騰軍偉，鄭喆，梅雪洋，付琦潔，張健，楊貞耐

(北京工商大學(xué),北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心, 北京,100048)

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的生產(chǎn)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

騰軍偉，鄭喆，梅雪洋，付琦潔，張健，楊貞耐*

(北京工商大學(xué),北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心, 北京,100048)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的工藝條件：發(fā)酵溫度35 ℃，裝液量40%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時(shí)間84 h。在此優(yōu)化條件下，獲得的凝乳酶凝乳活力為558.14 Su/mL。進(jìn)一步研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)，凝乳酶最適反應(yīng)溫度為55 ℃，酶活力在25～45 ℃比較穩(wěn)定，60 ℃保持50 min完全失活。在pH5.5時(shí)凝乳酶活力最高，在pH 5.5～7.0范圍內(nèi)，隨著pH增大，凝乳酶活力逐漸下降，pH 6.5時(shí)，凝乳酶活力穩(wěn)定性最高。Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+以及Al3+均對(duì)凝乳酶的凝乳活力有促進(jìn)作用，其中Ca2+對(duì)凝乳活力的促進(jìn)作用最為顯著，且Ca2+濃度為0.020 mol/L時(shí)凝乳酶的凝乳活力達(dá)到最大值，而Na+、K+和Cu2+對(duì)凝乳活力均有抑制作用；凝乳酶Km為2.35 g/L，Vmax=1.18 U/mL。

解淀粉芽孢桿菌；凝乳酶；正交試驗(yàn)；酶學(xué)性質(zhì)

凝乳酶是制作干酪時(shí)添加于原料乳中起凝乳作用的必需酶[1],其凝乳特性及蛋白水解活力會(huì)最終影響干酪的得率、風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)[2-4]。傳統(tǒng)的凝乳酶來源于未斷奶的牛犢皺胃。隨著世界干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,傳統(tǒng)凝乳酶的供應(yīng)已出現(xiàn)世界性短缺。為此，國內(nèi)外研究者進(jìn)行了大量的研究以開發(fā)不同來源的凝乳酶。微生物生產(chǎn)凝乳酶具有周期短、產(chǎn)量高、提取方便、成本低、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn)，是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ哪閯5-7]。

宮廷奶酪是我國的一種傳統(tǒng)乳酪產(chǎn)品，由江米酒凝固牛乳制作而成，口感細(xì)膩，具有良好的乳膠體穩(wěn)定性。其制作過程中江米酒的凝乳作用主要與其中的凝乳酶有關(guān)[8-9]；該酶是江米酒發(fā)酵劑酒曲中微生物發(fā)酵代謝的產(chǎn)物[10-11]。江米酒是一種傳統(tǒng)安全食品,采用其中篩選得到的菌株進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶，無須考慮非酶類代謝產(chǎn)物的安全性問題[12-13]。雖然細(xì)菌是酒曲中主要菌系組成之一，但國內(nèi)尚無從酒曲中篩選高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究前期從甜酒曲中篩選得到1株產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，菌株編號(hào)為GSBa-1。本文通過對(duì)解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶條件的優(yōu)化，利用乙醇分級(jí)沉淀制取凝乳酶，并研究了不同因素對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)的影響，驗(yàn)證了該凝乳酶在干酪加工的潛在應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研究開發(fā)食用安全的干酪加工用細(xì)菌凝乳酶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離純化并于-70 ℃冷凍保藏?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(LB)：酵母提取物5 g/L，胰蛋白酶10 g/L，NaCl 10 g/L。脫脂乳粉,澳大利亞進(jìn)口；酪蛋白,SIGMA公司；試驗(yàn)試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS 12恒溫水浴加熱鍋,上海一恒科學(xué)實(shí)驗(yàn)裝備有限公司；HZQ-Q 氣浴恒溫?fù)u床,哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司；高速離心機(jī)CR21GⅢ,日本日立有限公司；分光光度計(jì)U-3900,日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)4因素3水平(表1)共9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)(表2)，研究解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的最佳條件。其中1、2、3分別代表自變量的低、中、高水平，測定每組實(shí)驗(yàn)得到的發(fā)酵液凝乳酶活力。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.2 菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

基礎(chǔ)發(fā)酵LB液體培養(yǎng)基按不同裝液量分裝于100 mL三角瓶中，于121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫；把解淀粉芽孢桿菌GSBa-1甘油管種子(-70 ℃保存)室溫下融化，按體積分?jǐn)?shù)3%(v/v)接種到30 mL已滅菌的 LB液體培養(yǎng)基中，搖勻培養(yǎng)14 h作為活化種子液；種子液按體積分?jǐn)?shù)3%(v/v)接種到LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基中搖勻，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素(溫度、時(shí)間、轉(zhuǎn)速)于搖床中水平發(fā)酵。發(fā)酵完成后將發(fā)酵液于10 000 r/min離心30 min，取上清液，于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.3 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的提取

向4 ℃的粗酶液中加入預(yù)冷的無水乙醇，使混合后的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，離心后取上清繼續(xù)加入無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，迅速攪拌均勻，于4 ℃冰箱中靜置過夜，10 000 r/min 離心30 min，離心溫度4 ℃，收集沉淀，沉淀用0.005 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解，用透析袋(8 000～14 000 Da)于4 ℃條件下透析48 h，之后冷凍干燥成凝乳酶凍干粉，于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.4 凝乳酶活力(milk-clotting activity, MCA)的測定

活力測定根據(jù)改進(jìn)的MAGDA[14]方法，將脫脂乳粉溶于0.01 mol/L的CaCI2溶液配制成10%的脫脂乳溶液，室溫放置30 min；于35 ℃中保溫5 min，35 ℃下，準(zhǔn)確量取待測酶液0.2 mL加入2 mL 10%的脫脂乳溶液中，迅速混勻，開始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確記錄至絮狀凝集顆粒出現(xiàn)為止。凝乳酶活力的定義：在40 min內(nèi)凝固100 g/L的脫脂乳1 mL所要的凝乳酶量規(guī)定是1個(gè)索氏單位(Soxhelt unit，Su)，計(jì)算公式見式(1)：

(1)

式中：MCA為發(fā)酵液酶活力，Su/mL；T為凝乳時(shí)間，s； D為酶液稀釋倍數(shù)。

式中：A為所測的凝乳酶活力,Su/mL；A0為對(duì)照的凝乳酶活力,Su/mL。

1.3.5 蛋白水解活力(proteolyticactivity,PA)測定方法[15]

取2mL1.5%酪蛋白溶液于35 ℃保溫5min，加入0.5mL預(yù)熱好的待測酶液混勻后繼續(xù)水浴恒溫放置60min，然后加入2mL8%的三氯乙酸終止反應(yīng)，將沉淀過濾出去測定濾液在280nm處的吸光度A280。制備空白樣品時(shí)，先取0.5mL待測酶液直接與8%的三氯乙酸混合，使其立刻終止反應(yīng)，后加入2mL1.5%酪蛋白溶液，重復(fù)過濾步驟，濾液作為空白對(duì)照，測定其在280nm處的吸光度A280＇。

本實(shí)驗(yàn)條件下,60min引起A280增加0.001單位所需的酶量為1個(gè)酶活力單位，計(jì)算公式見式(2)：

1mL酶液的蛋白水解活力(U/mL)=2(A280-A280＇)

(2)

1.4 不同因素對(duì)凝乳酶的影響

1.4.1 溫度對(duì)凝乳酶活力的影響

分別在25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃測定凝乳酶的凝乳活力和蛋白水解活力,重復(fù)3次。將55 ℃時(shí)測定的MCA和C/P值(即酶的凝乳活力與蛋白水解活力的比值)定義為100%,分別計(jì)不同溫度條件下凝乳酶的相對(duì)酶活力和C/P值。

1.4.2 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

將酶液分裝于試管中,分別在25、30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴中溫育60min,在此期間，每隔10min取樣,迅速冷卻。在35 ℃條件下測定殘余凝乳酶的活性,重復(fù)3次。將未處理酶液的酶活力定義為100%,分別計(jì)算不同溫度條件下凝乳酶的相對(duì)酶活力。

1.4.3pH值對(duì)凝乳酶活力的影響

將酶液以及10%的脫脂乳用0.1mol/LHCI溶液和0.1mol/LNaOH溶液分別調(diào)pH值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,分別測定凝乳酶凝乳活力和蛋白水解活力，重復(fù)3次。將pH5.5條件下測定的MCA和C/P值定義為100%，分別計(jì)算不同值條件下凝乳酶的相對(duì)酶活力和C/P值。

1.4.4 凝乳酶的pH穩(wěn)定性

用0.1mol/LHCI溶液和0.1mol/LNaOH溶液將酶液的pH調(diào)到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5,在4 ℃下放置1h后,再用0.1mol/LHCl和0.1mol/LNaOH將酶液的pH值統(tǒng)一調(diào)至6.5,在35 ℃下測定凝乳酶的殘余酶活,重復(fù)3次。將最高酶活力定義為100%，分別計(jì)算不同pH值條件下凝乳酶的相對(duì)酶活力。

1.4.5 金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響

在脫脂乳和1.5%的酪蛋白中，分別添加NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2、ZnCl2、CuCl2FeCl2、AlCl3，使其濃度為5mmol/L，在35 ℃條件下分別測定凝乳酶的凝乳活力和蛋白水解活力，設(shè)定以不添加金屬離子的底物溶液(空白對(duì)照)測定的酶活力和C/P值為100%，分別計(jì)算不同條件下凝乳酶的相對(duì)酶活力和C/P值。

1.4.6Ca2+濃度對(duì)凝乳酶活力的影響

在脫脂乳中添加CaCl2，使其濃度分別為0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030、0.035、0.040、0.045、0.050mol/L，于35 ℃下測定凝乳酶的凝乳活力,重復(fù)3次。將最高酶活力定義為100%，分別計(jì)算不同條件下凝乳酶的相對(duì)酶活力。

1.4.7 酶動(dòng)力學(xué)特性研究

1.4.7.1 酪蛋白底物濃度對(duì)凝乳酶活力的影響

分別配制0、2、4、6、8、10、12、14、16、18g/L的酪蛋白底物濃度，按照1.3.5蛋白酶活性測定方法，測得凝乳酶蛋白水解活性。

1.4.7.2 米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率的測定

分別將不同酪蛋白底物濃度下測得的蛋白水解活力與底物濃度取倒數(shù)作圖，求米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的生產(chǎn)[16-18]

本研究采用4因素3水平的試驗(yàn)即選用L9(34)正交表來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶條件。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，4個(gè)因素對(duì)解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶凝乳活力的影響大小依次為溫度>裝液量>搖床轉(zhuǎn)速>發(fā)酵時(shí)間。由k值大小可知各因素選取水平及最優(yōu)組合為A2B2C3D3，即發(fā)酵溫度35 ℃，裝液量40%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時(shí)間84 h。根據(jù)最優(yōu)組合條件，得到解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶凝乳活力為558.14 Su/mL，高于試驗(yàn)組5(試驗(yàn)組最高)的凝乳活力533.33 Su/mL，且結(jié)果重復(fù)性好。由此優(yōu)化發(fā)酵條件下，采用乙醇分級(jí)沉淀制備獲得的凝乳酶用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)的研究。

2.2 不同因素對(duì)解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶酶學(xué)性質(zhì)的影響

2.2.1 溫度對(duì)酶活力的影響

由圖1可知，當(dāng)溫度低于25 ℃時(shí)，酶反應(yīng)進(jìn)行較慢，相對(duì)酶活力較低。在25～55 ℃，隨著反應(yīng)溫度的上升，凝乳酶相對(duì)活力逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)凝乳酶相對(duì)活力達(dá)到最大值；當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)，相對(duì)酶活力下降明顯，到65 ℃時(shí)凝乳酶完全失活。因此該酶的最適凝乳溫度為55 ℃。韋薇等報(bào)道，小牛凝乳酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃[19]。從米黑毛霉菌中得到的凝乳酶的最適溫度為60 ℃[20]，高于該酶的最適溫度。本實(shí)驗(yàn)條件下，溫度對(duì)凝乳酶的C/P值影響與酶活力的影響趨勢一致, 凝乳酶的C/P值也在55 ℃時(shí)達(dá)到最大。

圖1 溫度對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

在實(shí)際干酪加工中，干酪的苦味和其他不良風(fēng)味大多是由凝乳酶的蛋白水解力較強(qiáng)降解酪蛋白產(chǎn)生的苦味肽物質(zhì)所致[8]。因此蛋白水解活力低的凝乳酶，即C/P比值高的酶更適用于干酪加工中良好風(fēng)味的形成。

2.2.2 酶的熱穩(wěn)定性

由圖2所示，凝乳酶在25～45 ℃有較好的熱穩(wěn)定性，此溫度區(qū)間溫育60 min后，均保持較高的相對(duì)酶活力。但繼續(xù)升高溫度，當(dāng)達(dá)到50℃時(shí)保持40 min后，相對(duì)酶活力明顯降低；當(dāng)溫度上升到55℃時(shí)，保持20 min后，相對(duì)酶活力持續(xù)性顯著損失，60 min后殘留的相對(duì)酶活力為40.77%；當(dāng)溫度為60 ℃保持20 min，殘留的酶活只剩33.46%，保持50 min后酶活力完全喪失。韋薇等[19]報(bào)道的小牛凝乳酶 55 ℃保溫90 min，相對(duì)酶活力為 36.7%；60 ℃保持60 min酶完全失活。KUMAR等[21]發(fā)現(xiàn)Rhizopusoryzae凝乳酶60 ℃保持20 min，相對(duì)酶活力仍為48%。說明該凝乳酶的熱穩(wěn)定性低于小牛和Rhizopusoryzae兩種凝乳酶。由于在干酪加工時(shí)需經(jīng)過凝乳酶的滅酶環(huán)節(jié)(大約50 ℃)[22]，以減少殘留的凝乳酶作用產(chǎn)生苦味肽物質(zhì)，因此該凝乳酶在干酪制作時(shí)有一定優(yōu)勢。

圖2 凝乳酶的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability ofthe rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.3 pH值對(duì)酶活力的影響

在實(shí)驗(yàn)條件下，當(dāng)脫脂乳的pH調(diào)至5.0時(shí)，脫脂乳呈現(xiàn)出凝集狀態(tài)，因而無法測定凝乳活力。從圖3可以看出，凝乳酶在pH 5.5時(shí)，表現(xiàn)出最高的凝乳活力和C/P值；此后在pH為5.5～7.0之間，隨著pH的增大，相對(duì)凝乳酶活力和相對(duì)C/P值逐漸減小，當(dāng)pH 7.5時(shí)酶活力完全喪失。據(jù)文獻(xiàn)[23]報(bào)道，毛霉菌Mucorbaciliformis產(chǎn)生的凝乳酶在pH值5.5時(shí)表現(xiàn)出最大的凝乳活力，與本結(jié)果一致。

圖3 pH對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.4 酶的pH穩(wěn)定性

由圖4所示，隨著pH升高相對(duì)凝乳酶活力逐漸增大，在pH6.5時(shí)，該凝乳酶相對(duì)酶活力達(dá)到最大值即凝乳酶活力穩(wěn)定性最好；此后繼續(xù)升高pH，凝乳酶相對(duì)酶活力逐漸減小，當(dāng)pH為8.5時(shí)，相對(duì)酶活力只剩38.32%。有研究表明在中性或弱堿性條件下，凝乳酶的凝乳活力會(huì)顯著損失，可能在這種條件下凝乳酶的構(gòu)象發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的變化[24]。還有文獻(xiàn)指出，因?yàn)閜H對(duì)酶促凝乳的機(jī)理是復(fù)雜的，它不僅影響酶的穩(wěn)定性而且影響酶的活性中心必需基團(tuán)的解離程度、空間結(jié)構(gòu)和底物的解離狀態(tài)[25]。

圖4 凝乳酶的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+以及Al3+均對(duì)凝乳酶的凝乳活力有促進(jìn)作用，同時(shí)使C/P值也有不同程度的升值，其中添加Ca2+的作用最為明顯，為空白對(duì)照的1.57倍。而Na+、K+、Cu2+對(duì)凝乳酶的凝乳活力和C/P值均有抑制作用。

圖5 金屬離子對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.5 Effect of metal ions on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

一般認(rèn)為，由于Ca2+可與H+之間進(jìn)行交換從而降低了底物的pH值，間接加快了酶促反應(yīng)的速率。由于Ca2+可與酪蛋白膠束中的膠體磷酸鈣進(jìn)行離子交換，使κ-酪蛋白膠束的表面電荷進(jìn)一步減少，使膠束間的空間排斥力減小，導(dǎo)致大量的膠束互相靠近而凝聚，形成了交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。凝乳酶的來源不同，金屬離子也會(huì)對(duì)凝乳作用有不同的影響。吳進(jìn)菊等[26]報(bào)道，Ca2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、K+和Mg2+對(duì)根霉F34凝乳酶活力具有促進(jìn)作用，而Na+和Cu2+具有明顯的抑制作用。李玉秋[27]等研究表明，Ni2+和Fe2+對(duì)重組微小毛霉凝乳酶有抑制作用，Cu2+對(duì)凝乳酶活力沒有影響。在干酪加工過程中，鹽類一般具有防腐作用，并能增加干酪的功能性和感官效果，因此選擇合適種類的鹽類可以達(dá)到最佳的凝乳效果。

2.2.6 Ca2+離子濃度對(duì)酶活力的影響

由圖6可知，隨著Ca2+濃度增大，凝乳酶相對(duì)酶活力逐漸增大；當(dāng)Ca2+濃度為0.020 mol/L時(shí)，相對(duì)酶活力達(dá)到最大值；此后繼續(xù)增加Ca2+濃度，相對(duì)酶活力持續(xù)降低。因此，解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的最適Ca2+濃度為0.020 mol/L。當(dāng)Ca2+濃度為0.020 mol/L時(shí)凝乳速度最快，凝固效果也最好，對(duì)凝乳酶凝乳活力的促進(jìn)作用也最為顯著。因此在乳中添加適量的CaCl2以促進(jìn)乳凝固，這也是西式干酪制作時(shí)添加的CaCl2原因，但CaCl2添加量不宜過大，否則會(huì)影響干酪的硬度、口感和風(fēng)味。

圖6 CaCl2對(duì)凝乳酶活力的影響Fig.6 Effect of CaCl2 on the activity of the rennet from B. amyloliquefaciens GSBa-1

2.2.7 酶動(dòng)力學(xué)特性研究

2.2.7.1 底物濃度對(duì)酶活力的影響

由圖7可以看出，隨著底物濃度增大,凝乳酶對(duì)酪蛋白水解活性逐漸增大,當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮? g/L時(shí),隨底物濃度增加,反應(yīng)速度迅速隨之增大；當(dāng)?shù)孜餄舛却笥? g/L時(shí),反應(yīng)速度趨于穩(wěn)定,繼續(xù)增大底物濃度,反應(yīng)速度幾乎不受底物濃度的影響,這一結(jié)果符合米氏規(guī)律。

2.2.7.2 米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率的測定

圖8 底物濃度倒數(shù)與酶活性倒數(shù)關(guān)系圖Fig.8 Relationship between the reciprocal of substrate concentration and the reciprocal of enzyme activity

由圖8可知，X軸上的截距即為-1/Km，Y軸上的截距即為1/Vmax，根據(jù)方程式求得Km=2.35 g/L，Vmax=1.18 U/mL。Km值是反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位與底物濃度的單位一樣，是衡量酶與底物親和力大小的一個(gè)指標(biāo)，從Km值的大小可以評(píng)價(jià)反應(yīng)達(dá)到飽和的速度快慢。由于凝乳酶酶促凝乳作用并非簡單的酶學(xué)反應(yīng),因而無法直接用牛乳作為底物測定其Km，因此,在研究凝乳酶動(dòng)力學(xué)特性時(shí),通常選擇酪蛋白或血紅蛋白作為底物,以蛋白水解活性為指標(biāo)進(jìn)行研究[28]。高維東等[1]研究表明，微小毛霉凝乳酶的Km=0.023 8 mol/L，Vmax=1.122 7 mg/min。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，Km值較小，該凝乳酶酶解酪蛋白活性容易達(dá)到飽和，即在較高的底物濃度時(shí)，該凝乳酶對(duì)酪蛋白水解速度較慢，主要表現(xiàn)凝乳作用，從前面研究結(jié)果也能得出該凝乳酶具有較高的C/P值，這正是干酪生產(chǎn)中所需要的特性。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)1株分離自酒曲的高產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌GSBa-1菌株，獲得其產(chǎn)凝乳酶的最佳條件為發(fā)酵溫度35 ℃，裝液量40%，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時(shí)間84 h。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下菌株產(chǎn)凝乳酶活力為558.14 Su/mL。解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃，在25～45 ℃之間酶活性穩(wěn)定性較好。酶的最適反應(yīng)pH為5.5，在pH<7.0之間，隨著pH的增大，凝乳酶活力逐漸降低；當(dāng)pH>7.0時(shí)，凝乳酶活力完全失活。在pH6.5時(shí)，凝乳酶活力保持最為穩(wěn)定。金屬離子對(duì)凝乳酶活性的影響研究顯示，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+以及Al3+均對(duì)凝乳酶的凝乳活力有促進(jìn)作用，其中Ca2+對(duì)凝乳活力的促進(jìn)作用最為顯著，而Na+、K+和Cu2+對(duì)凝乳活力有抑制作用。酶水解酪蛋白底物的最大反應(yīng)速度為1.18 U/mL，米氏常數(shù)為2.35 g/L。上述研究表明解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶具有較高的凝乳活力和C/P比值，可作為傳統(tǒng)牛凝乳酶的替代品，具有潛在干酪生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

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Production of rennet byBacillusamyloliquefaciensGSBa-1 and its enzymological characteristics

TENG Jun-wei, ZHENG Zhe, MEI Xue-yang, FU Qi-jie, ZHANG Jian, YANG Zhen-nai*

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, Beijing Technology & Business University (BTBU)，Beijing 100048, China)

In this paper, fermentation conditions for the rennet production fromBacillusamyloliquefaciensGSBa-1 were optimized by the orthogonal experimental design method. The optimal conditions were as follows: fermentation temperature of 35 ℃, liquid loading volume of 40%, shaking speed of 160 r/min, fermentation time of 84 h. The milk-clotting activity of the enzyme produced under the optimal condition was 558.14 Su/mL. The rennet fromBacillusamyloliquefaciensGSBa-1 was prepared and further studies were carried out on factors affecting enzymological characteristics of the rennet. Results showed that the optimum reaction temperature was 55 ℃, the enzyme activity was stable between 25-45 ℃, and incubation at 60 ℃ for 50 min resulted in complete loss of enzyme activity. The rennet presented the highest enzymatic activity at pH5.5, then it gradually decreased with the increase of pH from 5.5 to 7.0, and the enzyme activity of rennet was the most stable at pH 6.5. The rennet activity was positively affected by Ca2+, Mg2+, Fe2+, Zn2+and Al3+, of which Ca2+showed the most significant promoting effect, and the milk-clotting activity reached maximum at Ca2+concentration of 0.02 mol/L, while Na+, K+and Cu2+showed inhibition effect on the milk-clotting activity. ThekmandVmaxof the enzyme were 2.35 g/L and 1.18 U/mL, respectively.

Bacillusamyloliquefaciens; rennet; orthogonal experimental design method; enzymological characteristics

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201612015

碩士研究生(楊貞耐教授為通訊作者，E-mail：yangzhennai@th.btbu.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31371804)；北京市百千萬人才工程資助項(xiàng)目(B類)；2016年北京工商大學(xué)研究生科研能力提升計(jì)劃項(xiàng)目

2016-06-30，改回日期：2016-08-08