河蜆多肽的理化特性及抗氧化性質(zhì)

楊玉孌，陳麗麗，杜雨芊，趙利*，袁美蘭，白春清

(1.江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，南昌 330013；2.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，南昌 330038)

河蜆多肽的理化特性及抗氧化性質(zhì)

楊玉孌1，陳麗麗1，杜雨芊2，趙利1*，袁美蘭1，白春清1

(1.江西科技師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，南昌 330013；2.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，南昌 330038)

文章研究了河蜆多肽的理化性質(zhì)和抗氧化性質(zhì)。結(jié)果表明：河蜆多肽具有很好的起泡性、溶解性和熱穩(wěn)定性以及良好的吸油性；相對(duì)分子質(zhì)量集中在70～2000 Da范圍內(nèi)(占95%以上)，其中數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為72的肽含量最多，占36.38%；必需氨基酸含量較高，占42.69%；呈味氨基酸含量為34.88%，具有很好的呈味效果；有很強(qiáng)的清除DPPH自由基活性，IC50=2.55 mg/mL，鐵離子還原力FRAP值為95.52 μmol/mg，而對(duì)羥自由基和超氧陰離子的清除活性較弱。

河蜆；多肽；理化性質(zhì)；抗氧化性質(zhì)

生物活性肽是具有特殊生理活性的肽類，這方面的研究近幾年已成為食品科學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)，主要涉及到改善和提高礦物質(zhì)的運(yùn)輸和吸收、抗菌、提高免疫力、抗氧化、抗高血壓和降血脂等功能[1]。國(guó)內(nèi)外有研究報(bào)道了關(guān)于貝類蛋白及其水解物的研究[2]，相繼從河蚌[3]、文蛤[4]、紫貽貝[5]、牡蠣[6]、美洲簾蛤[7]和馬氏珠母貝[8]等水產(chǎn)貝類制備出有特殊生理功能的生物活性肽。然而，目前使用的大多抗氧化劑由化學(xué)合成，對(duì)人體的肝、脾、肺有不利影響，可誘發(fā)惡性腫瘤等[9]。許多蛋白水解物都被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性，被認(rèn)為是安全性較高的抗氧化劑來(lái)源。

本文主要研究了河蜆多肽的理化特性和抗氧化性質(zhì)，主要測(cè)定了其起泡性和泡沫穩(wěn)定性、溶解性、熱穩(wěn)定性、吸油能力等理化特性，以及河蜆多肽的相對(duì)分子量分布、氨基酸含量及構(gòu)成比例；并通過(guò)測(cè)定河蜆多肽對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基的清除率以及對(duì)鐵離子的還原力，探討了河蜆多肽的抗氧化活性。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

新鮮河蜆，殼長(zhǎng)1.5～2.5 cm，捕撈于鄱陽(yáng)湖水域。

Alcalase堿性蛋白酶(200000 U/mL) Novozymes公司；福林酚試劑 北京索萊寶生物科技有限公司；牛血清蛋白 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶吖嗪 Sigma公司；鄰菲羅啉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；TDL-5A離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；精密pH計(jì) Mettler Toledo；HZ-8812S多用途水浴恒溫振蕩器 Hualida Laboratory Equipment Company；T25高速分散機(jī)：IKA Works Guangzhou；BSA224S-CW型電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；SNB-1數(shù)字式粘度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠；DA201-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；層析柱系統(tǒng)(DBS系列電腦自動(dòng)部分收集器、DHL-B電腦定時(shí)恒流泵、HD-3紫外檢測(cè)儀) 上海滬西分析儀器有限公司；層析柱(2.5 cm×60 cm) 上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠。

2 方法

2.1 河蜆多肽的制備

鮮活河蜆漂燙剝殼取肉，經(jīng)絞肉機(jī)絞碎、膠體磨勻漿，用Alcalase堿性蛋白酶在50 ℃，加酶量為2%，pH為8.5，底物蛋白濃度為2%的條件下酶解3 h，5000 r/min離心20 min取上清液冷凍干燥即為粗多肽粉，粗多肽經(jīng)DA201-C大孔吸附樹脂吸附乙醇，解吸得到分離純化，過(guò)柱條件為：層析柱(2.5 cm×60 cm)，上樣濃度為30 mg/mL，上樣流速為1 BV/h，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)流出液的A220 nm，以A220 nm=0.05為穿透點(diǎn)，達(dá)到穿透點(diǎn)停止上樣，用蒸餾水洗滌層析柱至洗脫液的電導(dǎo)率與去離子水相當(dāng)，水清洗結(jié)束后用75%濃度的乙醇以0.5 BV/h的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液經(jīng)旋蒸濃縮、冷凍干燥即為純化河蜆多肽。

2.2 河蜆多肽中基礎(chǔ)成分的測(cè)定

水分：GB 5009.3-2010《食品中水分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量：GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；灰分：GB 5009.4-2010《食品中灰分的測(cè)定》。

2.3 河蜆多肽理化性質(zhì)的測(cè)定

2.3.1 河蜆多肽的起泡性及泡沫穩(wěn)定性[10-13]

將大豆分離蛋白、乳清蛋白、河蜆多肽配制成1%(W/V)的懸濁液，取10 mL于50 mL離心管中，分別加入1 mol/L鹽酸溶液或1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)水解液pH分別為2,4,6,8，10，用分散機(jī)在13500 r/min下分散1 min，分別測(cè)定分散操作停止時(shí)泡沫體積和液體體積之和V0，以及分散操作停止0，5，10，15，20 min時(shí)的泡沫體積Vx。起泡性(foaming characteristics，F(xiàn)C)和泡沫穩(wěn)定性(foam stability，F(xiàn)S)計(jì)算公式如下：

2.3.2 河蜆多肽的溶解性

采用Folin-Phenol法測(cè)定不同pH 值下河蜆多肽的溶解性。

牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取250 μg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液100，200，400，600，800，1000 μL 于10 mL比色管中，用水補(bǔ)至1 mL，所得濃度依次為25,50,100,125,200,250 μg/mL，依次加入Folin-Phenol試劑甲液5 mL，F(xiàn)olin-Phenol試劑乙液0.5 mL，立即混勻，于25 ℃水浴30 min，取出后于500 nm處測(cè)定吸光度，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶解性：采用福林酚法，測(cè)定不同pH 值下河蜆多肽的溶解性。根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解性最低的原理，通過(guò)測(cè)蛋白質(zhì)的溶解性來(lái)測(cè)定樣品的等電點(diǎn)。參照文獻(xiàn)[14]稍作改動(dòng)，用氮溶解指數(shù)(nitrogen solubility index，NSI)來(lái)評(píng)價(jià)河蜆多肽的溶解性。取9支只50 mL離心管，各取0.5 g河蜆多肽溶解于25 mL水中，用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)pH(2～10)，振蕩30 min后經(jīng)5000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)可溶性氮指數(shù)。用Folin-Phenol法測(cè)上清液中和樣品中的總蛋白含量，氮溶解指數(shù)計(jì)算公式如下：

2.3.3 河蜆多肽的熱穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性：將濃度為1.0%的河蜆蛋白分別在不同的pH值(2～10)和不同溫度(70～90 ℃)下加熱30 min后，經(jīng)5000 r/min離心20 min，用Folin-Phenol法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，河蜆多肽的熱穩(wěn)定性以上清液中蛋白質(zhì)含量占總蛋白的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。

2.3.4 河蜆多肽的吸油能力[15]

吸油能力(OAC)：稱取 M g河蜆多肽與食用大豆油以1∶12比例混合，加入已稱重的離心管M1中，加蓋搖勻1 min后室溫放置30 min，5000 r/min下離心20 min，用吸管吸去上層液層，再將離心管倒置在濾紙上25 min后稱重M2。以大豆分離蛋白和乳清蛋白作為對(duì)比。

2.4 河蜆多肽相對(duì)分子量分布的測(cè)定

采用HPLC檢測(cè)河蜆多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布，色譜條件：色譜柱：TSKgel 2000 SWXL(300 nm×7.8 mm)；流動(dòng)相體積比：乙醇+水+氯乙酸=450+550+1；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；流量：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。以細(xì)胞色素C(MW 12500)、桿菌酶(MW 1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189) 為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品，做相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 河蜆多肽的氨基酸組成分分析

河蜆多肽的氨基酸組成：采用氨基酸自動(dòng)分析儀法；準(zhǔn)確稱取河蜆多肽0.5 g置入水解管中，加入15 mL濃度為6 mol/L的HCl，真空封口后放在110 ℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解24 h，待冷卻后，定容至25 mL，吸取濾液100 μL 在 40 ℃的真空干燥器中進(jìn)行干燥，最后用0.2 mol/L HCl定容至1 mL。采用氨基酸分析儀測(cè)定河蜆多肽除色氨酸以外的氨基酸含量。

2.6 河蜆多肽的抗氧化性質(zhì)

2.6.1 河蜆多肽對(duì)DPPH自由基的清除率[16]

DPPH自由基是一種較穩(wěn)定的自由基，它已被廣泛應(yīng)用于抗氧化劑清除自由基活性的評(píng)價(jià)中[17,18]。DPPH溶解在乙醇中呈深紫色，在可見光區(qū)517 nm處有最大吸收峰，將河蜆多肽配制成1，2，3，4，5 mg/mL的溶液，取 2 mL多肽溶液于試管中再加入2 mL的DPPH溶液(0.1 mmol/L，0.004%，W/W)，輕輕振蕩，使充分混勻，在避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)于517 nm下測(cè)定吸光度值。

式中：以水代替河蜆多肽溶液、無(wú)水乙醇代替DPPH溶液做空白試驗(yàn)；A1為樣品實(shí)驗(yàn)的吸光值；A0為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的吸光值(以水代替河蜆多肽溶液)；A2為樣品干擾實(shí)驗(yàn)的吸光值(以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液)。

2.6.2 羥基自由基清除活性的測(cè)定[19,20]

羥基自由基清除活性的測(cè)定用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)。H2O2與二價(jià)鐵離子發(fā)生Fenton反應(yīng)生成·OH，·OH把體系中鄰二氮菲-Fe2+氧化成鄰二氮菲-Fe3+，在536 nm處的最大吸收峰減弱，當(dāng)體系中存在抗氧化劑時(shí)，可使此氧化反應(yīng)受抑制，從而通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定加入抗氧化劑前后吸光度變化，計(jì)算自由基清除率。在10 mL試管中依次加入鄰二氮菲(5 mmol/L)1.0 mL，PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.4)2.0 mL，河蜆多肽溶液(6,8,10,12,14,16,18,20 mg/mL)，H2O2(0.1%，V/V)1.0 mL，37 ℃水浴1 h。用紫外-可見分光光度計(jì)在536 nm處測(cè)定加入抗氧化劑前后吸光度變化，計(jì)算自由基清除率。羥基自由基清除活性的計(jì)算如下：

式中：A1為樣品的吸光度值；A0為空白對(duì)照，用雙蒸水代替樣品；A2為干擾試驗(yàn)，用雙蒸水代替除樣品以外的物質(zhì)。

2.6.3 鐵離子還原力(FRAP)的測(cè)定[21,22]

FRAP溶液的配制：將醋酸鹽緩沖液(0.3 mol/L，pH 3.7)、氯化鐵溶液(0.02 mol/L)和三吡啶吖嗪(TPTZ)溶液(0.01 mol/L，用0.04 mol/L的鹽酸溶液配制)，以10∶1∶1的體積比混勻。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取0,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mL FeSO4溶液 (1.0 mol/L)于7支試管中，分別加水至1.0 mL，再分別加入5.0 mL FRAP試劑，搖勻，37 ℃水浴10 min，用分光光度計(jì)在593 nm處測(cè)吸光值。以FeSO4的μmoL數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測(cè)定：取1 mL樣品于試管中，加入5 mL FRAP試劑，搖勻于37 ℃下水浴10 min，用分光光度計(jì)測(cè)593 nm處的吸光值。以蒸餾水代替河蜆多肽溶液做空白試驗(yàn)；以蒸餾水代替氯化鐵溶液做干擾實(shí)驗(yàn)吸光值記作A2；樣品的吸光值為A1；樣品抗氧化能力(FRAP值)是以每毫克樣品達(dá)到相同吸光度(A1-A2)所需FeSO4的μmol數(shù)表示。

2.6.4 超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定[23,24]

表1 超氧陰離子自由基清除活性測(cè)定加樣表
Table 1 The scavenging capacity of super oxideygen anion free radical

Tris-HCl蒸餾水10mmol/LHCl鄰苯三酚總體積空白試驗(yàn)4.54.20.39對(duì)照試驗(yàn)4.54.20.39樣品4.54.20.39

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧陰離子清除活性。配制不同濃度的河蜆多肽溶液，按表1加入樣品和試劑,迅速搖勻后倒入比色皿中，用分光光度計(jì)在420 nm處測(cè)定1次吸光值，每隔30 s測(cè)定1次5 min后停止，計(jì)算鄰苯三酚的自氧化速率，根據(jù)鄰苯三酚的自氧化速率計(jì)算抑制率，用下式計(jì)算清除超氧陰離子活性(scavenging activity, SA)：

式中：V0為對(duì)照管吸光度值隨時(shí)間的變化率；VS為樣品管吸光度值隨時(shí)間的變化率；pH為8.2 Tri-HCl緩沖液(0.1 mol/L)用2 mmol/L EDTA配制；鄰苯三酚(60 mmol/L)用10 mmol/L HCl配制。

2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各試驗(yàn)平行3次。

3 結(jié)果與討論

3.1 河蜆多肽的基礎(chǔ)成分

河蜆多肽的化學(xué)成分見表2。

表2 河蜆多肽的化學(xué)成分Table 2 The chemical composition of Corbicula fluminea polypeptide g/100 g

3.2 河蜆多肽理化性質(zhì)

3.2.1 河蜆多肽的起泡性及泡沫穩(wěn)定性

起泡性是蛋白質(zhì)和多肽的重要功能性質(zhì)之一，相對(duì)分子質(zhì)量高的肽或者部分水解蛋白具有較好的成膜粘附性[25]。蛋白質(zhì)起泡方法的測(cè)定是在有大量氣體存在時(shí)攪打蛋白溶液，攪打能產(chǎn)生較為激烈的機(jī)械應(yīng)力和剪切作用，使蛋白質(zhì)分散液在氣水界面處的表面張力降低，其重疊的分子部分展開，氣體被卷入液體并滯留從而形成泡沫并分散均勻[26]。影響起泡能力的因素主要有蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、濃度、溫度、pH 值、離子強(qiáng)度、攪打時(shí)間和強(qiáng)度，以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物在水-空氣界面的相互作用等[27]。

圖1 河蜆多肽的起泡性Fig.1 The foaming capacity of Corbicula fluminea polypeptide

由圖1可知，河蜆多肽、大豆分離蛋白、乳清蛋白的起泡性是隨pH值的增大呈下降趨勢(shì)。影響泡沫穩(wěn)定性的因素主要有蛋白膜壓力、連續(xù)相之間的粘彈性和界面張力[28]。水在重力條件下具有流動(dòng)性、泡沫之間氣體擴(kuò)散會(huì)導(dǎo)致氣體不均衡，這是泡沫不穩(wěn)定的主要因素[29,30]。3種蛋白的起泡穩(wěn)定性見圖2，隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)，泡沫迅速減少，到一定程度后趨于穩(wěn)定。

圖2 河蜆多肽的泡沫穩(wěn)定性Fig.2 The foaming stability of Corbicula fluminea polypeptide

3.2.2 河蜆多肽的溶解性

不同pH 值下河蜆多肽的溶解性見圖3。

圖3 河蜆多肽在不同 pH 下的溶解性Fig.3 The solubility of Corbicula fluminea polypeptide in different pH values

根據(jù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處溶解性最低的原理，通過(guò)測(cè)蛋白質(zhì)的溶解性來(lái)測(cè)定樣品的等電點(diǎn)。由圖3可知，在 pH 2.0～10.0 范圍內(nèi)，河蜆多肽在pH值為5～6之間，溶解性呈現(xiàn)出 U 形，達(dá)到最低點(diǎn)。在pH值<3和>8時(shí)，河蜆多肽的溶解性都有所下降，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在等電點(diǎn)處呈電中性，分子之間缺少靜電排斥力，疏水相互作用導(dǎo)致河蜆蛋白大部分聚集和沉淀，表現(xiàn)為溶解性降低。

3.2.3 河蜆多肽的熱穩(wěn)定性

由于蛋白質(zhì)具有不耐熱的特性，在一定程度上限制了它們的應(yīng)用，蛋白質(zhì)水解為多肽后其分子量變小，溶解度增大，熱穩(wěn)定性也相應(yīng)增大。河蜆多肽在不同pH值、不同溫度下加熱一定時(shí)間的穩(wěn)定性情況見圖4。

圖4 河蜆多肽在不同 pH 下的熱穩(wěn)定性Fig.4 The thermostability of Corbicula fluminea polypeptide in different pH values

由圖4可知，在較寬的pH值范圍內(nèi)，隨著加熱溫度的升高，河蜆多肽均具有良好的溶解性，在較低的pH值條件下，溶解度略微下降，但在中性及堿性條件下其溶解性基本上可以得到保持，即便有很少的、細(xì)小的聚集物產(chǎn)生，但這些聚集物仍然能夠保持可溶狀態(tài)。

3.2.4 河蜆多肽的吸油能力

表3 河蜆多肽的吸油能力Table 3 OAC of Corbicula fluminea polypeptide g/g

由表3可知，河蜆多肽具有較好的吸油能力，其吸油能力遠(yuǎn)大于大豆分離蛋白和乳清蛋白。多肽具有的良好吸油性使它能廣泛用于高油食品中，使產(chǎn)品組織細(xì)膩、口感好，同時(shí)又能提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

3.2.5 河蜆多肽相對(duì)分子質(zhì)量

在TSKgel 2000 SWXL(300 nm×7.8 mm)色譜柱上，以乙醇/水/氯乙酸(450∶550∶1)為流動(dòng)相， 以細(xì)胞色素C(MW 12500 U)、抑肽酶(MW 6500 U)、桿菌酶(MW 1450 U) 、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451 U)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW 189 U)為相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品。回歸方程為log MW=6.98e+000-2.42e-001 T^1，相關(guān)系數(shù)r=0.997589。表明相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)與各標(biāo)樣的洗脫時(shí)間呈很好的線性關(guān)系，可以準(zhǔn)確地測(cè)定河蜆多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍。

圖5 河蜆多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布圖譜Fig.5 Molecular weight distribution of Corbiculafluminea polypeptide

注：色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 nm×7.8 mm；流動(dòng)相體積比為乙醇+水+氯乙酸=450+550+1；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；流量為0.5 mL/min；柱溫為30 ℃。

表4 河蜆多肽的分子量分布
Table 4 Molecular weight distribution ofCorbiculaflumineapolypeptide

各峰值的保留時(shí)間MnMwMp峰面積所占比例(%)13.6676718723950100.6714.5523705378430171.2215.2802373240719872.1816.4651325137310088.3017.32266869061720.8018.74727529327230.4519.670729916036.38

由圖5和表4可知，河蜆多肽有多種不同相對(duì)分子質(zhì)量的組分，河蜆多肽的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量Mn為72的肽含量最多，約占36.38%。

3.3 河蜆多肽的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

平共處河蜆多肽的氨基酸組成見表5。

表5 河蜆多肽的氨基酸組成
Table 5 Amino acid composition ofCorbiculaflumineapolypeptide

氨基酸氨基酸含量(mol/kg)氨基酸含量(mg/g)氨基酸含量(%)天冬氨酸(Asp)0.51568.5510.88蘇氨酸(Thr*)0.35141.8156.64絲氨酸(Ser)0.2930.484.84谷氨酸(Glu)0.54379.89812.69甘氨酸(Gly)0.51838.896.179丙氨酸(Ala)0.36332.345.14半胱氨酸(Cys)0.0222.670.42纈氨酸(Val*)0.32037.495.95蛋氨酸(Met*)0.10916.2692.58異亮氨酸(Ile*)0.27235.685.67亮氨酸(Leu*)0.3849.857.92酪氨酸(Tyr)0.20436.965.87苯丙氨酸(Phe*)0.27645.597.24賴氨酸(Lys*)0.28842.106.69組氨酸(His)0.09414.572.31精氨酸(Arg)0.32556.6158.990218總量4.870629.74

注：“*”為必需氨基酸。

由表5可知，河蜆多肽中必需氨基酸含量較高，占總氨基酸含量的42.69%(除色氨酸以外)。河蜆多肽中谷氨酸含量最多，占總氨基酸含量的12.69%，河蜆多肽體系中的呈味氨基酸(天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)含量較高，占總氨基酸含量的34.88%，這說(shuō)明河蜆多肽具有很好的鮮味，適合用于開發(fā)風(fēng)味調(diào)料、調(diào)味品等。此外，河蜆多肽還含有促進(jìn)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的組氨酸和精氨酸，含量分別占氨基酸總量的2.31%和8.99%。

3.4 河蜆多肽的抗氧化性質(zhì)

3.4.1 不同濃度河蜆多肽對(duì)DPPH·的清除率

圖6 不同濃度河蜆多肽對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 DPPH free radical scavenging effect of Corbicula fluminea polypeptide

由圖6可知，河蜆多肽對(duì)DPPH·的清除率，隨著多肽濃度由1～4 mg/mL增加呈上升趨勢(shì)；當(dāng)多肽濃度達(dá)到5 mg/mL后，濃度的增加對(duì)DPPH·的清除率影響緩慢。河蜆多肽對(duì)DPPH·清除率的IC50=2.55 mg/mL。IC50表示待測(cè)物質(zhì)對(duì)測(cè)試自由基的半數(shù)清除濃度，IC50值越小，則表明待測(cè)抗氧化劑的自由基清除能力越大，其抗氧化活性也越強(qiáng)。游麗君[31]研究了泥鰍多肽清除 DPPH·的 IC50值為2.64 mg/mL。多肽清除DPPH·的機(jī)理是肽自由基作為供氫體給自由基形成穩(wěn)定的自由基中間體，從而終止了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[32]。清除自由基能力的大小與蛋白水解后多肽中氨基酸的組成有關(guān)，含有較多疏水性氨基酸的蛋白水解物或多肽具有更強(qiáng)的清除自由基能力[33]。

3.4.2 不同濃度河蜆多肽對(duì)羥自由基的清除率

·OH是進(jìn)攻性最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)之一，·OH的反應(yīng)十分短暫，有非常高的速度常數(shù)[34]。·OH可降解 DNA、細(xì)胞膜和多糖類化合物，威脅生物體健康[35]?？寡趸瘎┣宄H的機(jī)理是有效抑制經(jīng) Fenton 反應(yīng)后·OH 的產(chǎn)生[36]。由于 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生·OH 需要 Fe2+的參與，因此具有螯合金屬能力的物質(zhì)可以延緩·OH的產(chǎn)生。

圖7 不同濃度河蜆多肽對(duì)·OH的清除作用Fig.7 Scavenging effect of Corbicula fluminea polypeptide on·OH

由圖7可知，河蜆多肽對(duì)·OH的清除能力隨濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到18 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到最大值，為36.12%，之后再增大濃度，對(duì)·OH的清除率無(wú)顯著影響。

3.4.3 河蜆多肽對(duì)鐵離子的還原力

不同濃度的河蜆多肽對(duì)鐵離子的還原力見圖8，吸光值越高,河蜆多肽對(duì)鐵離子的還原力就越強(qiáng)。

圖8 不同濃度河蜆多肽的還原力Fig.8 Reducing activity of Corbicula Fluminea polypeptide

由圖8可知，隨著河蜆多肽濃度的增大，對(duì)鐵離子的還原力也逐漸增大，有明顯的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9988。河蜆多肽的鐵離子還原力FRAP值為95.52 μmol/mg。

3.4.4 河蜆多肽對(duì)超氧陰離子的清除率

不同濃度河蜆多肽對(duì)超氧陰離子的清除率見圖9。

圖9 不同濃度河蜆多肽對(duì)O2-·的清除作用Fig.9 Scavenging effect of Corbicula fluminea polypeptide on superoxide anion radical

河蜆多肽對(duì)超氧陰離子的清除率與濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，在5～25 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)超氧陰離子的清除率隨濃度的增大不斷增大，在多肽濃度為25 mg/mL時(shí)的清除率最高為45.13%，之后多肽濃度繼續(xù)增大，清除率增加緩慢。

4 結(jié)論

河蜆多肽具有較好的起泡性、溶解性和熱穩(wěn)定性；河蜆多肽具有良好的吸油性。

河蜆多肽的相對(duì)分子質(zhì)量集中在70～2000 Da范圍內(nèi)(占95%以上)，其中數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為72的肽含量最多，占36.38%；河蜆多肽中必需氨基酸含量較高，占42.69%，呈味氨基酸含量為34.88%；此外，河蜆多肽還含有促進(jìn)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的組氨酸和精氨酸。

河蜆多肽具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基活性，IC50=2.55 mg/mL；河蜆多肽具有較強(qiáng)的鐵離子還原力，河蜆多肽的鐵離子還原力FRAP值為95.52 μmol/mg；河蜆多肽對(duì)羥基自由基和超氧陰離子的清除活性較弱。

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Physicochemical Property and Antioxidant Activity of Corbiculafluminea Polypeptide

YANG Yu-luan1, CHEN Li-li1, DU Yu-qian2, ZHAO Li1*, YUAN Mei-lan1, BAI Chun-qing1

(1.College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, National R & D Branch Centre for Freshwater Fish Processing Technology, Nanchang 330013, China; 2.Nanchang Food and Cosmetics Supervision Institute, Nanchang 330038, China)

The functional properties and antioxidant activity ofCorbiculaflumineapolypeptide are studied. TheCorbiculaflumineapolypeptide has good foaming ability,protein solubility, thermostability and oil absorption.The relative molecule weight ofCorbiculaflumineapolypeptide is in the range of 70～2000 Da, the peptides with the number-average molecular weight about 72 are the most, accounting for 36.38%. The content of essential amino acids and flavor amino acids is high, accounting for 42.69%, 34.88% respectively. The activity of scavenging DPPH (IC50=2.55 mg/mL) and iron reduction capability (FRAP=95.52 μmol/mg) is stronger than superoxide anion free radical and hydroxyl radical.

Corbiculafluminea; polypeptide; physicochemical property; antioxidant activity

2016-06-14 *通訊作者

南昌市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(洪財(cái)企[2012]80號(hào))；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目

楊玉孌(1989-)，女，碩士，研究方向：食品化學(xué)；

趙利(1967-)，女，教授，博士，研究方向：食品化學(xué)。

TS254.1

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2016.12.013

1000-9973(2016)12-0059-08