高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素紫色紅曲霉轉(zhuǎn)化子篩選與代謝產(chǎn)物分析

許楚旋，任浩，章婷，馮青青，吳巧玉，蔣冬花

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素紫色紅曲霉轉(zhuǎn)化子篩選與代謝產(chǎn)物分析

許楚旋，任浩，章婷，馮青青，吳巧玉，蔣冬花

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

以紅曲米中篩選到的紫色紅曲霉Mp-41菌株為出發(fā)菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建了含有983株紅曲霉轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫。用紫外-可見光掃描方法等從轉(zhuǎn)化子庫中篩選出10株紅曲色素色價穩(wěn)定高于原始Mp-41菌株的轉(zhuǎn)化子，薄層層析結(jié)合高效液相色譜（HPLC）技術(shù)分析了10株轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液中桔霉素的含量；其中，轉(zhuǎn)化子62的紅曲色素色價較高，為95.4 U/mL，是原始Mp-41菌株（色素色價50.7 U/mL）的1.88倍，桔霉素含量穩(wěn)定低于原始Mp-41菌株。以原始Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子62為試驗材料，進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵并定時取樣，HPLC等方法分析生長量和發(fā)酵液中各種代謝產(chǎn)物的含量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子62生長速度稍快于原始Mp-41菌株，紅曲色素色價和莫納可林K的含量分別為120.76 U/mL，63.72 mg/L，是原始Mp-41菌株的1.5倍和1.21倍；而桔霉素含量為1.172 4 mg/L，是原始Mp-41菌株的35.08%。因此，利用T-DNA插入的方法對紅曲霉進行育種，能產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳變化，在紅曲霉資源的利用上有一定潛力。

紅曲霉；紅曲色素；桔霉素；發(fā)酵；T-DNA

紅曲霉（Monascus spp.）是我國釀造微生物中的一個重要的屬，至今已有數(shù)百年的歷史[1]。近幾年，紅曲霉的許多功效相繼被證實，其發(fā)酵產(chǎn)物紅曲色素、Y-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid，GABA）[2]、莫納可林K（Monacolin K）[3]等已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、食品加工及相關(guān)領(lǐng)域中[4-5]。

紅曲色素是紅曲霉生長過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，2個最大吸收波峰分別在410，510 nm附近，即黃色光波和紅色光波區(qū)；作為一種優(yōu)良的食品天然色素，其被廣泛應(yīng)用于糕點、罐頭、糖果等行業(yè)[6-9]。1995年法國學(xué)者首先在紅曲中發(fā)現(xiàn)毒性物質(zhì)——桔霉素，使紅曲產(chǎn)品在國內(nèi)外銷售受到了一定限制[10-11]。因此，提高紅曲霉有益代謝產(chǎn)物、降低桔霉素含量，對于保護和利用我國傳統(tǒng)微生物資源有重要意義[12-13]。

目前的研究熱點是從分子水平探討紅曲色素、桔霉素、Monacolin K等代謝產(chǎn)物之間的相互關(guān)系[14-15]，但進展比較緩慢，大多數(shù)研究成果還不能應(yīng)用于生產(chǎn)。工業(yè)微生物菌種的培育，也不失為一種有效發(fā)展紅曲霉應(yīng)用的方式，我國科學(xué)家利用紫外、微波、超聲波、氯化鋁等誘變方法對紅曲霉進行育種，取得了一些進展[16-18]。

本研究試圖利用實驗室構(gòu)建的紅曲霉T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫[19-20]，經(jīng)過篩選、發(fā)酵、代謝產(chǎn)物檢測等，掌握T-DNA轉(zhuǎn)化子與原始菌株發(fā)酵產(chǎn)物的動態(tài)變化特征，探討這種紅曲霉菌種培育方式在實際生產(chǎn)中的可行性，對開發(fā)利用紅曲霉這一寶貴資源有一定的理論及現(xiàn)實意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化子紫色紅曲霉（Monascus purpureus）Mp-41菌株（簡稱Mp-41菌株），為浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室前期從紅曲米中篩選到的高產(chǎn)紅曲色素的優(yōu)良菌株，作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫構(gòu)建的出發(fā)菌株；T-DNA質(zhì)粒，為含有TrpC高效啟動子的pATMT1質(zhì)粒（圖1），具有卡那霉素和潮霉素抗性基因序列[19]；T-DNA插入Mp-41菌株的紅曲霉轉(zhuǎn)化子983株，作為高產(chǎn)紅曲色素低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選材料。

1.1.2 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值6.0～6.5（用于Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子的常規(guī)培養(yǎng)、活化和保存）。改良PD液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，牛肉膏5 g，水1 000 mL，pH值6.0～6.5（用于轉(zhuǎn)化子搖瓶培養(yǎng)和篩選）。PD液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值6.0～6.5（用于Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子的一級種子、二級種子培養(yǎng)和5 L發(fā)酵罐發(fā)酵）。

1.2 試驗方法

1.2.1 高產(chǎn)紅曲色素、低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選以Mp-41菌株為出發(fā)菌株，利用實驗室建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)（ATMT）紅曲霉轉(zhuǎn)化技術(shù)，構(gòu)建了含有983株轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫[19-20]。

1.2.1.1 菌株的培養(yǎng)將Mp-41菌株和983株轉(zhuǎn)化子分別接種于PDA培養(yǎng)基上活化5 d，用打孔器（孔徑0.8 cm）取3個菌餅接入裝有40 mL改良PD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)發(fā)酵72 h。

1.2.1.2 紅曲色素提取和色價檢測[20]吸取1 mL的發(fā)酵液于5 mL的離心管中，加入2 mL 70%的乙醇，混勻后，調(diào)節(jié)pH值至6.0～7.0。靜置20 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液檢測。以70%乙醇溶液做參比，測定其在505 nm處的OD值。按公式計算：色價（U/mL）＝稀釋倍數(shù)×吸光值。

1.2.1.3 桔霉素含量檢測[11-12]吸取1 mL的發(fā)酵液于5 mL的離心管中，加入2 mL甲醇，混勻后用封口膜封好管口，與磁力攪拌子綁一起，放在60℃的集熱式磁力攪拌器內(nèi)攪拌1h，取出，4℃，3 000 r/min離心15 min；用毛細吸管取上清液點于制好的硅膠板上，用展開劑（甲苯、乙酸乙酯、甲酸的體積比為6∶3∶1）展開，紫外燈下觀察Rf值在0.7～0.8之間的黃綠色條帶即為桔霉素顯色條帶。刮取桔霉素條帶的硅膠加入甲醇溶解，用HPLC定量檢測。

配制梯度濃度的桔霉素標準品用下述色譜條件測定含量并制作標準曲線。Agilent TC-C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈∶甲醇∶水＝70∶10∶20，熒光檢測器（檢測波長λex＝331nm，λem＝500nm），流速為1mL/min，柱溫28℃。得出相關(guān)系數(shù)高的標準曲線后，發(fā)酵上清液用相同的色譜條件測定。

1.2.2 T-DNA插入轉(zhuǎn)化子的檢測按試劑盒說明書操作，提取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的紅曲霉菌絲基因組DNA。設(shè)計潮霉素抗性基因（hygromycin phosphotransferase gene，hph基因）的上下游引物：hph1：5′-ATGCCTGAACTCACCGCGAC-3′；hph2：5′-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3′。引物由上海生工公司合成。常規(guī)PCR的體系和方法擴增hph基因片段，如擴增條帶大小在1 000 bp左右，則證明T-DNA成功插入。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子的5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)物分析將轉(zhuǎn)化子和Mp-41菌株活化后接入裝有150 mL PD種子培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，30℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)3 d，用作一級種子；再取20 mL菌液接種到新的PD種子培養(yǎng)液中相同條件培養(yǎng)3 d，用作二級種子；取150 mL二級種發(fā)酵液接入5L發(fā)酵罐中，30℃，pH值5.0，轉(zhuǎn)速200 r/min條件下進行發(fā)酵。

1.2.3.1 生長曲線的繪制發(fā)酵過程中每隔3 h取樣，測定不同時間點Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子菌絲干質(zhì)量，繪制生長曲線。

菌絲干質(zhì)量的測定：將所得發(fā)酵液過0.177 mm篩網(wǎng)，蒸餾水沖洗菌絲3次，于60℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量后進行稱量。

1.2.3.2 紅曲色素色價的檢測其檢測方法同

1.2.1。

1.2.3.3 桔霉素含量檢測其檢測方法同1.2.1。

1.2.3.4 莫納可林K含量的檢測吸取發(fā)酵液1 mL于1.5 mL的離心管中，用保鮮膜包緊管口，煮沸10 min，在4℃，8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液用高效液相檢測。

色譜條件：AgilentTC-C18液相色譜柱（250mm× 4.6 mm，5 μm），A溶液為乙腈（0.45 μm有機相濾膜過濾），B溶液為pH值2.5的磷酸溶液（0.45 μm水相濾膜過濾）。檢測波長為237nm；流速0.6mL/min；柱溫50℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)紅曲色素、低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選

2.1.1 高產(chǎn)紅曲色素轉(zhuǎn)化子的篩選用分光光度計檢測Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)液紅曲色素色價，篩選獲得了10株紅曲色素高于Mp-41菌株的轉(zhuǎn)化子，其中，轉(zhuǎn)化子35，62，552等紅曲色素色價顯著高于Mp-41菌株，62號轉(zhuǎn)化子紅曲色素色價達95.4 U/mL，是Mp-41菌株的1.88倍（表1）。

2.1.2 低產(chǎn)桔霉素轉(zhuǎn)化子的篩選利用甲醇浸提紅曲霉轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液（包括菌絲）中桔霉素，通過薄板層析法，在254 nm紫外光下觀察桔霉素條帶的明暗程度（圖2），初步判別各轉(zhuǎn)化子桔霉素含量的高低；再將桔霉素?zé)晒鈼l帶刮下用甲醇溶解，用HPLC精確檢測桔霉素含量（表1、圖2）。

表1 10株紅曲色素色價提高的轉(zhuǎn)化子與桔霉素含量

結(jié)果表明，上述10株轉(zhuǎn)化子中35，62，346桔霉素含量相對較低，分別是原始Mp-41菌株的0.61，0.28，0.65倍；97，552桔霉素含量相對較高。綜合各轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液中紅曲色素色價和桔霉素含量，最終選定轉(zhuǎn)化子62作為目的菌株進行5L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)物分析。

2.2 轉(zhuǎn)化子62潮霉素抗性基因PCR驗證

將Mp-41菌株和轉(zhuǎn)化子62基因組DNA用引物hph1和hph2進行PCR擴增，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子62在1 106 bp處有清晰條帶，片段大小與預(yù)期的hph基因片段長度吻合，而Mp-41菌株沒有擴增出相應(yīng)的條帶，表明T-DNA已經(jīng)成功插入到轉(zhuǎn)化子62基因組DNA中（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)化子62發(fā)酵罐（5 L）發(fā)酵特征和產(chǎn)物的檢測

2.3.1 生長曲線每隔4 h取樣一次，測定不同發(fā)酵時間點Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子62菌絲干質(zhì)量，繪制生長曲線如圖4所示。Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子62的生長曲線變化規(guī)律基本類似。在0～24 h為延滯期；28～68 h為對數(shù)生長期；64～100 h處于穩(wěn)定生長期；100 h以后進入衰亡期。轉(zhuǎn)化子62生長速度相對較快，菌絲最大干質(zhì)量為81.7 g/L，Mp-41菌株為64.4 g/L，轉(zhuǎn)化子62菌絲量為Mp-41菌株的127%。

2.3.2 紅曲色素色價隨發(fā)酵時間的變化每隔4 h取樣一次，浸提發(fā)酵液中的紅曲色素，分光光度法測定吸光值，計算相應(yīng)紅曲色素色價，Mp-41菌株與轉(zhuǎn)化子62色素色價隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律基本相似（圖5）。0～36 h這2個菌株紅曲色素色價均較低，但在40 h后轉(zhuǎn)化子62紅曲色素色價開始高于Mp-41菌株；40～80 h這2個菌株的紅曲色素均快速增長，100 h左右，色素含量增長趨于平緩。轉(zhuǎn)化子62最高色價達120.76 U/mL，是Mp-41菌株（最高色價為80.61 U/mL）的149.81%（約1.5倍）。

2.3.3 桔霉素含量隨發(fā)酵時間的變化桔霉素含量隨發(fā)酵時間的變化曲線如圖6所示。轉(zhuǎn)化子62桔霉素最高含量為1.172 4 mg/L，僅為Mp-41菌株（最高含量為3.342 2 mg/L）的35.08%。

2.3.4 莫納可林K含量隨發(fā)酵時間的變化莫納可林K的產(chǎn)生隨發(fā)酵時間的變化曲線如圖7所示。轉(zhuǎn)化子62發(fā)酵液中莫納可林K的最大含量為63.72 mg/L，是Mp-41菌株（最大含量為52.59 mg/L）的121.16%。

3 討論與結(jié)論

通過篩選實驗室構(gòu)建的983株的T-DNA插入轉(zhuǎn)化子庫，獲得1株編號為62紅曲霉轉(zhuǎn)化子，從搖瓶、發(fā)酵罐發(fā)酵的生長及代謝產(chǎn)物動態(tài)變化可以看出，轉(zhuǎn)化子62紅曲色素產(chǎn)量穩(wěn)定高于原始Mp-41菌株，而桔霉素穩(wěn)定低于原始Mp-41菌株。

轉(zhuǎn)化子62搖瓶中紅曲色素色價為95.4 U/mL，5 L發(fā)酵罐中紅曲色素色價和桔霉素含量分別為120.76 U/mL，1.172 4 mg/L；紅曲色素色價是原始Mp-41菌株的1.5倍，桔霉素僅為原始Mp-41菌株的35.08%；轉(zhuǎn)化子62的其他有益代謝產(chǎn)物如莫納可林K也高于原始Mp-41菌株，為63.72 mg/L，是原始Mp-41菌株的121.16%；生長速度相對較快，菌絲生長量高于原始Mp-41菌株。表明利用ATMT法培育的轉(zhuǎn)化子62性狀優(yōu)于原始Mp-41菌株，并能穩(wěn)定遺傳，用T-DNA插入突變的方法對紅曲霉進行育種是可行的。

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Screening Monascus Ttransformant of Higher Yield Monascus Pigment with Lower Citrinin and Its Fermented Products Analysis

XUChu-xuan，RENHao，ZHANGTing，F(xiàn)ENGQing-qing，WUQiao-yu，JIANGDong-hua
（College ofChemistryand Life Science，ZhejiangNormal University，Jinhua 321004，China）

The Monascus purpureus strain Mp-41 isolated from red yeast rice was used as the original strain for transformation. T-DNA insertion mutation library of M.purpureus strain Mp-41 which contained 983 transformants was established by Agrobacterium fumefaciens-mediated transformation（ATMT）technology.When all transformants incubated in improved PD broths,the fermentation broths were analyzed for production of Monascus pigment and citrinin by using UV visible spectrophotometer and HPLC.10 transformants were found the yield ofMonascus pigment significant higher than that oforiginal strain Mp-41.The production ofMonascus pigment by transformant strain 62（95.4 U/mL）was 1.88 higher than that of the original strain Mp-41（50.7 U/mL）,and the yield of citrinin was lower than that of strain Mp-41 stably.Timing sampling and analysis by HPLC for fermentation broth by original strain Mp-41 and transformant 62 in 5 L fermenter,it indicated that the growth rate of transformant 62 was faster than original strain Mp-41, the production ofMonascus pigment,Monacolin Kwere 120.76 U/mL,63.72 mg/L,higher（1.5 and 1.21 times）than that oforiginal strain Mp-41,the yield of citrinin was 1.172 4 mg/L,lower（only 35.08%）than original strain Mp-41 respectively.As a result,breeding Monascus strain by the way of ATMT could generate into stably heredity,the protection and application of Monascus resource had a certain potential.

Monascus purpureus;Monascus pigment;citrinin;fermentation;T-DNA

Q785

A

1002-2481（2016）03-0318-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.12

2015-11-19

國家自然科學(xué)基金項目（31270061；31570013）

許楚旋（1996-），女，浙江金華人，在校學(xué)生，研究方向：應(yīng)用微生物。蔣冬花為通信作者。