Med Sci)，2011，36(10): 964-971.

[10] 王澤慧，邊云飛，衛(wèi) 娜，等. 大鼠 microRNA-145 慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響[J]. 中國動(dòng)脈硬化雜志，2012，20(5): 424-428.

[11] Liu, Z.Q. Teng, A.L. McQuate,etal. An epigenetic feedback regulatory loop involving microRNA-195 and MBD1 governs neural stem cell differentiation,PLoS One， 2013，22(8): e51436.

[12] C. Zhao, G. Sun, S. Li,etal. A feedback regulatory loop involving microRNA-9 and nuclear receptor TLX in neural stem cell fate determination, Nat. Struct.Mol. Biol.2009，16(5)365-371.

[13] C. Zhao, G. Sun, S. Li,etal. MicroRNA let-7b regulates neural stem cell proliferation and differentiation by targeting nuclear receptor TLX signaling, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (2010) 1876-1881.

[14] Van Rooij E，Sutherland LB. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，10(3): 18 255-260.

[15] Shi Y，Massague J. Mechanisms of TGF-β signaling from cell membrane to the nucleus[J]. Cell，2003，113(6): 685-700.

[16] Van Rooij E，Sutherland LB. Qi X，etal. Control of stress dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA[J]. Science，2007，316(5 824): 575-579.

[17] Zhu H，Yang Y，Wang Y，etal. MicroRNA-137 promotes palmitate-induced apoptosis in cardiomyocytes by down-regulating Sirt1[J]. Cardiovascular Res，2011，92(1) : 75-84.

Expression of microRNA-97a and TGF-β1 protein in myocardium of spontaneously hypertensive rats and its significance

ZHENG Jing

(Affiliated hospital of Guizhou medical university, Guiyang 550001, China)

ObjectiveTo observe the changes of microRNA-97a and transforming growth factor β 1 (TGF-β1) protein in the myocardium of spontaneously hypertensive rats (SHR). Methods 8 male spontaneously hypertensive(SHR)rats as SHR group, 8 male Wistar rats for control group, Arterial blood pressure was detected by a noninvasive blood pressure measurement and analysis system. 8 weeks after femoral artery，HE staining was used to observe the changes of morphology of the rat heart, the expression of miRNA-97a was checked by Real-time PCR method for detection of rat heart. Western blot was used to detect the TGF-β 1, angiotensin II (Ang II) protein and type I collagen (Col I) and type III collagen (Col III) protein expression level.ResultsIn SHR group, systolic blood pressure and diastolic blood pressure increased significantly, TGF -β1 protein and Col I and Col III protein expression levels increased significantly, miRNA-97a expression levels were significantly lower than that of control group (P< 0. 01). Real-time PCR results showed that the level of miRNA-97a expression in SHR group was (24.6 + 4.7)% in control group, the expression level of miRNA-97a in SHR group was negatively correlated with the expression of TGF-β1 (r=0.785,P< 0.01) in group. Conclusion The level of miRNA-97a is down-regulated along with the up-regulation of TGF-β 1 protein expression and collagen synthesis in the myocardial tissues of SHR. miRNA-97a and TGF-β 1 may be involved in myocardial fibrosis in SHR.

MicroRNA-97a; Transforming growth factor β 1(TGF -β1); Spontaneously hypertensive rats; Myocardial fibrosis

貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目支助(黔科合LH字(2015)7423)。

鄭婧，博士，講師，E-mail：843165396@qq.com。

鄭婧。

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 11-0072-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.013

2016-07-20