郭俊宇 陳應(yīng)超

異甘草素對人鼻咽癌CNE2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型的放療增敏作用

郭俊宇 陳應(yīng)超

目的 觀察異甘草素對鼻咽癌裸鼠移植瘤放療的增敏效應(yīng)，并探討其與乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平之間的關(guān)系。方法取低分化鼻咽癌CNE2細(xì)胞接種于雌性裸鼠皮下(共接種20只)，待腫瘤結(jié)節(jié)4～6 mm時，將裸鼠隨機(jī)分為4組，分別為對照組、異甘草素組(50 mg·kg-1·周-1)、放療組、異甘草素(50 mg·kg-1·周-1)聯(lián)合放療組。依照各組不同治療措施處理，定期測量瘤體體積，20 d后處死裸鼠，剝離瘤體稱重。分別計算4組抑瘤率。采用熒光定量PCR檢測瘤體組織中HIF-1α及VEGF mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果異甘草素聯(lián)合放療組移植瘤的體積和重量顯著下降，與對照組、單純異甘草素及單純放療組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；異甘草素聯(lián)合放療組HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯下降, 與對照組及放療組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。結(jié)論異甘草素能增強(qiáng)鼻咽癌裸鼠移植瘤對放療的敏感性，其作用機(jī)制可能與抑制HIF-1α、VEGF表達(dá)水平，從而抑制腫瘤血管生成作用有關(guān)。

異甘草素；鼻咽腫瘤；放療增敏；HIF-1α；VEGF

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，其發(fā)病率在頭頸部腫瘤中一直居高不下。對于鼻咽癌患者的治療，強(qiáng)調(diào)以適形放療為主，放化療聯(lián)合的綜合治療。早期鼻咽癌患者(Ⅰ、Ⅱ期)的預(yù)后尚可，5年總生存率接近80%，但由于復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的存在，晚期(Ⅲ、Ⅳ期)鼻咽癌治療仍然不容樂觀，該類患者往往對放療不敏感，5年生存率僅達(dá)30%～40%[1,2]。影響鼻咽癌治療的主要因素為腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而腫瘤新生血管生成在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，因此，尋找針對腫瘤血管生成的新的靶向藥物，提高鼻咽癌的放療敏感性，對改善鼻咽癌的治療現(xiàn)狀具有重要意義。近年來，我國學(xué)者從中草藥中分離出多種具有抗腫瘤活性的天然化合物，這些化合物多具有多靶點、多效應(yīng)以及低毒性的特點，在抗腫瘤研究中做出了很大的貢獻(xiàn)。甘草素及其衍生物，從甘草屬植物的根莖中提取，多屬于黃酮類化合物，國內(nèi)外多項研究均報道其在體內(nèi)及體外均具有顯著的抗腫瘤活性和抗炎活性[3]。異甘草素從甘草根的水解產(chǎn)物中分解得到，結(jié)構(gòu)為經(jīng)基查耳酮類化合物，在肝癌、胃癌及食管癌等多種腫瘤中均可發(fā)揮抗癌作用，研究發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)自噬以及抗血管生成等多方面的作用[4-6]。而目前國內(nèi)外尚無關(guān)于異甘草素在頭頸部腫瘤中的研究，同時也少有研究報道異甘草素對腫瘤放療敏感性的影響。因此，我們的研究研究旨在探討異甘草素是否對人鼻咽癌CNE2細(xì)胞裸鼠移植瘤模型存在放療增敏作用并探討其機(jī)制，以期為異甘草素在腫瘤治療中的研究和應(yīng)用提供實驗室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及動物培養(yǎng) 人低分化鼻咽癌CNE2細(xì)胞株來源于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。CNE2細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640+10%胎牛血清+1%青鏈霉素的培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期且90%融合時，用胰酶消化用于裸鼠移植瘤的建立。BALB/c裸鼠(雌性，6周齡，體重16～20 g，型號：429991216)，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于恒溫(20～25℃)、恒濕的SPF層流環(huán)境中，采用經(jīng)高壓滅菌的標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌飲用水。

1.2 主要試劑 RPIM 1640培養(yǎng)基，0.25%EDTA胰酶購自杭州吉諾試劑公司，胎牛血清購自美國GIBCO公司，青鏈霉素購自杭州碧云天有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-time PCR kit購自TAKARA公司；引物由上海生工公司合成，各引物序列如下：HIF-1α引物序列：上游5’-GTGGTGGTTA CTCAGCACTTT-3’和下游5’-ATCTCCGTCCCTCAACCTCT-3’；VEGF引物序列：上游5’-GAATGGGGAGCCCAGAGTG-3’和下游5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGA-3’；GADPH引物序列：上游5’-AAAGCCTGCCGGTGACTAA-3’和下游5’-AGGAAAAGCATCAC CCGGAG-3’。異甘草素購自上海同田公司，純度為99%，用PBS溶解，保存濃度為0.1 g/ml，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 裸鼠移植瘤模型建立 CNE2細(xì)胞培養(yǎng)于 75 cm2培養(yǎng)瓶中(細(xì)胞量約為2×107/瓶)，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，加入3 ml 0.25%EDTA胰酶消化，消化3 min后，加入5～10 ml培養(yǎng)基中和，并吹打制備單細(xì)胞懸液，使用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，離心并加入PBS重懸，使細(xì)胞終濃度為1.0×107個/ml。注射器吸取上述細(xì)胞懸液200 μl(細(xì)胞量為2×106個)，接種于裸鼠背部皮下，共接種裸鼠20只。整個操作過程均在SPF環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。接種后定期觀察裸鼠注射點附近皮膚有無腫瘤形成，成瘤標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤直徑為5 mm×5 mm(長徑×短徑)。

1.4 分組及處理 皮下注射1周后，裸鼠成瘤率為100%(標(biāo)準(zhǔn)為瘤體長短徑大于5 mm×5 mm)。按照隨機(jī)分組表進(jìn)行分組，分為4組，每組5只裸鼠，處理措施：(1)對照組：不作其他處理，給予與藥物組等體積的0.9%氯化鈉溶液腹腔注射；(2)異甘草素組：給予異甘草素腹腔注射，注射量按裸鼠體重計算，每周給藥50 mg/kg；(3)放療組：給予電子直線加速器照射，5 d/次，每只每次局部照射量為5 Gy；(4)放療+異甘草素組：同時給予(2)組和(3)組處理。給藥第1天開始測量腫瘤的長徑和短徑，每3天測量1次。腫瘤體積計算公式為V=1/2(a×b)2，根據(jù)體積計算各組的抑瘤率：抑瘤率(%)=(1-實驗組瘤體重的均數(shù)/對照組瘤體重的均數(shù))×100%。給藥20 d后處死裸鼠，剝離瘤體，稱重記錄瘤體重量。留取部分移植瘤組織用，保存于液氮中，用于后續(xù)檢測。

1.5 熒光定量PCR檢測不同組別瘤體中HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá) 提取裸鼠移植瘤標(biāo)本組織中的總RNA，紫外分光光度計測RNA純度及濃度。RT-PCR采用TAKARA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒20 μl體系，其中RNA模板為1 μg，Oligo dT引物和隨機(jī)引物各1 μl， PCR buffer為 4 μl(包含鎂離子、dNTPs、甘油等)，逆轉(zhuǎn)錄酶為1 μl，其余用DEPC水補(bǔ)足，RT-PCR反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃∞；Real time PCR：本實驗采用20 μl反應(yīng)體系，其中模板為100 ng，HIF-1α、VEGF上下游引物各使用1 μl，TAKARA SYBR GREEN為10 μl，其余用DEPC水補(bǔ)足；Real time PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min， 95℃ 30 s+57℃30 s+72℃ 30 s共計40個循環(huán)，72℃ 3 min，4℃∞，并在退火時采集熒光值。

2 結(jié)果

2.1 4組移植瘤的體積比較 治理前4組移植瘤體積差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；處理20 d后，異甘草素組、放療組和放療+異甘草素組與對照組相比，瘤體體積差異變化差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中放療+異甘草素組處理組瘤體體積最小，與單獨放療組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，根據(jù)各組瘤體體積繪制移植瘤生長曲線，可見放療+異甘草素組移植瘤增長速率最低，說明異甘草素治療聯(lián)合放療，可有效增加裸鼠鼻咽癌移植瘤模型對放療的敏感性。見表1，圖1。

表1 4組移植瘤的體積比較

組別對照組異甘草素組放療組放療+異甘草素組治療前68.5±4.771.8±6.265.3±3.871.4±7.7治療后662.3±66.1*532.7±50.2*325.3±51.3*219.7±52.3*體積變化593.8±23.8460.9±17.6#260.0±20.7#148.3±18.9#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

圖1 4組移植瘤生長曲線

2.2 4組瘤體的重量比較 剝離瘤體后，稱重4組移植瘤重量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，異甘草素組，放療組和放療+異甘草素組的瘤體重量均顯著下降，其中放療+異甘草素組移植瘤重量最小，與對照組相比和放療組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)公式計算各實驗組抑瘤率，可知異甘草素組，放療組和放療+異甘草素組的抑瘤率分別為14.7%，50.8%，68.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

組別對照組異甘草素組放療組放療+異甘草素組移植瘤質(zhì)量(g)1.42±0.651.17±0.430.69±0.530.56±0.74抑瘤率(%)14.750.860.4P值0.3820.0430.017

圖2 治療后4組移植瘤的質(zhì)量

2.3 熒光定量 PCR檢測乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA在各組瘤體中的表達(dá)差異 TRIZOL法提取鼻咽癌瘤體組織標(biāo)本的RNA，經(jīng)RT PCR之后，Real time PCR檢測HIF-1α、VEGF mRNA在4組裸鼠中的表達(dá)情況。與對照組和放療組相比，放療+異甘草素組HIF-1α mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時，放療+異甘草素組VEGF mRNA水平表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明異甘草素治療聯(lián)合放療對鼻咽癌裸鼠移植瘤模型的放療增敏作用，可能是通過對HIF-1α、VEGF的調(diào)控來實現(xiàn)的。見表3，圖3。

組別對照組異甘草素組放療組放療+異甘草素組P值HIF-1α0.39±0.090.30±0.050.35±0.070.19±0.030.023VEGF 0.57±0.080.49±0.090.52±0.110.21±0.020.015

圖3 熒光定量PCR檢測4組移植瘤HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)差異

3 討論

鼻咽癌好發(fā)于東南亞及我國南方的廣東、廣西等地區(qū)，據(jù)統(tǒng)計，在這些高發(fā)地區(qū)，鼻咽癌每年的發(fā)病率為(15～50)人/10萬，且在近年來呈現(xiàn)逐年上升趨勢[7]。早期非轉(zhuǎn)移性鼻咽癌患者因其對放射線的高敏感性，采用局部強(qiáng)化放射治療一般可獲得滿意療效[8]。但對于中晚期鼻咽癌患者而言，由于區(qū)域復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生，往往對放化療不敏感，預(yù)后較差。因此，針對該類鼻咽癌患者，尋找新的方法以提高鼻咽癌對放射治療的敏感性，一直是國內(nèi)外學(xué)者們研究的熱點內(nèi)容，也是改善鼻咽癌患者生存質(zhì)量以及遠(yuǎn)期療效的重要途徑。近年來，中藥復(fù)方及單體有效成分的抗腫瘤作用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者們的重視。異甘草素作為黃酮類化合物中典型的一種，從甘草屬植物中提取獲得，有多項研究表明其在體內(nèi)及體外可發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用[9-11]。目前國內(nèi)外對異甘草素抗腫瘤的研究多集中在體外實驗，由于體外研究難以真實地模擬藥物在體內(nèi)的代謝過程，具有一定的局限性，因此，本研究通過構(gòu)建鼻咽癌裸鼠移植瘤模型，探究異甘草素在鼻咽癌中是否具有放療增敏作用，并進(jìn)行相關(guān)的機(jī)制研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予鼻咽癌裸鼠移植瘤模型定期腹腔注射一定濃度的異甘草素，能有效增加鼻咽癌裸鼠移植瘤模型對放療的敏感性。與對照組相比，我們發(fā)現(xiàn)同時給予腹腔注射異甘草素和定期局部放療照射處理后，鼻咽癌裸鼠移植瘤的生長收到了顯著的抑制，與單獨應(yīng)用局部放療以及單獨腹腔注射異甘草素相比，移植瘤體積及重量差異均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，異甘草素組、放療組、放療+異甘草素組的抑瘤率分別為14.7%，50.8%，68.4%，說明異甘草素能有效增加鼻咽癌裸鼠移植瘤的放療敏感性。Baba等[12]報道在化學(xué)致癌劑氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸腺癌模型中，異甘草素具有潛在的預(yù)防和治療結(jié)腸癌的作用。Chin等[13]研究證明腹腔注射濃度為300 mg/kg的異甘草素, 可顯著降低二甲肼(1,2-dimethylhydrazine)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸癌和肺癌的發(fā)病率。本研究發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌裸鼠異位移植瘤模型中，異甘草素不僅能有效抑制裸鼠移植瘤的生長，同時也可有效增加其放療敏感性，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

血管生成在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[14]。既往研究表明，放療時造成的乏氧環(huán)境，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的乏氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)，從而刺激其下游靶基因血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等的過度表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。同時，腫瘤血管形成又可降低放射敏感性, 引起放射抗拒[15-17]。因此，抑制腫瘤血管新生，可有效增加多種腫瘤的放療敏感性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異甘草素聯(lián)合放療組HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)水平顯著下降，與對照組、放療組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示異甘草素聯(lián)合放療對鼻咽癌裸鼠移植瘤的放療增敏作用，可能與降低了血管生成相關(guān)因子HIF-1α、VEGF的表達(dá)水平有關(guān)，從而為鼻咽癌的放射增敏治療提供了實驗依據(jù)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)異甘草素對人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型存在顯著的放療增敏作用，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)其作用可能通過抑制血管生成相關(guān)因子HIF-1α、VEGF的表達(dá)，從而抑制腫瘤新生血管生成來實現(xiàn)。放療耐受是影響鼻咽癌患者治療和預(yù)后的主要因素之一。異甘草素在體內(nèi)動物模型中，可有效的增加鼻咽癌的放療敏感性，具有相當(dāng)可觀的抗腫瘤潛能。隨著臨床研究的深入，本研究將為鼻咽癌的放療增敏劑在臨床中的運(yùn)用提供實驗依據(jù)，從而為進(jìn)一步提高鼻咽癌患者的放、化療效果提供解決方案。

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Effects of isoliquiritin on the radiotherapy sensitization in nude mice models of transplantation tumor with nasopharyngeal carcinoma of CNE2 cells

GUOJunyu,CHENYingchao.

DepartmentofOtolaryngology,CentralHospitalofXiaoganCity,Hubei,Xiaogan432100,China

Objective To observe the radiotherapy sensitization of isoliquiritin in nude mice models of transplantation tumor with nasopharyngeal carcinoma of CNE2 cells,and to explore the correlation between isoliquiritin and the expression levels of HIF-1α and VEGF.Methods The nasopharygeal cell line-CNE2 cells were inoculated into 20 female nude mice, when tumor nodule reached 4～6mm,these mice were randomly divided into four groups:control group, isoliquiritin group (50mg·kg-1·w-1),radiotherapy group (20Gy), isoliquiritin (50mg·kg-1·w-1) combined radiotherapy (20Gy) group (combination treatment group). The tumor size was measured regularly. After 20 days,the mice were sacrificed,the volume and weight of tumors were detected,moreover,the tumor inhibition rates were calculated and the expression levels of HIF-1αand VEGF mRNA were detected by Real-time PCR in the four groups.Results The volume and weight of tumors in combination treatment group were significantly decreased,as compared with those in the other three groups (P<0.05).Moreover the expression levels of IF-1α and VEGF mRNA in combination treatment group were significantly decreased,as compared with those in control group and radiotherapy group (P<0.05).Conclusion Isoliquiritin can enhance radiotherapy sensitization in nude mice of transplantation tumor with nasopharyngeal carcinoma,and its action mechanism may be correlated to its inhibitory effects on expressions of HIF-1α and VEGF so us to inhibit tumor angiogenesis.

isoliquiritin; nasopharyngeal neoplasms; radiotherapy sensitization; HIF-1α; VEGF

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.005

432100 湖北省孝感市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科

陳應(yīng)超，432100 湖北省孝感市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科；

E-mail：81176180@qq.com

R 739.6

A

1002-7386(2016)24-3704-04

2016-09-11)