選育纖維素乙醇生產(chǎn)的高效產(chǎn)酶工程菌技術(shù)的研究進(jìn)展

閆玉玲， 姚秀清， 張 全， 曹長海

（1. 遼寧石油化工大學(xué)，遼寧 撫順 113001；2. 中國石油化工股份有限公司 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

選育纖維素乙醇生產(chǎn)的高效產(chǎn)酶工程菌技術(shù)的研究進(jìn)展

閆玉玲1， 姚秀清1， 張 全2， 曹長海2

（1. 遼寧石油化工大學(xué)，遼寧 撫順 113001；2. 中國石油化工股份有限公司 撫順石油化工研究院，遼寧 撫順 113001）

綜述了近年來選育高效產(chǎn)纖維素酶工程菌取得的最新理論研究及工藝進(jìn)展，并就復(fù)合理化誘變獲取高效產(chǎn)酶菌，以及利用原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體誘變、基因工程等技術(shù)對(duì)各種產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶菌株進(jìn)行遺傳改造，對(duì)纖維素酶高效產(chǎn)酶工程菌的選育進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，進(jìn)一步展望了選育高產(chǎn)纖維素酶菌株的研究方向。

木質(zhì)纖維素；纖維素酶；菌株；原生質(zhì)體；誘變；融合；基因工程

木質(zhì)纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是一種豐富且廉價(jià)的可再生資源。據(jù)估計(jì)，全球每年綠色植物體通過光合作用產(chǎn)生的干物質(zhì)高達(dá)1.55×1011噸，其中纖維素和半纖維素約占55%[1]。隨著石油、煤等能源的短缺及各種環(huán)境問題的出現(xiàn)，木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源由于其可再生性及環(huán)境友好性等特點(diǎn)受到世界各國研究者的廣泛青睞，成為科學(xué)研究熱點(diǎn)[2]。在美國，生物質(zhì)能源的利用提到了戰(zhàn)略高度，美國能源部提出，到2030年，全美5%的電力、20%的運(yùn)輸燃料以及25%的化學(xué)產(chǎn)品均由生物質(zhì)能源提供[3]。我國也是生物質(zhì)資源最豐富的國家之一，中國至2050年生物質(zhì)資源科技發(fā)展路線圖也提出“大力發(fā)展大規(guī)模商業(yè)化生物質(zhì)能源，至2050年中國要實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源代替30%左右的進(jìn)口石油，逐步實(shí)現(xiàn)由生物質(zhì)資源大國向生物質(zhì)資源強(qiáng)國轉(zhuǎn)變[4]”。

通過生物化學(xué)技術(shù)將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為生物乙醇及丁醇等生物燃料的生產(chǎn)過程在國外已經(jīng)取得良好的成果，然而國內(nèi)影響和制約纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)還遠(yuǎn)未解決，其發(fā)展進(jìn)程還處于產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的初級(jí)階段。降低纖維素酶的生產(chǎn)成本是實(shí)現(xiàn)纖維素乙醇規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵。其中，降低纖維素乙醇生產(chǎn)的成本通過以下三種途徑來實(shí)現(xiàn)：一是通過篩選纖維素酶優(yōu)良生產(chǎn)菌株來實(shí)現(xiàn)；二是通過優(yōu)化產(chǎn)酶發(fā)酵工藝，如同步產(chǎn)酶與酶解及酶的復(fù)配工藝等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)；三是通過優(yōu)化纖維素酶的生產(chǎn)條件提高纖維素酶的產(chǎn)量和活性。本文在綜述了纖維素乙醇生產(chǎn)酶高活力菌株選育技術(shù)的基礎(chǔ)上，就近年來國內(nèi)外提高纖維素酶菌株活力取得的最新理論研究及工藝進(jìn)展進(jìn)行了相關(guān)的評(píng)述。

1 與纖維素酶有關(guān)的微生物

自然界為纖維素酶的來源提供了廣闊的途徑。纖維素酶分步廣泛，在細(xì)菌、真菌、放線菌中都有大量的分布，這三類產(chǎn)纖維素酶微生物性能比較見表1。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真菌中具有降解纖維素能力的微生物有近200種，其中，絲狀真菌是研究最多的纖維素降解類群[5]。真菌纖維素酶產(chǎn)量高，可達(dá)20 g/L以上。真菌主要產(chǎn)生分泌型纖維素酶，且所產(chǎn)真菌纖維素酶呈酸性，對(duì)木質(zhì)纖維素的降解程度高，在纖維素乙醇生產(chǎn)過程中扮演著重要角色。里氏木霉、綠色木霉、黑曲霉等真菌都是最具有代表性的纖維素酶生產(chǎn)菌種。細(xì)菌主要分泌中性或堿性的纖維素酶，且大多為內(nèi)切葡聚糖酶，屬于胞內(nèi)酶，很少能分泌到細(xì)胞外，酶的產(chǎn)量也不高。細(xì)菌纖維素酶作用時(shí)吸附于細(xì)胞壁上，從纖維的表面由外向內(nèi)生長完成降解，降解后的纖維表面呈鋸齒蝕痕。細(xì)菌分泌的纖維素酶的提取和純化難度較大，且大多數(shù)細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶對(duì)結(jié)晶纖維素沒有活性，因此在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的不多。放線菌能容易地降解半纖維素，但是對(duì)纖維素幾乎沒有降解能力。放線菌的纖維素酶的分泌型較少且產(chǎn)量極低，對(duì)天然纖維素的水解作用較弱，因此放線菌很少作為纖維素酶的生產(chǎn)菌。

表1 三類產(chǎn)纖維素酶微生物性能比較

2 高活力產(chǎn)纖維素酶菌株的選育技術(shù)

從自然界中分離純化的野生菌株產(chǎn)纖維素酶的活力較低，酶系不完整，無法直接投入生產(chǎn)。因此，利用各種手段和技術(shù)對(duì)產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行改造以提高酶產(chǎn)量或改變其酶學(xué)性能，是降低纖維素酶生產(chǎn)成本的重要方法。

2.1 理化誘變技術(shù)

2.1.1理化誘變分類

1）常規(guī)理化誘變 是通過物理、化學(xué)或者生物誘變劑處理微生物孢子或細(xì)胞實(shí)現(xiàn)遺傳突變，從而獲得纖維素酶高產(chǎn)突變菌株[6]。

2）復(fù)合理化誘變 在實(shí)際生產(chǎn)中菌株經(jīng)過單因子誘變劑的長期誘變之后易產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”（如菌種生長周期長、孢子量減少、代謝減慢等現(xiàn)象），采用多種誘變劑復(fù)合或者交叉處理的方法進(jìn)行菌株誘變可獲得菌落生長速率快、產(chǎn)酶能力高的突變菌株。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，在多次傳代試驗(yàn)中，菌株的性狀也比較穩(wěn)定，說明復(fù)合理化誘變比單因子誘變效果要好。

2.1.2理化誘變方法

常用的誘變方法主要3種：1）物理方法。主要采用物理誘變劑如紫外線、X-射線、超聲波、微波等使菌種發(fā)生隨機(jī)突變。2）化學(xué)方法。應(yīng)用化學(xué)誘變劑，如亞硝基化合物、烷化劑、氯化鋰、疊氮化物、抗生素、硫酸二乙酯等。3）生物誘變法。指通過生物手段對(duì)纖維素酶的基因和生成途徑進(jìn)行調(diào)控和干預(yù)。在纖維素酶真菌的誘變過程中，通過這三種手段單用或聯(lián)合使用，大幅度地提高了酶的活力和產(chǎn)量，誘變效果良好。在實(shí)際育種工作中，采用多種育種手段聯(lián)合方法是獲得優(yōu)良菌株的重要手段。因此，復(fù)合理化誘變處理微生物細(xì)胞或孢子是選育高產(chǎn)菌株的更有效方法，現(xiàn)在使用的許多高酶活菌株多是通過該方法獲得的。

2.1.3理化誘變篩選抗阻遏突變菌株

纖維素酶生產(chǎn)中酶產(chǎn)量低的主要原因是酶合成中產(chǎn)生了大量阻遏抑制酶生成的代謝終產(chǎn)物葡萄糖。這一現(xiàn)象稱為降解物阻遏抑制現(xiàn)象。纖維素酶的合成受雙重因子調(diào)節(jié)，即誘導(dǎo)物誘導(dǎo)和分解產(chǎn)物阻遏。通常通過篩選誘導(dǎo)物來提高纖維素酶活性很難實(shí)現(xiàn)，而在自然界中又很少存在能夠進(jìn)入細(xì)胞并具有較強(qiáng)誘導(dǎo)能力的可溶性物，因此研究者大多都是通過篩選抗阻遏突變株的方法來獲得高產(chǎn)菌。

例如，方芳等[7]以紫外和微波兩種方法復(fù)合誘變來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的原始菌株Trichoderma asperelloides41245，選育出了具有高纖維素酶活的Trichoderma asperelloides菌株。曲音波[8]改進(jìn)了抗阻遏突變株的篩選方法，用纖維素代謝終產(chǎn)物葡萄糖代替甘油，用脫木素木粉代替磷酸膨脹纖維素，制成雙層平皿，直接根據(jù)突變產(chǎn)生透明圈能力變化，從紫外線和亞硝基胍（NTG）復(fù)合誘變后的變異株中，篩選出了2株具有抗阻遏高產(chǎn)菌株——斜臥青霉JU15和Jul。這些突變株不僅可以在含有可溶性糖的培養(yǎng)基上合成纖維素酶，而且其在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的產(chǎn)酶能力也得到較大幅度的提高。

國外學(xué)者對(duì)產(chǎn)酶菌所做的理化誘變有：Bandyopadhyay等[9]采用甲基硝基亞硝基胍對(duì)野生型米根霉菌株進(jìn)行誘變，從50株透明圈增加的突變株中篩選到一株內(nèi)切葡聚糖酶活性增加的菌株，其羧甲基纖維素酶活性增加33%。Dillon等[10]采用紫外線、甲基硝基亞硝基胍、亞硝酸、硫酸二乙酯及溴化乙錠的兩兩組合分別對(duì)特異腐質(zhì)霉進(jìn)行兩輪誘變，獲得具有高纖維素酶活性菌株H. insolensTAS-13UV-4NG-5，與野生型菌株相比，其羧甲基纖維素酶活性增加115%、濾紙酶活性增加303%、β-葡萄糖苷酶活性增加196%。Hungund等[11]對(duì)青霉9A02S1菌株經(jīng)過氧化氫誘變，篩選得到一株更快分泌纖維素酶的突變株。與母株相比，突變體表現(xiàn)出更高的內(nèi)切葡聚糖酶生產(chǎn)速率，發(fā)酵第3天其內(nèi)切葡聚糖酶活性可達(dá)到16.96 U/mL。文獻(xiàn)[12]研究表明，紫外線和硫酸二乙酯誘變可提高纖維素生產(chǎn)菌株木葡糖酸醋桿菌NCIM 2526的纖維素酶產(chǎn)量，野生型菌株經(jīng)上述誘變后，篩選得到一株突變株GHEM4，其纖維素產(chǎn)量提高98%，達(dá)到5.96 g/L。

2.1.4抗藥性突變株的篩選

有些抗生素如衣霉素、萬古霉素、兩性霉素等能夠增強(qiáng)酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，同時(shí)影響酶的翻譯、修飾、分泌等環(huán)節(jié)，使得胞外酶產(chǎn)量提高。因此，可以通過選育抗藥性突變株來篩選胞外酶來實(shí)現(xiàn)菌株高產(chǎn)酶量。于春生等[13]結(jié)合紫外線和氯化鋰進(jìn)行復(fù)合誘變，利用哈茨木霉菌株改良多菌靈，獲得了良好的抗性改良效果。趙曉軍等[14]采用嘧霉胺藥劑處理敏感菌株黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea），并測(cè)定了其三種胞外酶（羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和果膠酶）的活性。結(jié)果表明，藥劑處理后，黃瓜灰霉病菌對(duì)嘧霉胺產(chǎn)生抗性，敏感菌株的胞外酶活性較處理前均升高，而抗性菌株的胞外酶活性降低。

2.2 原生質(zhì)體融合技術(shù)

原生質(zhì)體融合（Protoplast Fusion）指用自然或人工方法使2個(gè)或更多個(gè)不同的細(xì)胞融合成1個(gè)細(xì)胞的過程。該技術(shù)可打破物種間細(xì)胞不能相互融合的障礙，是獲得纖維素酶高產(chǎn)菌株的理想育種途徑。研究者對(duì)各不同屬種的纖維素酶系之間的親和相容性或多態(tài)性進(jìn)行研究，利用細(xì)胞融合技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)既能分解纖維素，又能分解木質(zhì)素的雙重功效。近年來，隨著新技術(shù)的發(fā)展，如滅活原生質(zhì)體融合、離子束細(xì)胞融合技術(shù)等，原生質(zhì)體融合技術(shù)取得了新的進(jìn)展。對(duì)于纖維素酶生產(chǎn)菌株的改良，原生質(zhì)融合技術(shù)比常規(guī)誘變育種具有更大的優(yōu)越性。例如，將里氏木霉和黑曲霉進(jìn)行原生質(zhì)體融合，篩選到的融合子一方面充分利用里氏木霉能大量合成外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶的優(yōu)點(diǎn)，另一方面克服了β-葡萄糖苷酶活力低的缺陷[15]。例如，El-Bondkly等[16]采用聚乙二醇（PEG）法和電融合法將兩株哈茨木霉進(jìn)行種內(nèi)原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)，得到了一系列融合子，結(jié)果表明，采用電融合法得到的融合羧甲基纖維素酶活性和β-葡萄糖苷酶活性分別比原始菌株增加41.66%和16.27%。在此基礎(chǔ)上，El-Bondkly等[17]又對(duì)野生型木霉、青霉和曲霉進(jìn)行紫外誘變，得到高產(chǎn)纖維素酶的三個(gè)突變株，并對(duì)其進(jìn)行原生質(zhì)體融合，得到的重組菌株在固態(tài)發(fā)酵條件下羧甲基纖維素酶活性、濾紙酶活性、β-葡萄糖苷酶活性分別達(dá)到450、191、225 U/g干物質(zhì)。Kaur B等[18]將構(gòu)巢曲霉和塔賓曲霉進(jìn)行了種間原生質(zhì)體融合，得到的融合子在搖瓶和固態(tài)發(fā)酵條件下，內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β-葡聚糖苷酶及濾紙酶活性均有顯著提高。進(jìn)一步的蛋白組學(xué)研究表明，該融合子內(nèi)切木聚糖酶、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶及β-葡聚糖苷酶的表達(dá)水平都有明顯提高。原生質(zhì)體融合技術(shù)操作簡單，是微生物育種的一種有效手段。在選育理想的融合株時(shí)可以有目的地選擇親株，無需了解雙親詳細(xì)的遺傳背景，從而不受親緣關(guān)系的影響。但是，目前原生質(zhì)體融合技術(shù)只限在兩個(gè)菌之間的融合及融合后染色體重組的隨機(jī)性，限制了其研究發(fā)展。

2.3 原生質(zhì)體誘變技術(shù)

去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體對(duì)誘變劑更為敏感，通過誘變?cè)|(zhì)體來提高產(chǎn)酶量，容易得到優(yōu)良的突變株。原生質(zhì)體誘變是經(jīng)物理或化學(xué)誘變劑對(duì)育種材料處理后，再進(jìn)行再生培養(yǎng)，最后從再生菌落中篩選高產(chǎn)突變株的一門技術(shù)。

原生質(zhì)體誘變技術(shù)在抗生素、酶制劑、有機(jī)酸等高產(chǎn)突變株選育中得到廣泛應(yīng)用。尤其在對(duì)絲狀真菌的選育中，已取得了許多有應(yīng)用價(jià)值的成果。例如，對(duì)絲狀真菌中產(chǎn)酶活力較強(qiáng)的菌種如木霉、青霉、曲霉等進(jìn)行原生質(zhì)體誘變，較短時(shí)間內(nèi)菌種的變異率大幅度提高，可以成功獲得比出發(fā)菌株產(chǎn)酶高、性能穩(wěn)定的突變菌株。近年來，隨著新誘變?cè)吹某霈F(xiàn)原生質(zhì)體誘變技術(shù)有了新的進(jìn)展。例如，離子注入技術(shù)使原生質(zhì)體誘變的應(yīng)用更加廣泛。沈瑩等[19]通過對(duì)簡青霉原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，提高了出發(fā)菌株J的木質(zhì)素降解酶酶活，誘變菌株J18和J12對(duì)木質(zhì)素降解率分別提高198.1%和67.5%。Xu F等[20]對(duì)野生型綠色木霉進(jìn)行了一系列誘變，首先對(duì)木霉原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變、然后采用低能量離子束、等離子體、甲基硝基亞硝基胍等處理方法對(duì)上述突變株的孢子進(jìn)行進(jìn)一步的誘變，從得到的大量正突變株中篩選到一株纖維素酶活性強(qiáng)的菌株，與野生型菌株相比，其內(nèi)切葡聚糖酶活性增加1.18倍，β-葡萄糖苷酶活性增加1.27倍。Feng Xu等[21]通過原生質(zhì)體“遞推式融合”方法使正突變菌株進(jìn)行基因組重組，得到的重組菌株濾紙酶活力比野生型菌株提高1.97倍。

2.4 基因工程技術(shù)

運(yùn)用基因工程在分子水平上對(duì)纖維素酶基因進(jìn)行改造，可以快速、定向地克隆纖維素酶基因，獲得新的高比活力纖維素酶。改造后的纖維素酶在穩(wěn)定性和催化活性等方面有很大的提升，對(duì)提高酶的生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本具有重要意義。因此，通過基因工程構(gòu)建高效表達(dá)高活性纖維素酶的基因工程菌，是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。人們已經(jīng)將纖維素酶的基因克隆到細(xì)菌、酵母、真菌中，并得到了重組型纖維素酶的高效表達(dá)。

2.4.1目的基因的選擇

目的基因的獲得是實(shí)現(xiàn)克隆和表達(dá)纖維素酶基因的第一步。對(duì)于序列己知的目的基因，從基因組中調(diào)取目的基因是最常用的手段之一。對(duì)于序列未知的目的基因，則需要通過構(gòu)建cDNA文庫―克隆至載體―宿主培養(yǎng)―確定目的基因等一系列步驟實(shí)現(xiàn)。目前纖維素酶基因的克隆己從多種細(xì)菌和真菌中實(shí)現(xiàn)，同時(shí)與之相關(guān)的基因文庫也得到構(gòu)建，其中一些纖維素酶的基因已在大腸桿菌[22]或真核微生物[23-25]中得到了表達(dá)。隨著基因重組技術(shù)的快速發(fā)展，特別是以分子克隆為基礎(chǔ)的克隆技術(shù)的發(fā)展，纖維素酶基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定越來越多地展開。在Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（由歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室主持建立的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫）中，己有數(shù)百個(gè)內(nèi)切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶的全序列。在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫GenBank、EMBL，以及日本DNA數(shù)據(jù)庫DDBJ等共享數(shù)據(jù)庫中，有7000多個(gè)纖維素酶基因序列和500多個(gè)纖維素酶的3D結(jié)構(gòu)。

2.4.2表達(dá)系統(tǒng)的建立

要得到目的基因的表達(dá)產(chǎn)物，必須將其在合適的表達(dá)系中表達(dá)，再去篩選。目前常用的表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)。原核宿主細(xì)胞主要是大腸桿菌，真核細(xì)胞包括酵母和絲狀真菌等。

1）原核表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌是應(yīng)用廣泛的纖維素酶表達(dá)系統(tǒng)，He J等[26]克隆了里氏木霉中內(nèi)切木聚糖苷酶基因，再在噬菌體強(qiáng)啟動(dòng)子T7上將目的基因重組整合，最后在大腸桿菌BL21中克隆，最終實(shí)現(xiàn)了纖維素酶的融合表達(dá)。Zhang等[27]在大腸桿菌體內(nèi)克隆了內(nèi)切葡聚糖苷酶基因的原始型和突變體，重組后的兩種形式的內(nèi)切酶基因?qū)w維素的水解效果良好。Kim等[28]克隆了真菌中編碼內(nèi)切葡聚糖酶（EG）的耐熱纖維素酶基因Cel8Y，并在大腸桿菌E.coliXL1-Blue中成功表達(dá)，重組子最適反應(yīng)溫度達(dá)到80℃。雖然大腸桿菌是目前使用較多且成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，但是用來表達(dá)纖維素酶基因存在兩個(gè)主要問題：一是其產(chǎn)物常為沒有活性的包涵體，酶蛋白不能分泌，表達(dá)水平低。二是提取難度很大，因而離工業(yè)化應(yīng)用還有一定的距離。

2）真核表達(dá)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化 真核表達(dá)系統(tǒng)是近年來用于表達(dá)外源基因新的表達(dá)體系。木霉和曲霉是公認(rèn)的真核微生物安全生產(chǎn)菌株，在工業(yè)生產(chǎn)中作為工程菌得到廣泛應(yīng)用[29]。例如，文獻(xiàn)[30]將來自真菌的3種纖維素酶插入里氏木霉中表達(dá)后得到的新的纖維素酶混合物，較普通商業(yè)酶具有熱穩(wěn)定性和水解液溫度高的特點(diǎn)，而同時(shí)對(duì)纖維素具有很高的降解率，高達(dá)理論值的90%。Kanamasa等[31]將A.aculealusCBHI的編碼基因在米曲霉A.oryzae 表達(dá)系統(tǒng)得到高效表達(dá)，轉(zhuǎn)化子中CBHI的濃度可以達(dá)到0.94 g/L。Wang等[32]克隆了Aspergillus niger的纖維二糖酶基因，并在瑞氏木霉中進(jìn)行了表達(dá)，重組子的纖維二糖酶活性達(dá)到5.3 IU/mL，濾紙酶活性較宿主菌活性高44%，玉米桿糖化試驗(yàn)表明其水解效率較宿主菌提高了21%。

工業(yè)上，酵母是纖維素酶表達(dá)載體的首選菌。Zhuge等[33]在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)原核細(xì)菌的纖維素酶基因轉(zhuǎn)化，多個(gè)纖維素酶基因共轉(zhuǎn)化酵母，得到的工程菌表達(dá)產(chǎn)物的酶活有一定的提高。龔映雪[34]將綠色木霉中的纖維素酶基因EGⅢ和CBHⅡ，共轉(zhuǎn)化釀酒酵母，獲得能更有效降解非結(jié)晶纖維素的重組酵母菌株S.cerevisiae-EC。

3 結(jié)語

在各種高產(chǎn)纖維素酶菌種改良方法中，復(fù)合理化誘變方法由于具有效率高、流程簡單等特點(diǎn)，是目前在發(fā)酵工業(yè)上獲得產(chǎn)酶活性高、酶系分布全的纖維素酶菌株的有效手段，但它也存在盲目性和隨機(jī)性等缺點(diǎn)。當(dāng)前，原生質(zhì)體融合技術(shù)、原生質(zhì)體誘變技術(shù)、基因工程技術(shù)等隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，改良篩選的突變株的產(chǎn)酶效率得到不斷提高，逐漸成為菌種改良的主要手段。然而，目前原生質(zhì)體融合技術(shù)還存在兩大問題，即融合局限性（只局限于2個(gè)菌之間）和重組的隨機(jī)性，存在染色體DNA的非同源性和對(duì)異源DNA的限制作用。原生質(zhì)體誘變技術(shù)的應(yīng)用隨著新的誘變?cè)措x子束的出現(xiàn)，也有了新的進(jìn)展。例如隨著離子注入技術(shù)的出現(xiàn)，其與原生質(zhì)體技術(shù)結(jié)合將會(huì)在優(yōu)良菌株的改良中得到廣泛的應(yīng)用。雖然纖維素酶基因的克隆與表達(dá)取得了一定進(jìn)展，但其目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌均較弱，還不能大規(guī)模地應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)；通過基因工程構(gòu)建表達(dá)高活性纖維素酶的工程菌已取得了肯定的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果，但目前尚無工業(yè)應(yīng)用的報(bào)道，所以目前并沒有在真正意義上得到高效分解纖維素的工程菌，還需進(jìn)一步開展應(yīng)用研究。可見，選育和改良活性高、耐受性好、酶系均衡的高產(chǎn)纖維素酶菌株仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)纖維素酶工程菌研究的逐漸完善以及纖維素酶解機(jī)理研究探索的不斷深入，加之纖維素酶各級(jí)加工工藝的優(yōu)化，將大大推動(dòng)纖維素酶的市場化應(yīng)用。

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Research Progress on Efficient Enzyme Production Engineering Bacteria Breeding Technology of Cellulosic Ethanol Production

YAN Yu-ling1, YAO Xiu-qing1, ZHANG Quan2, CAO Chang-hai2

（1. Liaoning Shihua University, Fushun 113001, China; 2. Fushun Research lnstitute of Petroleum and Petrochemicals, SINOPEC, Fushun 113001, China）

The latest progresses in theoretical research and technology of breeding high cellulase producing strains were summarized. Breeding technologies of efficient enzyme bacteria for the production of cellulosic ethanol were summarized, such as to obtain efficient enzyme producing bacteria by composite physical and chemical mutagenesis, and all kinds of cellulase and hemicellulose strains could be modified by protoplast fusion, protoplast mutagenesis and gene engineering technology and so on. The prospects on breeding high cellulase producing strains in the future were presented.

lignocellulose; cellulase; strain; protoplast; mutagenesis; fusion; gene engineering

Q81；TK6

A

1004-8405(2016)04-0068-08

10.16561/j.cnki.xws.2016.04.02

2016-03-21

中國石油化工集團(tuán)公司資助項(xiàng)目（213105）。

閆玉玲（1980～），女，在讀博士；研究方向：纖維素生物質(zhì)的綜合利用。yulingyan1981@126.com