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成纖維細胞13因子作用于鈉通道1.7選擇性調(diào)控熱痛

當前關于傷害性熱痛的認識主要局限于溫度感受器，如表達在背根神經(jīng)節(jié)（DRG）傷害性感覺神經(jīng)元上的瞬時受體電位陽離子通道(TRPV1)。但是溫度感受器的缺失僅部分地影響熱痛，表明熱痛的產(chǎn)生和調(diào)控還存在未知機制。我們發(fā)現(xiàn)在小鼠DRG神經(jīng)元中條件性敲除胞漿型成纖維細胞13因子(FGF)，導致熱痛選擇性缺失；敲除了FGF13的DRG神經(jīng)元，傷害性熱刺激不能誘發(fā)動作電位的持續(xù)發(fā)放；FGF13與鈉通道(Nav) 1.7作用可以促進熱痛的傳導，增強傷害性熱刺激誘發(fā)的Nav1.7電流并維持Nav1.7上膜過程，進而維持動作電位的持續(xù)發(fā)放。打破FGF13 和Nav1.7相互作用抑制了熱刺激誘發(fā)的動作電位和痛反射行為。因此，不同于溫度感受器，F(xiàn)GF13 和Nav1.7的相互作用對于維持熱痛信號的產(chǎn)生和傳遞是至關重要的。

研究背景

FGF分為外泌型和胞漿型，外泌型FGF在神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，但對胞漿型FGF功能的研究卻很少。FGF13是表達在神經(jīng)系統(tǒng)中的胞漿型因子，在發(fā)育過程中的腦皮質(zhì)神經(jīng)元上有瞬時表達；在從發(fā)育早期到成年DRG中，F(xiàn)GF13一直高水平表達，其主要有兩個剪接體亞型，F(xiàn)GF13A具有核定位信號而入核，而FGF13B只分布在細胞漿中。

傷害性（疼痛）信號的傳導需要有相應的膜蛋白參與，如當溫度高于42℃時，DRG小神經(jīng)元上表達的TRPV1就發(fā)揮著溫度感受器的作用。但是，即便是TRPV1基因敲除鼠，當給予高于52℃的強熱刺激時，痛反應也只表現(xiàn)出部分減弱；當刺激溫度低于48℃時，痛反應則表現(xiàn)正常。表明還存在其他沒有被發(fā)現(xiàn)的熱痛感受機制。

疼痛信號的傳導也需要電壓門控鈉通道(Nav)的參與，Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9都表達在DRG神經(jīng)元中，其中河豚毒素敏感型（TTX-S）Nav1.7通道對痛覺的產(chǎn)生和傳遞尤為重要。臨床上發(fā)現(xiàn)， 功能增強型Nav1. 7基因突變導致嚴重的熱痛敏，功能喪失型Nav1.7基因突變導致完全感受不到疼痛。全身敲除Nav1.7減弱了完全弗氏佐劑（CFA）誘發(fā)的小鼠熱痛敏；在DRG神經(jīng)元中條件性敲除Nav1.7后，急性痛、炎性痛和燒燙傷引起的熱痛敏受到了影響。有研究認為胞漿型FGF可以與Nav通道相互作用并調(diào)節(jié)鈉通道的開關及其電流強度，但表達在DRG小神經(jīng)元上的FGF13在軀體感覺中的功能卻不清楚。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)條件性敲除DRG神經(jīng)元中的FGF13導致熱痛的選擇性缺失并降低了熱刺激誘發(fā)的神經(jīng)元動作電位發(fā)放強度；還發(fā)現(xiàn)FGF13與Nav1.7相互作用，熱刺激增強了二者的相互作用和Nav1.7在膜上的停留時間，并增強了熱刺激所誘發(fā)的動作電位發(fā)放。打破二者的相互作用，會減少熱刺激所誘發(fā)的動作電位并抑制痛反應。

主要研究結(jié)果

1. FGF13表達在機械/熱傷害性神經(jīng)元中

在成年小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)GF13在DRG中高表達，主要表達在小神經(jīng)元上，在肽類和非肽類神經(jīng)元上都有表達；在脊髓背角的I層和II層、來自DRG的傳入神經(jīng)纖維上也有FGF13表達，同時在坐骨神經(jīng)上和皮膚無毛區(qū)的傳出纖維中也發(fā)現(xiàn)有FGF13表達。

2. FGF13缺失可以選擇性地消除熱痛

在Nav1.8基因啟動的SNS-cre條件性敲除FGF13（CKO）的小鼠，DRG神經(jīng)元、脊髓背角中的傳入纖維和皮膚傳出纖維上表達的FGF13均顯著減少；而DRG神經(jīng)元的總數(shù)和形態(tài)以及它們向中樞投射的神經(jīng)纖維、脊髓背角中突觸的結(jié)構(gòu)甚或皮膚中的神經(jīng)纖維都沒有明顯變化；從DRG到脊髓神經(jīng)元的突觸傳遞也是正常的。

但是CKO鼠的熱痛反射行為消失了，而對于非傷害性溫度刺激和傷害性機械刺激的反射卻不受影響。CKO鼠在甩尾實驗、熱輻射實驗和熱板實驗中沒有表現(xiàn)出痛反應；在CFA誘發(fā)的慢性炎性痛模型中，表現(xiàn)對傷害性熱刺激不敏感；但是對CFA模型或SNI（坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷）模型誘發(fā)的機械痛敏卻無影響。對冷痛刺激的反應也正常，溫度選擇實驗發(fā)現(xiàn)CKO鼠依然具有能夠分辨不同的溫度的能力；只是它們對熱痛的耐受能力有所增強。福爾馬林實驗發(fā)現(xiàn)CKO鼠也具有雙相的痛反應，只是II相峰出現(xiàn)延后而峰高沒有變化，表明其化學痛只受到了輕微的影響。此外，CKO鼠的運動功能和自主活動功能都表現(xiàn)正常。Nav1.8和TRPV1蛋白在CKO鼠的DRG中明顯升高，表明存在著相關功能基因的代償現(xiàn)象。電生理記錄發(fā)現(xiàn)CKO鼠的DRG中對辣椒素敏感的小神經(jīng)元比例以及辣椒素誘導電流的幅度有所增高。以上結(jié)果表明，盡管CKO鼠存在一定的TRPV1代償性增強，其仍然表現(xiàn)出熱痛的選擇性缺失。

3. 腦功能磁共振成像（fMRI）顯示CKO鼠對熱痛誘發(fā)的腦活動消失

fMRI研究發(fā)現(xiàn)在FGF13未敲除鼠的對側(cè)腦區(qū)存在強烈激活信號，如軀體感覺S1和S2區(qū)、Retrosplenial granular (RSG)和島葉皮質(zhì)、杏仁核(Amygdala)、導水管周圍灰質(zhì)(PAG)，紋狀體（尾狀核和殼核）、海馬的CA1區(qū)、丘腦的內(nèi)側(cè)背核以及束旁核等，而CKO鼠的以上大部分腦區(qū)的痛反射消失。

FGF13未敲除鼠顯示對側(cè)S1區(qū)參與疼痛反射，其他腦區(qū)如Amygdala、S2區(qū)、紋狀體、海馬和島葉等則顯示出雙側(cè)腦區(qū)同等程度激活；而CKO鼠的以上腦區(qū)的激活都減弱。FGF13缺失對Amygdala的影響最大，然后依次是紋狀體、島葉、S2區(qū)和RSG，對S1區(qū)皮層的影響最小。

4. FGF13敲除的DRG神經(jīng)元對傷害性熱刺激產(chǎn)生的動作電位發(fā)放減少

電生理記錄發(fā)現(xiàn)，CKO鼠與FGF13未敲除鼠對傷害性熱刺激敏感的DRG神經(jīng)元數(shù)量相近；在未敲除鼠的小神經(jīng)元，動作電位發(fā)放速率在42℃時開始加速，在43℃時達到最大，并保持在該水平至45℃；CKO鼠小神經(jīng)元的電發(fā)放在溫度升高時逐漸降低，在45℃時趨于停止。在未敲除鼠神經(jīng)元中，動作電位遵循“全或無”規(guī)則、振幅相對均勻統(tǒng)一；而在CKO鼠神經(jīng)元中，動作電位振幅隨著溫度的升高呈現(xiàn)出快速降低。表明雖然CKO的DRG小神經(jīng)元能夠感受到低于42℃的熱刺激，但其對傷害性熱刺激產(chǎn)生動作電位的能力受損。

對比研究發(fā)現(xiàn)，在TRPV1基因敲除鼠盡管一半以上DRG神經(jīng)元喪失了對熱刺激的反應能力，但仍然有相當多數(shù)的神經(jīng)元保持著完整的對熱刺激的敏感性，而FGF13敲除鼠對傷害性熱刺激依舊敏感的DRG神經(jīng)元沒有減少，只是刺激溫度增加到傷害性水平時，其動作電位幅度變小，表明FGF13和TRPV1 通過不同的分子機制參與熱痛的調(diào)控。

5. 給予外源性FGF13可以逆轉(zhuǎn)CKO鼠的熱痛缺失

用表達FGF13B的融合蛋白孵育CKO鼠的DRG神經(jīng)元，可以逆轉(zhuǎn)其對傷害性熱刺激產(chǎn)生的電發(fā)放降低，并改善45℃時的動作電位振幅，表明DRG小神經(jīng)元要保持對傷害性熱刺激產(chǎn)生持續(xù)電發(fā)放的能力，F(xiàn)GF13是必須的。

野生鼠鞘內(nèi)注射FGF13B-TAT融合蛋白后，發(fā)現(xiàn)DRG和脊髓背角中融合蛋白的峰值位于注射后20～60分鐘之間。當CKO鼠鞘內(nèi)注射融合蛋白時，在一段時間內(nèi)可以逆轉(zhuǎn)CKO鼠的熱痛缺失。鞘內(nèi)注射后在DRG和后爪的足底皮膚中都可以檢測到該融合蛋白。以上結(jié)果表明，無論是CKO造成DRG小神經(jīng)元的電發(fā)放降低還是在體的熱痛缺失都可以通過給予外源性FGF13而逆轉(zhuǎn)。

6. FGF13直接作用于Nav1.7蛋白

FGF13和Nav1.7的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF13與Nav1.7相互作用強，與Nav1.6相互作用相對弱。與Nav1.7最強的相互作用出現(xiàn)在FGF13B-TAT融合蛋白注射后的20～60分鐘內(nèi)，這與在CKO鼠鞘內(nèi)給藥進而逆轉(zhuǎn)熱痛缺失的最佳效應時間相一致；而FGF13幾乎不與Nav1.8或Nav1.9發(fā)生作用；沒有檢測到FGF13與TRPV1或TRPV2之間存在明顯的相互作用。分子水平研究發(fā)現(xiàn)FGF13和Nav1.7羧基端存在直接的相互作用，Nav1.7羧基端的1,876-1,896位氨基酸是FGF13的主要結(jié)合位點；對于FGF13，似乎不存在與Nav1.7羧基端相互作用的關鍵結(jié)構(gòu)域，因為只有全長的FGF13才能結(jié)合Nav1.7羧基端。

7. FGF13增加了Nav1.7電流密度

把表達Nav1.7和表達FGF13B的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK293細胞，發(fā)現(xiàn)FGF13B增加了Nav1.7電流密度，沒有形成明顯電壓依賴性的Nav1.7激活偏移；Nav1.7的電壓依賴性失活也沒有發(fā)生變化。在CKO鼠的DRG小神經(jīng)元，F(xiàn)GF13缺失可以使TTX-S鈉電流減小而不影響電壓依賴的Nav通道激活或失活。表明FGF13增加了Nav1.7電流密度，而不影響其激活和失活的電生理特性。

8. 溫度刺激強化了FGF13和 Nav1.7的相互作用，并維持了Nav1.7的上膜

將培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元用熱水浴處理后立即放冰上冷卻，瞬時維持Nav1.7在神經(jīng)元膜上，發(fā)現(xiàn)FGF13未敲除神經(jīng)元膜上的Nav1.7水平在熱處理后沒有發(fā)生變化，而CKO神經(jīng)元膜上的Nav1.7水平卻是降低的。在沒有熱刺激的時候，敲除FGF13不影響Nav1.7的上膜；在FGF13缺失的情況下，傷害性熱刺激誘發(fā)DRG神經(jīng)元Nav1.7上膜減少，表明維持一定數(shù)量的Nav1.7上膜的需要FGF13的存在。

9. 打破FGF13和Nav1.7相互作用可以減輕熱痛

可透膜的Nav1.7CT-TAT融合蛋白作為競爭性肽可以競爭性阻斷內(nèi)源性FGF13和Nav1.7的相互作用。在培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中，Nav1.7CT-TAT能夠競爭性阻斷DRG神經(jīng)元中的內(nèi)源性FGF13和Nav1.7的相互作用。

在甩尾實驗中，腹腔注射Nav1.7CT-TAT呈劑量依賴性地延長了甩尾潛伏期，此效應在最后一次注射后的4～6小時達到高峰；注射后，小鼠脊髓背角傳入纖維中的內(nèi)源性FGF13和Nav1.7相互作用明顯減少，但DRG中的未見減少，可能是由于DRG表達大量的FGF13和Nav1.7競爭性抑制了Nav1.7CT-TAT的作用。

討論

1. FGF13/Nav1.7復合物對于維持熱痛功能是必要的

本研究表明，CKO鼠選擇性喪失了對熱痛的反射能力，但保留對其他模式刺激如非傷害性溫度刺激和傷害性機械刺激的痛反應功能。FGF13缺陷可以迅速終止DRG小神經(jīng)元對溫度高于43℃的熱刺激誘發(fā)的電發(fā)放，表明熱痛的傳遞是選擇性需要FGF13存在的。

TRPV1主要功能在于參與炎癥引起的熱痛敏和部分高溫（＞ 52℃）的熱痛敏，即使CKO鼠DRG神經(jīng)元中TRPV1有代償性增加，熱痛仍然缺失；CKO鼠的DRG熱敏神經(jīng)元數(shù)量并沒有減少，但是刺激溫度達到引起熱痛水平時，動作電位不能持續(xù)發(fā)放，表明FGF13在熱痛中的作用與TRPV1不同。溫度感受器在啟動動作電位后，F(xiàn)GF13/Nav1.7復合體在傷害性溫度刺激期間用來維持電發(fā)放，即充當保持持續(xù)電發(fā)放能力的助推器。低劑量的外源性FGF13足以補救CKO鼠DRG神經(jīng)元的電發(fā)放受損和熱痛缺失，表明這種機制是非常高效的。

2. 熱刺激強化了FGF13和Nav1.7相互作用是Nav1.7參與熱痛調(diào)控的選擇機制之一

Nav1.7對于熱痛和機械痛都很重要，Nav1.7的功能獲得性突變導致病人嚴重的熱痛敏，而失能性突變又導致完全無痛。Nav1.7缺失會導小鼠致急性痛、炎癥或燒傷引起的熱痛敏減輕，Nav1.7還參與了小鼠的機械痛。在所有參與痛覺調(diào)控的鈉通道中，Nav1.7是最重要的。

但小鼠缺乏Nav1.7只表現(xiàn)為部分熱痛喪失，與人類的完全不痛表現(xiàn)不同， 這種差異可能是由于小鼠的其他鈉通道的適應性代償而導致的。CKO鼠熱痛的缺失比Nav1.7基因敲除鼠以及Nav1.7和Nav1.8雙基因敲除鼠的熱痛缺失更嚴重，表明FGF13的功能是不能被代償?shù)?。盡管Nav1.7本身不具有感覺模式的特異性或選擇性，但CKO鼠的熱痛缺失而機械痛正常，表明熱刺激促進的FGF13和Nav1.7相互作用可能是神經(jīng)感受熱痛的選擇性機制。

3. 發(fā)現(xiàn)了傷害性熱刺激特異性激活的腦區(qū)

疼痛是一種涉及感覺和情緒變化的復雜體驗，在已經(jīng)被證明了介導傷害性信息的感覺辨別和情感動機方面的區(qū)域，例如丘腦的內(nèi)側(cè)背核和束旁核以及S1區(qū)、S2區(qū)和島狀皮質(zhì)等，CKO鼠的fMRI信號減弱；CKO鼠的fMRI信號在Amygdala、海馬、尾狀核、和RSG等區(qū)域降低，直接證明了邊緣系統(tǒng)和涉及記憶以及情緒反應的腦區(qū)也參與熱痛信息的處理過程。對傷害性熱刺激反應的弱化在不同的腦區(qū)是不同的，表明FGF13缺陷DRG神經(jīng)元產(chǎn)生的痛覺信號是通過不同的上行傳導通路上傳到不同的腦區(qū)；痛反應信號在調(diào)控痛覺下行通路的關鍵區(qū)域PAG也是減弱的。

4. FGF13在病理感覺障礙中的潛在作用

CKO鼠對來自外周組織炎癥誘導的熱痛敏是缺失的，可能與Nav1.7的在膜上停留時間有關。由于DRG神經(jīng)元中FGF13和Nav1.7在外周神經(jīng)損傷后表達降低，所以我們推測FGF13可能主要參與炎性痛、而不參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。根據(jù)我們的研究結(jié)果，F(xiàn)GF13基因突變的病人可能對熱痛刺激不敏感。因此，測試這些病人的軀體感覺功能將幫助我們理解和認識這些疾病及其病理機制，可能讓醫(yī)生盡早應對來保護病人免受潛在危害。

(Yang L,et al. Neuron, 2017, 22: 806 ～ 821. 王 兵 譯 劉興君 校）

編者按：科學家們一直試圖發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)控某種痛覺的某一類神經(jīng)元（包括初級傷害性感覺神經(jīng)元和脊髓的中間神經(jīng)元或投射神經(jīng)元）或某一特定分子，并期望這樣的神經(jīng)元或分子是存在的。但從節(jié)省能量的角度來看，多模式（Polymodel）神經(jīng)元或分子更符合進化論原則。中國科學院神經(jīng)科學研究所的張旭院士團隊近期的研究成果卻開啟了一個新思路，有這樣一類分子如胞漿型FGF13，通過調(diào)節(jié)多模式分子如Nav1.7，進而調(diào)控某一特定的痛覺如熱痛。就像細胞內(nèi)某一信號通路，位于信號中間的分子總是被激活的（如磷酸化），但導致下游的生物學效應在不同的細胞、甚或不同的條件下可能是完全不同，這取決于最上游的信號是來自于哪一種受體或通道分子，取決于它的開關允許什么樣的信號進入。是的，確實存在這樣的開關分子，那是否還有調(diào)節(jié)機械痛的開關分子呢？我們拭目以待！

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.04.002