陳艾，陳芷，沈興

(1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學)

糖氧剝奪再灌注對PC12細胞自噬、凋亡的影響及意義

陳艾1，陳芷2，沈興1

(1西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2西南醫(yī)科大學)

目的 觀察糖氧剝奪再灌注對PC12細胞自噬、凋亡的影響，探討激活自噬調(diào)控神經(jīng)元損傷修復(fù)的有效時間窗。方法 將高分化的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞隨機分為四組，分別置于缺氧(1% O2、5% CO2、94% N2)環(huán)境中培養(yǎng)0 h(OGD 0 h組)、1 h(OGD 1 h組)、2 h(OGD 2 h組)、3 h(OGD 3 h組)；換用含10%滅活胎牛血清的高糖雙抗DMEM培養(yǎng)液，正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、4、8、12 h；采用CCK-8法檢測四組各時間點細胞增殖率，采用RT-PCR法檢測自噬基因微管相關(guān)蛋白2輕鏈3(LC3-Ⅱ)、凋亡基因Caspase-3相對表達量。結(jié)果 OGD 1 h組灌注后各時間點細胞增殖率均高于同時間點OGD 2 h及OGD 3 h組，組間比較P均<0.05；三組再灌注4、8、12 h時細胞增殖率均逐漸降低(P均<0.05)，0、4 h時細胞增殖率比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。四組再灌注4 h時LC3-Ⅱ相對表達量均低于同組0 h，OGD 1 h、OGD 2 h組再灌注4 h時Caspase-3相對表達量均低于同組0 h，OGD 1 h、 OGD 2 h組再灌注12 h時LC3-Ⅱ、Caspase-3相對表達量均高于同組4、8 h，組間及組內(nèi)比較P均<0.05。結(jié)論 糖氧剝奪再灌注可誘導PC12細胞發(fā)生自噬及凋亡，半暗帶修復(fù)時間窗以糖氧剝奪4 h內(nèi)為宜。

腦缺血再灌注損傷；糖氧剝奪再灌注；PC12細胞；微管相關(guān)蛋白2輕鏈3；Caspase-3

腦缺血再灌注損傷(CIRI)是兒科常見的病理現(xiàn)象，涉及各年齡段兒童，可繼發(fā)于新生兒圍產(chǎn)期窒息，亦可繼發(fā)于阿斯綜合征、重度脫水、感染等各種原因?qū)е碌男菘耍職埪蕵O高[1]；CIRI發(fā)生后有效時間窗內(nèi)進行半暗帶神經(jīng)元修復(fù)是其治療的重點[2]。有研究認為，輕度缺氧能誘發(fā)適度自噬，促使神經(jīng)元自我清除代謝產(chǎn)物而發(fā)揮神經(jīng)保護作用；缺氧嚴重則誘導過度自噬，促進神經(jīng)元加速向凋亡及壞死進展[3]。大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞是一類具有交感神經(jīng)元特性的細胞，能分泌兒茶酚胺類遞質(zhì)[4]；糖氧剝奪再灌注是誘導CIRI的常用實驗方法。2014年1月～2016年1月，本研究觀察了糖氧剝奪再灌注對PC12細胞自噬及凋亡的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討糖氧剝奪再灌注激活自噬調(diào)控神經(jīng)元損傷修復(fù)的有效時間窗。

1 材料與方法

1.1 材料 高分化的PC12細胞株由四川大學婦幼研究所饋贈，本實驗室凍存。高糖改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、不含葡萄糖的DMEM購自美國Sigma公司，CCK-8試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。Maxi-MixⅡ試管震蕩器(Barnstead/Thermolyne公司，美國)，CO2培養(yǎng)箱(SANYOMCO15AC，日本)，倒置相差顯微鏡(Olympus IX2-SLP，日本)，三氣培養(yǎng)箱(Thermo Scientific 3110，美國)，F(xiàn)TC2000實時熒光定量基因擴增儀(楓嶺公司，加拿大)，MSE Micro-Centaur Centrifuge微型臺式離心機(日本Sanyo公司)，Gel Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc，BIO-RAD，USA)。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理 凍存的PC12細胞復(fù)蘇后吹打至單細胞懸液，接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，內(nèi)含10%滅活胎牛血清的高糖雙抗DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，70%～80%滿瓶時傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。取第5～8代對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)研究。建立細胞糖氧剝奪再灌注模型，具體步驟為將PC12細胞棄去原培養(yǎng)基，用預(yù)熱PBS洗滌3次，加入無糖改良Eagle培養(yǎng)基，隨機分為四組，分別置于缺氧(1% O2、5% CO2、94% N2)環(huán)境中培養(yǎng)0 h(OGD 0 h組)、1 h(OGD 1 h組)、2 h(OGD 2 h組)、3 h(OGD 3 h組)；換用含10%滅活胎牛血清的高糖雙抗DMEM培養(yǎng)液，正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、4、8、12 h。

1.3 相關(guān)指標觀察

1.3.1 細胞增殖率檢測 采用CCK-8法。調(diào)整各組各時間點細胞懸液密度至5×105個/mL，分別以100 μL/孔接種于96孔板中。每孔加入占培養(yǎng)體系總體積1/10的CCK-8試劑，37 ℃、5% CO2孵箱中孵育0.5 h，在ELX-800全自動酶標儀上檢測450 nm波長處的光密度(OD)值。每組6孔，實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。以正常培養(yǎng)細胞的OD值為基數(shù)100%，計算各組細胞增殖率。細胞增殖率=觀察孔OD值/基線對照孔OD值×100%。

1.3.2 LC3-Ⅱ、Caspase-3基因表達檢測 采用RT-PCR法。提取1.2中各時間點細胞的RNA，對提取的總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Fermentas公司的Revert AidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit在PCR儀上進行擴增。反應(yīng)體系為30 μL：10×buffer 3 μL、MgCl2(25 mmol/L)3 μL、dNTP(25 mmol/L)0.36 μL、上游引物(10 μmol/L)1 μL、下游引物(10 μmol/L)1 μL、探針(10 μmol/L)1 μL、Taq酶(5 U/μL)0.3 μL、ddH2O 15.34 μL、cDNA模板5 μL。引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小見表1。將原始數(shù)據(jù)(Ct值)采用2-ΔCt換算為基因的相對表達量。

表1 引物序列、退火溫度及產(chǎn)物大小

2 結(jié)果

2.1 各組再灌注后不同時間點細胞增殖率比較OGD1h組灌注后各時間點細胞增殖率均高于同時間點OGD2h組及OGD3h組，組間比較P均<0.05；三組再灌注4、8、12h時細胞增殖率均逐漸降低(P均<0.05)，0、4h時細胞增殖率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組再灌注后不同時間點細胞增殖率

2.2 各組再灌注后不同時間點LC3-Ⅱ、Caspase-3相對表達量比較 四組再灌注4 h時LC3-Ⅱ相對表達量均低于同組0 h，OGD 1 h、2 h組再灌注4 h時Caspase-3相對表達量均低于同組0 h，OGD 1 h、2 h組再灌注12 h時LC3-Ⅱ、Caspase-3相對表達量均高于同組4、8 h，組間及組內(nèi)比較P均<0.05。見表3。

表3 各組再灌注后不同時間點LC3-Ⅱ、Caspase-3相對表達量

3 討論

生理情況下細胞內(nèi)存在低水平自噬，以維持細胞正常代謝及穩(wěn)態(tài)。當CIRI發(fā)生時，自噬會清除無功能的細胞器以維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)，防止其快速凋亡，從而為半暗帶的修復(fù)贏得時間[5]，改善預(yù)后。半暗帶區(qū)腦組織可見暗神經(jīng)元、神經(jīng)元腫脹、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞反應(yīng)，而細胞骨架正?；蜉p微改變且持續(xù)存在于損傷梗死區(qū)邊緣。Hudak等[6]報道，半暗帶中的細胞呈現(xiàn)細胞內(nèi)水腫，且隨時間的延長水腫逐漸加重，但范圍相對縮小。電鏡下可見細胞器腫脹，而血腦屏障完整。半暗帶有效搶救時間一般認為是在血腦屏障保持完整之前，即缺血后4～6 h;但不同缺血缺氧程度可能在不同時間激活自噬與凋亡，且打擊程度誘發(fā)自噬及凋亡的程度也不同[7,8]，因此本研究分別給予PC12細胞缺糖氧剝奪1、2、3 h，以模擬細胞的輕、中、重度缺血缺氧損傷。在神經(jīng)元缺血再灌注損傷中，自噬、凋亡、壞死的動態(tài)過程一直是研究者關(guān)注的焦點[9]。有學者認為凋亡與自噬可以相互轉(zhuǎn)化，因此如何將進入凋亡程序的細胞誘導為自噬，是神經(jīng)元修復(fù)的重點[10]。亦有學者認為自噬—凋亡—壞死只能以射線順序發(fā)生，不可逆轉(zhuǎn)或者循環(huán)[11]。因此神經(jīng)損傷修復(fù)的重點是誘導加強適度自噬，以抑制凋亡發(fā)生。

適度自噬是對抗CIRI的機制之一[12]，即當遭遇營養(yǎng)缺乏、氧氣剝奪等應(yīng)激時，細胞會產(chǎn)生單層或雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞內(nèi)受損細胞器形成自噬前體，逐漸延伸封閉形成自噬小體，與溶酶體對接融合形成自噬溶酶體，最后其內(nèi)受損細胞器被溶酶體降解成小分子物質(zhì)循環(huán)使用。自噬小體中存在14 kD的LC3Ⅱ，因此存在于細胞質(zhì)中的LC3-Ⅱ被認為是細胞發(fā)生自噬的分子標志，且LC3-Ⅱ含量與發(fā)生自噬的程度呈正比[13]。本研究結(jié)果顯示，OGD 1、2、3 h組PC12細胞在復(fù)氧4 h內(nèi)細胞增殖率比較無明顯統(tǒng)計學差異，復(fù)氧4 h后細胞增殖率均下降。肖君等[14]研究發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)的新生大鼠大腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞在缺氧6 h、復(fù)氧48 h內(nèi)星形膠質(zhì)細胞的細胞活力未發(fā)生明顯改變。糖氧剝奪2 h內(nèi)，PC12細胞的凋亡基因Caspase-3表達逐漸增多，提示雖然CCK-8法檢測細胞增殖活性尚可，但實際上細胞已經(jīng)開始出現(xiàn)糖氧剝奪應(yīng)激損傷產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。與此同時，OGD 1 h、OGD 2 h組PC12細胞自噬基因LC3-Ⅱ表達無明顯改變，提示此階段細胞的自噬能力大于其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，可清除細胞廢棄物，使細胞耐受2 h以內(nèi)的糖氧剝奪造成的細胞器破壞，以保持細胞增殖活力。進一步動態(tài)觀察再灌注12 h內(nèi)細胞增殖、自噬、凋亡的變化，結(jié)果顯示OGD 0 h組Caspase-3于再灌注不同時間未出現(xiàn)表達量的明顯波動；LC3-Ⅱ在再灌注4 h表達量最低，細胞活力也是從再灌注4 h急轉(zhuǎn)向下。提示隨著糖氧剝奪時間延長，其代謝產(chǎn)物增加，自噬負荷增加，細胞啟動適度自噬維持穩(wěn)態(tài)的能力逐漸減弱，在再灌注4 h時降至最低，半暗帶的修復(fù)可能在應(yīng)激后4 h內(nèi)更有效。再灌注>4～8 h階段，自噬及凋亡基因均進入穩(wěn)定表達期，再灌注8、12 h時，雖然LC3-Ⅱ及Caspase-3表達增加，但細胞增殖率下降；提示此時細胞崩解的速度以及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生已經(jīng)遠遠超過自噬所能承載，故即使細胞加強自我保護的調(diào)控程序，也難以維持細胞活力。雖然LC3-Ⅱ與Caspase-3于再灌注過程中的表達趨勢相似，但與OGD 0 h組相比，再灌注后各時間點各組LC3-Ⅱ相對表達量均降低，而OGD 1 h、OGD 2 h組Caspase-3相對表達量均高于OGD 0 h組；提示隨著缺氧程度的加重，在一定代償范圍內(nèi)凋亡越強自噬能力越弱。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可導致經(jīng)糖氧剝奪處理的皮質(zhì)神經(jīng)元存活率降低，Caspase-3表達上調(diào)；而加入自噬增強劑雷帕霉素組，皮質(zhì)神經(jīng)元存活率升高，Caspase-3表達下調(diào)[15]。上述結(jié)果提示，在缺血缺氧腦損傷早期啟動自噬可抑制神經(jīng)元凋亡，產(chǎn)生內(nèi)源性神經(jīng)保護作用；當超過細胞代償范圍即自噬能承載的代謝產(chǎn)物處理量，細胞迅速崩解壞死。一旦缺血缺氧應(yīng)激出現(xiàn)，自噬和凋亡是神經(jīng)元細胞同時啟動的自我保護程序，在探索自噬與凋亡的動態(tài)關(guān)系時一定要權(quán)衡應(yīng)激程度與耐受時間的平衡，應(yīng)激程度越重，自噬效能越弱，細胞可耐受時限越短。

綜上所述，糖氧剝奪再灌注可誘導PC12細胞發(fā)生自噬及凋亡，半暗帶修復(fù)時間窗以糖氧剝奪后再灌注4 h內(nèi)為宜。

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Effects of oxygen and glucose deprivation-reperfusion on autophagy and apoptosis of PC12 cells

CHENAi1,CHENZhi,SHENXing

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To observe the effects of oxygen and glucose deprivation-reperfusion (OGD/OGD-R) on autophagy and apoptosis of PC12 cells, and to evaluate the effective time window of OGD/OGD-activated autophagy-regulated neuron injury repair. Methods The high differentiated PC12 cells were cultured under hypoxia (1% O2, 5% CO2, 94% N2) and then randomly divided into 4 groups which were respectively cultured for 0 h (OGD 0 h group), 1 h(OGD 1 h group), 2 h (OGD 2 h group), 3 h (OGD 3 h group), followed by persistent culture in high glucose Dulbecco′s modified Eagle′s medium (DMEM) which supplemented with 10 % fetal bovine serum for another 0, 2, 4, 8, 12 h, respectively. The cell viability was analyzed by CCK-8. The expression of microtubule-associated protein 2-light chain 3 (LC3Ⅱ) and Caspase-3 gene of PC12 cells in each group at different time was detected RT-PCR. Results At each oxygen-glucose reperfusion time point, the cell viability of OGD 1 h group was higher than that of OGD 2 h and OGD 3 h group, the difference was statistically significant between these groups (allP<0.05). The cell viability of each OGD group gradually decreased as the reperfusion duration till to 4, 8 and 12 h, the difference was statistically significant between these time points (allP<0.05), except the comparison between 0 h and 4 h (allP>0.05). The relative expression of LC3Ⅱgene at reperfusion of 4 h (R4H) was lower than that of 0 h in each reperfusion groups including the control group. The relative expression of Caspase-3 gene at R4H was lower than that of R0 h in OGD 1 h and OGD 2 h groups respectively. The relative expression of LC3Ⅱand Caspase-3 gene at R12H in the OGD 1 h and OGD 2 h groups was higher than that at R4H and R8H, and the difference between groups and within groups was statistically significant (allP<0.05). Conclusions OGD-R can induce the autophagy and apoptosis of PC12 cells. The penumbra repair time window is advised to be less than 4 hours after oxygen and glucose deprivation.

cerebral ischemia-reperfusion injury; oxygen and glucose deprivation-reperfusion; PC12 cells; microtubule-associated protein 2-light chain 3; Caspase-3

四川省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題重點項目(15018)；四川省科技廳項目(2014TSX-0028)；西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院人才基金(201301E)。

陳艾(1978-)，女，副教授，研究方向為小兒神經(jīng)病學。E-mail: zuoma78@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.006

R722

A

1002-266X(2016)44-0020-04

2016-03-30)