胡 艷 李 環(huán) 古漪玲 魏蔚霞 吳瑞芳

(北京大學深圳醫(yī)院婦產科 深圳市婦科腫瘤醫(yī)學工程技術研究開發(fā)中心，深圳 518036)

·實驗研究·

P物質在子宮內膜異位癥所致慢性盆腔疼痛患者子宮骶韌帶中的表達*

胡 艷 李 環(huán) 古漪玲 魏蔚霞 吳瑞芳**

(北京大學深圳醫(yī)院婦產科 深圳市婦科腫瘤醫(yī)學工程技術研究開發(fā)中心，深圳 518036)

目的 探討P物質在子宮內膜異位癥所致慢性盆腔痛患者子宮骶韌帶中的表達。 方法 選擇2013年6月～2014年12月26例因子宮內膜異位癥所致慢性盆腔疼痛擬行手術治療的患者為研究組，同期因婦科疾病需行子宮切除術且無子宮內膜異位癥和慢性盆腔痛的33例患者為對照組。術中取骶韌帶組織，應用實時熒光定量PCR法及免疫組化SP法檢測P物質mRNA和蛋白在2組骶韌帶中的相對表達水平。 結果 研究組骶韌帶中P物質mRNA的相對表達量(中位數(shù)0.2129，四分位數(shù)間距0.6954)和蛋白的陽性面積百分比(25.6531%±7.0761%)明顯高于對照組(中位數(shù)0.0364，四分位數(shù)間距0.1674，20.2915%±4.3665%)(Z=-2.141，P=0.032；t=3.614，P=0.001)。 結論 子宮內膜異位癥所致慢性盆腔痛患者子宮骶韌帶中P物質mRNA的相對表達量和蛋白的陽性面積百分比均較無慢性盆腔痛患者高，提示子宮骶韌帶中P物質表達增加可能是子宮內膜異位癥導致慢性盆腔痛的原因。

P物質; 慢性盆腔痛; 子宮內膜異位癥

慢性盆腔疼痛(chronic pelvic pain，CPP)是由各種功能性或器質性原因引起的非周期性以骨盆及其周圍組織疼痛為主要癥狀，時間超過6個月的需要藥物或手術治療的一組疾病或綜合征。其病因復雜，涉及生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、肌肉骨骼系統(tǒng)和心理疾患等方面，其中子宮內膜異位癥是引起CPP最為常見的婦科疾病。目前對于子宮內膜異位癥導致的慢性盆腔疼痛的治療主要為以抑制雌激素產生和降低雌激素水平為目的的藥物治療，以及腹腔鏡異位種植病灶切除的手術治療。無論是藥物、手術或手術聯(lián)合藥物治療，疼痛都能有不同程度的緩解，但是部分患者容易復發(fā)[1,2]，治療效果不甚滿意。因此，重視子宮內膜異位癥所致CPP的發(fā)病機理研究，從病因學研究找到疾病的根本性治療方法非常重要。疼痛是傷害性刺激作用于機體引起的一種復雜的心理生理學過程，是一種不愉快的主觀感受；神經纖維末梢、神經遞質和傷害性刺激是疼痛產生的必備條件。P物質是疼痛產生過程中的致痛神經遞質，本研究采用免疫組化SP法和熒光定量PCR法研究P物質在子宮內膜異位癥所致CPP患者子宮骶韌帶中的表達，探討P物質與子宮內膜異位癥致慢性盆腔痛的關系，為治療子宮內膜異位癥致慢性盆腔痛提供理論依據。

1 臨床資料與方法

1.1 一般資料

本研究病例選擇和組織提取均征得患者知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會的批準。研究組選取2013年6月～2014年12月因子宮內膜異位癥致慢性盆腔疼痛擬行開腹或腹腔鏡手術治療的26例，年齡41～50歲，有慢性盆腔痛病史，近3個月內未使用孕激素類和促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)等藥物，無盆腔手術史，且術中骶韌帶可見內膜異位癥病灶或骶韌帶組織病理檢查見內膜異位癥病灶。對照組選擇同期因為宮頸上皮內瘤變Ⅲ級、早期宮頸癌、子宮肌瘤等擬行開腹或腹腔鏡子宮切除術的33例，年齡41～51歲，無慢性盆腔痛等相關疾病，近3個月未使用孕激素和GnRH-a等藥物，無盆腔手術史，術中骶韌帶未發(fā)現(xiàn)子宮內膜異位癥病灶且骶韌帶的組織病理檢查未見子宮內膜異位癥病灶。研究組年齡(46.1±2.6)歲，對照組(46.2±2.8)歲，差異無顯著性(t=-0.094，P=0.925)，具有可比性。

1.2 標本的收集與處理

研究組行子宮切除或骶韌帶切斷(或部分切除)手術，術中切取含子宮內膜異位癥的骶韌帶組織約1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm；對照組行子宮切除術時切取骶韌帶斷端約1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm。所取標本1/2置入10%福爾馬林溶液中固定后石蠟包埋，待標本收齊后統(tǒng)一4 μm連續(xù)切片用于HE染色和免疫組化；剩余1/2標本置入有RNA Later液的EP管內并立即置入-80 ℃冰箱保存，用于實時熒光定量PCR。

1.3 免疫組化SP法

采用免疫組化SP法檢測骶韌帶中P物質的陽性面積百分比。P物質單克隆抗體(英國Abcam公司)濃度1∶100；免疫組化SP試劑購自福建邁新生物技術開發(fā)有限公司，采用德國萊卡公司光學顯微鏡拍照,Image-Pro Plus計算機圖像分析系統(tǒng)計算P物質的陽性面積百分比，以PBS代替一抗作陰性對照。結果判讀：采用平均陽性染色面積百分比法對骶韌帶中P物質蛋白的表達進行半定量分析。在光鏡下觀察所有染色切片，P物質陽性表達為棕黃色顆粒，陽性顆粒表達位于細胞漿內及細胞膜上。每張切片隨意選取5個完整而不互相重復的×200視野，拍照后用計算機圖像分析系統(tǒng)計算5個視野P物質陽性面積平均百分比，得出P物質蛋白的陽性面積百分比。

1.4 實時熒光定量PCR

按Trizol試劑盒說明提取總RNA；采用逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA，總反應體系為10 μl，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。實時熒光定量PCR法使用Lightcycler480型熒光定量PCR儀，總反應體系20 μl，cDNA模板1 μl，SYBR Premix預混緩沖液10 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，加滅菌水至20 μl。各引物序列見表1。按照各目的基因退火溫度選擇三步法完成擴增，循環(huán)數(shù)40。每次實驗每個模板設置3個復孔保證重復率，重復2次。根據高分辨率熔解曲線判斷實時熒光定量PCR法擴增產物的特異性，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參。骶韌帶中P物質mRNA的相對表達量采用2-ΔCt法計算；其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)。

表1 PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結果

研究組骶韌帶內可見子宮內膜異位癥(圖1)，2組骶韌帶中均有P物質表達(圖2)；內參GAPDH及P物質的擴增曲線有指數(shù)擴增期，有平臺期，并且曲線起峰均<40Ct，整條曲線光滑(圖3)；熔解曲線峰值單一，無雜峰、雙峰或引物二聚體峰信號，內參GAPDH與P物質的熔解溫度分別為86 ℃和83 ℃(圖4)，表明逆轉錄產物及引物的特異度均較好，反應條件選擇適當。研究組骶韌帶中P物質蛋白的陽性面積百分比和P物質mRNA的相對表達量均明顯高于對照組(P<0.05)，見表2。

圖1 子宮骶韌帶中子宮內膜異位癥病灶(HE染色，×100) 圖2 P物質陽性表達(SP染色，×200) 圖3 內參GAPDH和P物質擴增曲線 圖4 內參GAPDH和P物質高分辨率熔解曲線

表2 子宮骶韌帶中P物質mRNA相對表達量和蛋白陽性面積百分比

組別mRNA相對表達量(M,Q3-Q1)蛋白陽性面積百分比(%)(x±s)研究組(n=26)0.2129,0.695425.6531±7.0761對照組(n=33)0.0364,0.167420.2915±4.3665Z(t)值Z=-2.141t=3.614P值0.0320.001

3 討論

不同人群中CPP患病率從2.1%～26.6%不等[3]，嚴重影響患者生活質量，且診療困難，CPP已經成為世界性的健康問題[4]。很多婦科疾病，如子宮內膜異位癥、慢性盆腔炎、盆腔粘連、子宮肌瘤、盆腔充血綜合征以及婦科手術等[5,6]都可能導致CPP，其中子宮內膜異位癥是引起CPP最為常見的婦科疾病[7]，半數(shù)以上出現(xiàn)CPP癥狀的女性患者患有子宮內膜異位癥，大部分的子宮內膜異位癥患者有CPP[8,9]，兩者關系密切。研究表明，子宮內膜異位癥致CPP的發(fā)生與病變嚴重程度和病變部位有密切關系[10，11]，骶韌帶內含有豐富的神經末梢，當子宮內膜異位病灶浸潤子宮骶韌帶時，骶韌帶的攣縮、粘連和增粗，引起各種疼痛，CPP最常見[12,13]，在各種炎性細胞刺激因子作用下，神經末梢敏感性增強，反復作用使疼痛進行性加重[14]。

疼痛是由實質上或潛在的組織損傷引起的不愉快的感覺，神經纖維末梢、神經遞質和傷害性刺激是產生疼痛的必備條件。P物質是由11個氨基酸組成的多肽，廣泛分布于中樞和周圍神經系統(tǒng)及組織器官。其分布部位及作用方式不同，起著神經遞質、神經調質或激素樣作用。

雖然子宮內膜異位癥導致疼痛的發(fā)生機制至今尚不清楚，但目前認為子宮內膜異位癥疼痛是一種傷害性、炎癥性以及神經源性綜合的復雜性疼痛。因此，我們觀察P物質在子宮內膜異位癥所致CPP患者骶韌帶中的表達，探討骶韌帶中P物質的表達與子宮內膜異位癥致CPP的關系。Tokushige等[15]提出子宮內膜異位癥的在位內膜、子宮肌層神經纖維密度增加與盆腔疼痛癥狀有關，同時，子宮內膜異位癥患者子宮內膜功能層分布高密度感覺神經C纖維，對子宮內膜異位癥疼痛及痛覺過敏起重要作用。因此，越來越多的學者從神經肽類相關因子如P物質角度研究子宮內膜異位癥疼痛的機理，夏平等[16]的研究結果顯示，子宮內膜亦見少量P物質神經纖維分布，P物質在子宮內膜異位癥模型大鼠中的含量高于非模型組，從而證明子宮內膜異位癥疼痛與P物質含量增加有關，推測高水平的P物質可能促使子宮內膜異位癥疼痛的發(fā)生。本研究的結果表明，子宮內膜異位癥致CPP患者骶韌帶中P物質mRNA和蛋白的相對表達量均明顯高于無CPP患者，提示骶韌帶中P物質表達增加可能是子宮內膜異位癥導致CPP的原因。骶韌帶中P物質表達的增加導致CPP主要與P物質傳遞痛和P物質致痛有關。在周圍神經系統(tǒng)中，P物質主要由一級傳入神經元胞體合成，儲存于突觸小泡內，當神經沖動傳遞時引發(fā)離子通道開放，外鈣內流，促使囊泡與突觸前膜融合并釋放，P物質再通過軸流轉運到初級傳入神經末梢，發(fā)揮傳導痛覺的作用[17]。此外，在多種慢性疼痛中，P物質作為疼痛遞質通過感覺神經傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞，參與疼痛在脊髓中樞的傳導和調制[18]。在組織破壞過程中或炎癥反應中釋放的化學物質(如鉀離子、緩激肽、組織胺以及5-羥色胺)會使傷害感受器發(fā)生敏化。在此基礎上，傷害感受器自身也會釋放出痛敏物質激活鄰近的傷害感受器，向周圍組織擴布疼痛和炎癥反應，P物質是其中的重要成分。因此，P物質不僅傳遞傷害性信息，而且參與感受器的作用。Henry等[19]認為，大劑量P物質可直接引起感覺神經元興奮，導致痛覺過敏，并掩蓋阿片樣物質的止痛作用。因此，子宮內膜異位癥骶韌帶局部P物質表達的升高不僅能增強傷害性信息的傳遞，而且可直接引起感覺神經元興奮導致痛覺過敏，而敏化的神經可釋放大量神經遞質反過來激活肥大細胞等促使其脫顆粒釋放致痛物質，促使神經敏化，從而導致神經病理性疼痛的持續(xù)狀態(tài)，即子宮內膜異位癥患者的慢性神經病理性疼痛。

綜上所述，子宮內膜異位癥導致CPP的因素雖然很多，許多情況下并非由單一因素所致，而是由多種因素共同作用的結果。本研究結果提示，子宮內膜異位癥致CPP患者骶韌帶中局部P物質表達的增加，推測P物質可能在子宮內膜異位癥導致CPP的發(fā)生中起著重要作用，這對闡明子宮內膜異位癥所致CPP的機制，探討子宮內膜異位癥導致CPP可能的鎮(zhèn)痛途徑提供理論依據，對尋找到新的治療方案有重要意義。但是，局部P物質的表達與CPP發(fā)生發(fā)展是否存在必然的關聯(lián)及其在CPP的發(fā)生發(fā)展中的作用尚待更多的研究來證實，值得我們今后繼續(xù)探索。

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(修回日期：2016-01-23)

(責任編輯：王惠群)

Expression of Substance P in Patients with Chronic Pelvic Pain Caused by Endometriosis

HuYan,LiHuan,GuYiling,etal.

DepartmentofObstetricsandGynecology,PekingUniversityShenzhenHospital,ShenzhenTechnicalResearchandDevelopmentCenteronGynecologicOncology,Shenzhen518036,China

WuRuifang,E-mail:wurf100@126.com

Objective To investigate the relationship between substance P expression in uterosacral ligament and chronic pelvic pain caused by endometriosis. Methods A group of 26 patients with chronic pelvic pain caused by endometriosis were treated with surgery as the research group, and another 33 patients without chronic pelvic pain and endometriosis were given hysterectomy as the control group. Streptavidin perosidase immunohistochemistry technique was used to evaluate the expression of substance P in uterosacral ligament. Real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the mRNA expression of substance P in uterosacral ligament. Results The median mRNA relative expressions of substance P were 0.2129 (Q3-Q1=0.6954) in the research group and 0.0364(Q3-Q1=0.1674) in the control group. The percentages of positive staining area of the protein of substance P were 25.6531%±7.0761% in the research group and 20.2915%±4.3665% in the control group. The mRNA relative expressions and the percentage of positive staining area of substance P were significantly higher in the research group than those in the control group (Z=-2.141，P=0.032；t=3.614，P=0.001). Conclusion The increased expressions of substance P in uterosacral ligament of endometriosis patients may be the cause of chronic pelvic pain.

Substance P; Chronic pelvic pain; Endometriosis

2013年廣東省醫(yī)學科研基金(項目編號：A2013609)

A

1009-6604(2016)04-0355-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2016.04.018

2015-10-21)

**通訊作者，E-mail：wurf100@126.com