凝集反應(yīng)對大鼠組織因子、D-二聚體及內(nèi)皮細(xì)胞的影響*

許 潔， 賈睿奕， 張 慶

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 承德 067000)

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凝集反應(yīng)對大鼠組織因子、D-二聚體及內(nèi)皮細(xì)胞的影響*

許 潔， 賈睿奕， 張 慶△

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北 承德 067000)

目的： 探討血凝素誘發(fā)的凝集反應(yīng)對血漿組織因子(TF)、D-二聚體及內(nèi)皮細(xì)胞的影響。方法:42只SPF級SD大鼠(雌雄不限，體重180～200 g)，隨機(jī)分為生理鹽水對照組、不同濃度(5、10和20 g/L)植物血凝素組及滅活的植物血凝素組，每組6只。通過尾靜脈向大鼠體內(nèi)注入生理鹽水、植物血凝素及滅活植物血凝素，用ELISA法檢測大鼠血漿TF和D-二聚體的水平，透射電鏡觀察大鼠肺部毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果:5、10和20 g/L植物血凝素組大鼠血漿TF和D-二聚體含量均顯著高于生理鹽水對照組及相應(yīng)濃度的滅活植物血凝素組(P<0.05)。電鏡下，與生理鹽水對照組相比，各濃度植物血凝素組出現(xiàn)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、溶解，胞質(zhì)疏松，邊界不清，線粒體腫脹，基膜增厚。各滅活植物血凝素組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。結(jié)論:體內(nèi)發(fā)生的凝集反應(yīng)可破壞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致凝血纖溶系統(tǒng)紊亂。

凝集反應(yīng)； 組織因子； D-二聚體； 內(nèi)皮細(xì)胞

流感病毒嚴(yán)重威脅著人類，每年有5%～15%的人感染流感病毒[1]，據(jù)估計(jì)在發(fā)達(dá)國家，流感每年可致25～50萬人口死亡，而發(fā)展中國家遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過這個(gè)數(shù)字[2]。感染癥狀多樣，由輕度呼吸道癥狀，到重癥肺炎、多器官功能障礙甚至導(dǎo)致致死性呼吸衰竭[3]。流感病毒的致病機(jī)制尚不完全明確，近期動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究報(bào)道[4-5]，流感病毒感染后在全身多個(gè)器官臟器可檢測到病毒RNA，表明流感病毒感染存在病毒血癥，且病毒血癥與臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度及高死亡率密切相關(guān)。重癥致死性流感以微循環(huán)障礙為特點(diǎn)[6]。血凝素(hemagglutinin，HA)是位于病毒顆粒表面的糖蛋白，是流感病毒致病力的關(guān)鍵決定因素，具有使紅細(xì)胞發(fā)生凝集的特性[7]。本研究通過應(yīng)用植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)引發(fā)體內(nèi)的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)[8]，探索凝集反應(yīng)對大鼠血漿組織因子(tissue factor，TF)、D-二聚體及內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物和試劑

SPF級健康SD大鼠42只，雌雄不限，體重180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司 [SCXK(京)2012-0001]。本實(shí)驗(yàn)中動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

大鼠 TF ELISA 試劑盒和大鼠 D-dimer ELISA 試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；植物血凝素(每支10 mg)購自上海金穗生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動物分組 SPF級SD大鼠(雌雄不限，體重180～200 g)42只，隨機(jī)分為生理鹽水(normal saline)對照組， 5、10和20 g/L PHA組及相應(yīng)濃度的滅活PHA組，每組6只。

2.2 動物給藥 按15 mL/kg體重沿尾靜脈向大鼠體內(nèi)注射生理鹽水及不同濃度的植物血凝素(生理鹽水稀釋)及滅活植物血凝素(生理鹽水稀釋成不同濃度的PHA溶液，沸水浴1 h)，注射完畢后，做好標(biāo)記，將大鼠放于飼養(yǎng)籠中，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

2.3 指標(biāo)檢測 ELISA法檢測大鼠血漿中TF、D-二聚體的水平。大鼠給藥4 h后，10%水合氯醛腹腔麻醉(3 mL/kg)，下腔靜脈取血，2 800×g離心10 min，取上清分裝于EP管中，-80 ℃冰箱凍存。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法測定大鼠血漿中TF、D-二聚體的含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 電鏡標(biāo)本留取及制備 上述實(shí)驗(yàn)大鼠，右中肺組織外周部位切成體積約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，每例留取10塊，用2%戊二醛前固定、1%鋨酸后固定，常規(guī)脫水、浸透和包埋、聚合、切片、電子染色，透射電鏡下觀察肺部毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，樣本均數(shù)正態(tài)性檢驗(yàn)用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TF和D-二聚體的含量

5、10和20 g/L PHA組大鼠血漿TF和D-二聚體含量均顯著高于生理鹽水對照組和相應(yīng)濃度的滅活PHA組(P<0.05),見表1。

表1 不同劑量的PHA對大鼠血漿TF和D-二聚體含量的影響

Table 1. The effects of PHA at different concentrations on the levels of serum TF and D-dimer (Mean±SD.n=6)

*P<0.05 vs normal saline.

2 電鏡觀察

與生理鹽水對照組相比，各濃度植物血凝素組大鼠肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，邊界不清，胞質(zhì)疏松、溶解，基膜增厚、中斷，線粒體腫脹、溶解，含氣小泡減少，并隨濃度的升高內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度加重。滅活植物血凝素組內(nèi)皮細(xì)胞扁平，邊界清楚，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，含氣小泡豐富，見圖1。

Figure 1. Observation of pulmonary capillary endothelial cells under TEM (H-7650, 80 kV, ×30 000). A: normal saline group; B: 5 g/L PHA group; C: 10 g/L PHA group; D: 20 g/L PHA group; E: 5 g/L inactivated PHA group; F: 10 g/L inactivated PHA group; G: 20 g/L inactivated PHA group.

圖1 大鼠肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡圖片

討 論

流感病毒為正黏液病毒科，依據(jù)核蛋白可分為A、B、C三型，根據(jù)其表面糖蛋白——HA(H1～H18)和神經(jīng)氨酸酶(NA，N1～N9)又分為不同的亞型，依據(jù)致病性可分為高致病性(highly pathogenic avian influenza，HPAI)、低致病性(low pathogenic avian influenza，LPAI)和無致病性3種。HPAI感染發(fā)病率和死亡率極高，該病毒種類多，變異性強(qiáng)，新的病毒株不斷的進(jìn)化、侵襲，嚴(yán)重威脅著人類的健康[9]。

流感病毒表面的糖蛋白HA與病毒致病力密切相關(guān)，可以使體內(nèi)紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)與凝血不同，凝集反應(yīng)是顆粒性抗原，可以是細(xì)菌、紅細(xì)胞等天然顆粒性抗原，也可以是吸附有可溶性抗原的非免疫相關(guān)顆粒，與相應(yīng)抗體在電解質(zhì)參與下相互作用形成肉眼可見的凝塊，稱凝集反應(yīng)。而凝血?jiǎng)t是一系列酶解反應(yīng)的過程，在這一過程中，各種凝血因子相繼激活，直至最終形成凝血酶，裂解纖維蛋白原使之形成纖維蛋白，纖維蛋白再級聯(lián)形成凝塊。研究發(fā)現(xiàn)，重癥流感病毒感染往往存在凝血功能異常、微血栓形成從而導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血[10]。我們推測，凝集反應(yīng)可能導(dǎo)致機(jī)體凝血系統(tǒng)發(fā)生異常。研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒依附其凝集活性而向全身播散[11]，因此，對凝集反應(yīng)的研究更為重要。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用透射電鏡直觀地觀察到體內(nèi)發(fā)生凝集反應(yīng)的大鼠肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，邊界不清，胞質(zhì)疏松、溶解，基膜增厚甚至斷裂，且隨體內(nèi)凝集反應(yīng)的增強(qiáng)損傷程度加重。血漿中TF和D-二聚體水平顯著升高。Visseren等[12]研究發(fā)現(xiàn)流感病毒感染大鼠模型中，大鼠凝血時(shí)間顯著減少，且血漿中TF因子水平呈3～4倍升高，表明流感病毒通過內(nèi)皮細(xì)胞釋放組織因子而呈現(xiàn)促凝血狀態(tài)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，在A型流感病毒H3N2感染的患者存在D-二聚體的顯著升高，并且經(jīng)抗凝治療有效。應(yīng)用流感病毒感染雪貂過程中存在D-二聚體水平升高，進(jìn)一步證實(shí)體內(nèi)存在血液高凝狀態(tài)[14]。

TF是一種分子量為42 kD的跨膜糖蛋白，是體內(nèi)凝血的主要啟動者[15]。TF與血液中的凝血因子Ⅶ/Ⅶa結(jié)合形成TF-Ⅶa復(fù)合物，進(jìn)一步激活凝血因子Ⅹ和Ⅸ，導(dǎo)致凝血酶的形成并最終形成交聯(lián)的纖維蛋白[16]。D-二聚體是體內(nèi)纖維蛋白降解的特異性產(chǎn)物，是體內(nèi)高凝狀態(tài)及纖溶亢進(jìn)的特異性標(biāo)志物之一。血凝素與紅細(xì)胞受體結(jié)合，紅細(xì)胞凝集成團(tuán)，可能在通過毛細(xì)血管時(shí)其變形能力下降，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量TF入血，從而啟動外源性凝血途徑[17]。進(jìn)而激發(fā)纖溶亢進(jìn)，纖維蛋白降解，產(chǎn)物D-二聚體水平升高。因此，由血凝素誘發(fā)的凝集反應(yīng)可能是流感病毒感染微血栓形成、體內(nèi)血液高凝狀態(tài)及纖溶系統(tǒng)紊亂的機(jī)制之一。

綜上所述，由血凝素引發(fā)的紅細(xì)胞凝集反應(yīng)，能夠破壞內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)體內(nèi)凝血及纖溶系統(tǒng)的異常，對進(jìn)一步探究流感病毒的致病機(jī)制具有重要意義。

[1] Herfst S, Schrauwen EJ, Linster M, et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets[J]. Science, 2012, 336(6088):1534-1541.

[2] St?hr K. Preventing and treating influenza[J]. BMJ, 2003, 326(7401):1223-1224.

[3] Whitley RJ, Monto AS. Seasonal and pandemic influenza preparedness: a global threat[J]. J Infect Dis, 2006, 194(Suppl 2):S65-S69.

[4] Wang X, Zhao J, Tang S, et al. Viremia associated with fatal outcomes in ferrets infected with avian H5N1 influenza virus[J]. PLoS One, 2010， 5(8):e12099.

[5] Tse H, To KK, Wen X, et al. Clinical and virological factors associated with viremia in pandemic influenza A/H1N1/2009 virus infection[J]. PLoS One, 2011, 6(9):e22534.

[6] Salgado DR, Ortiz JA, Favory R, et al. Microcirculatory abnormalities in patients with severe influenza A (H1N1) infection[J]. Can J Anaesth, 2010, 57(10):940-946.

[7] Bottcher-Friebertshauser E, Garten W, Matrosovich M, et al. The hemagglutinin: a determinant of pathogenicity[J]. Curr Top Microbiol Immunol, 2014, 385:3-34.

[8] Jia RY, Zhang Q, Ding XX, et al. Agglutination reaction induced by phytohemagglutinin and its effects on coagulation system[J]. J Chengde Med Coll, 2016, 33(1):12-14.

[9] Ei Zowalaty ME, Bustin SA, Husseiny MI, et al. Avian influenza: virology, diagnosis and surveillance[J]. Future Microbiol, 2013, 8(9):1209-1227.

[10]Zhou C, Fang P, Liu YN, et al. A retrospective study of one case of human infection by the highly pathogenic avian influenza A (H5N1)[J]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi, 2006, 29(1):9-13.

[11]Mori I, Komatsu T, Takeuchi K, et al. Viremia induced by influenza virus[J]. Microb Pathog, 1995, 19(4):237-244.

[12]Visseren FL, Bouwman JJ, Bouter KP, et al. Procoagulant activity of endothelial cells after infection with respiratory viruses[J]. Thromb Haemost, 2000, 84(2):319-324.

[13]Ohrui T, Takahashi H, Ebihara S, et al. Influenza A virus infection and pulmonary microthromboembolism[J]. Tohoku J Exp Med, 2000, 192(1):81-86.

[14]Goeijenbier M, van Gorp EC, Van den Brand JM, et al. Activation of coagulation and tissue fibrin deposition in experimental influenza in ferrets[J]. BMC Microbiol, 2014, 14:134.

[15]Mackman N, Tilley RE, Key NS. Role of the extrinsic pathway of blood coagulation in hemostasis and thrombosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007, 27(8):1687-1693.

[16]Manly DA, Boles J, Mackan N. Role of tissue factor in venous thrombosis[J]. Annu Rev Physiol, 2011, 73:515-525.

[17]Witkowski M, Landmesser U, Rauch U. Tissue factor as a link between inflammation and coagulation[J]. Trends Cardiovasc Med, 2016, 26(4):297-303.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of agglutination on tissue factor, D-dimer and endothelial cells in rats

XU Jie, JIA Rui-yi, ZHANG Qing

(DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospital,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:zhangqing0668@sina.com)

AIM: to explore the effects of agglutination on tissue factor (TF), D-dimer and endothelial cellsinvivo. METHODS: Forty-two SPF SD rats (male and female, 180～200 g) were randomly divided into normal saline control group， and different concentrations (5, 10 and 20 g/L) of phytohemagglutinin (PHA) groups and inactivated PHA groups, with 6 rats in each group. The rats were injected with normal saline, PHA and inactivated PHA through the tail vein respectively. The plasma contents of TF and D-dimer were detected by ELISA. The pulmonary capillary endothelial cells of the rats were observed under electron microscope. RESULTS: The plasma levels of TF and D-dimer were significantly higher in all PHA groups than those in normal saline group and 3 corresponding inactivated PHA groups. Compared with normal saline group, the pulmonary capillary endothelial cells of the rats in each PHA group were damaged, characterized by endothelial cell swelling and dissolution, cytoplasm osteoporosis, unclear boundary, mitochondrial swelling and thick basement membrane. In all inactivated PHA-groups, the structures of the endothelial cells were normal. CONCLUSION: PHA-induced agglutination damages capillary endothelial cells and causes the disorders of the coagulation-fibrinolysis system.

Agglutination; Tissue factor; D-dimer; Endothelial cells

1000- 4718(2016)11- 2088- 04

2016- 07- 04

2016- 09- 01

河北省重大實(shí)驗(yàn)課題(No. ZD2013047)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.029

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 15633142668； E-mail: zhangqing0668@sina.com