龐戀蘇 李亞男

·綜述·

重組人溶菌酶的研究進(jìn)展*

龐戀蘇 李亞男

人溶菌酶是一種人體內(nèi)天然存在的具有抗菌、抗病毒、抗炎、增強(qiáng)免疫力等特性的蛋白質(zhì)。它直接作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，因此，細(xì)菌對(duì)其完全不存在耐藥性，也無(wú)免疫原性。利用基因工程生產(chǎn)出的重組人溶菌酶不僅具有人溶菌酶的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也克服了人溶菌酶活性低、產(chǎn)量低、不便于制備、無(wú)法穩(wěn)定保存等缺點(diǎn)。在抗菌藥物濫用、耐藥菌株廣泛存在的今天，由于其特性可以彌補(bǔ)眾多抗生素的不足，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。本文就針對(duì)重組人溶菌酶的研究進(jìn)展做一綜述。

溶菌酶；重組人溶菌酶；藥理作用；生物功能

溶菌酶起源于1922年Flem ing在人的鼻粘液中發(fā)現(xiàn)一種能夠溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的物質(zhì)，并將其命名為“Lysozyme”，即溶解細(xì)菌的蛋白質(zhì)。溶菌酶全稱1,4-β-N乙酰胞壁酸聚糖水解酶，又稱為細(xì)胞壁溶解酶，在高等動(dòng)物的體液中分布廣泛，它具有抗菌、抗病毒、消炎、增強(qiáng)免疫力等特性[1]。隨著日益出現(xiàn)的耐藥型細(xì)菌以及人體對(duì)抗生素類藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)，急需要一種新型的無(wú)耐藥性、無(wú)抗原性、無(wú)毒性的抗菌藥物，基因工程技術(shù)的發(fā)展使得重組人溶菌酶得以生產(chǎn)，人們期待將重組人溶菌酶用于臨床。

1.人溶菌酶的分子結(jié)構(gòu)和理化生物特性

人溶菌酶是由130個(gè)氨基酸組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，是一種陽(yáng)離子堿性蛋白質(zhì)，呈白色結(jié)晶狀或無(wú)定形粉末固相，常溫即可溶于水，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，最適宜溫度是25℃，在高溫和酸溶液環(huán)境中活性也保持穩(wěn)定，堿溶液中不穩(wěn)定，天然人溶菌酶主要存在于人體體液、組織內(nèi)外細(xì)胞液和人體器官中，作為一種重要的非特異性體液免疫因子，若缺乏可導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫系統(tǒng)疾病。溶菌酶在人體唾液中以游離和復(fù)合物這兩型存在：(1)游離型主要是呈團(tuán)簇狀的陽(yáng)離子蛋白質(zhì)；(2)復(fù)合物型與陰離子蛋白質(zhì)、多糖、大分子物質(zhì)共同組成[2]。細(xì)菌細(xì)胞壁溶菌酶根據(jù)靶向作用的位點(diǎn)不同，可以細(xì)分為作用于β-1,4糖苷鍵和作用于肽“尾”這兩種類型，溶解真菌的主要是依賴裂解酵母菌細(xì)胞壁和霉菌細(xì)胞壁的溶菌酶。

溶菌酶溶菌作用機(jī)制是借助于幾種酶或非酶物質(zhì)共同作用溶解細(xì)菌細(xì)胞壁達(dá)到殺菌效果，哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，不存在肽聚糖，溶菌酶無(wú)靶向位點(diǎn)，故對(duì)人體細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生破壞作用。因?yàn)楦锾m氏陰性細(xì)菌只有內(nèi)層壁為肽聚糖，而革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，所以人溶菌酶抗革蘭氏陽(yáng)性菌效應(yīng)高于革蘭氏陰性菌[3]。真菌細(xì)胞壁中的連接鍵幾丁質(zhì)也是人溶菌酶的底物，人溶菌酶可以使其β-1,4糖苷鍵斷裂而使細(xì)胞壁溶解，并且PH=5是溶解幾丁質(zhì)最好的條件，因此溶菌酶可以溶解真菌細(xì)胞壁而治療其引起的感染[4]。人溶菌酶蛋白質(zhì)抗病毒機(jī)制是雙方所帶的異種電荷能夠緊密結(jié)合在一起，與病毒DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，破壞病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)達(dá)到使病毒失活的作用[5]。溶菌酶還有改善和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞細(xì)胞免疫的作用，使白細(xì)胞增多、減輕內(nèi)毒素的作用，使機(jī)體受損可以通過(guò)加快自身免疫反應(yīng)并釋放炎癥因子[6]。同時(shí)，人溶菌酶能夠激活血小板、發(fā)揮并加強(qiáng)人體第二道防線功能，從而實(shí)現(xiàn)抗菌、消炎、止疼等作用。人體中溶菌酶的分布和含量體現(xiàn)了某些疾病的發(fā)生、發(fā)展，可作為疾病診斷的重要指標(biāo)。

2.重組人溶菌酶藥效學(xué)研究

呂秋軍[7]學(xué)者發(fā)現(xiàn)重組人溶菌酶具有較強(qiáng)的抗菌性能。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金葡球菌、表皮葡萄糖球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌活性強(qiáng)，尤其對(duì)耐藥菌有效，與其他抗生素聯(lián)用后，體外抑菌活性明顯增強(qiáng)，還具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用，在急性、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)中，w istar大鼠、獼猴均未發(fā)現(xiàn)毒性靶器官，為后期制備抗耐藥菌新藥提供參考。多項(xiàng)研究實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)重組人溶菌酶和溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品抑菌活性的比較試驗(yàn)中，重組人溶菌酶對(duì)致病菌與益生菌的抑菌性能均明顯強(qiáng)于溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品，它表現(xiàn)出更優(yōu)異的低劑量即達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶的抗菌活性[5]。已有研究證明溶菌酶可以抗冠狀皰疹病毒、腺病毒生長(zhǎng)，也可用于帶狀皰疹、腮腺炎、雞水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治療[8]，也有研究資料提示，人溶菌酶是抗H IV感染、抗SARS的輔助治療藥物[9]。

Tenovuo等[10]臨床研究顯示，將口腔牙膏與溶菌酶混合可更有效的預(yù)防齲齒，效果優(yōu)于直接添加抗菌劑。變形鏈球菌是目前公認(rèn)的可疑致病菌[11]，溶菌酶能夠破壞變形鏈球菌的細(xì)胞壁完整性達(dá)到抗齲的效果。牙周炎[12]主要認(rèn)為是細(xì)菌的菌群紊亂導(dǎo)致，優(yōu)勢(shì)菌群的存在，破壞牙周膜細(xì)胞從而發(fā)病，而重組人溶菌酶通過(guò)抑制優(yōu)勢(shì)菌可以改善疾病。牙齒釉質(zhì)表面覆蓋的一層薄膜中含有溶菌酶，它可以隔離外界環(huán)境對(duì)牙釉質(zhì)的酸蝕破壞，提示可以通過(guò)制備溶菌酶制劑達(dá)到護(hù)齒的目的。Samaranayake等[13]體外模型研究發(fā)現(xiàn)，少量的溶菌酶即可抑制念珠菌生物膜的形成。重組人溶菌酶和抗真菌劑同時(shí)使用還具有協(xié)同作用，能夠有效抑制真菌感染。

3.重組人溶菌酶制備與臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究

人溶菌酶存在提取困難和活性難以保證等問題，現(xiàn)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的溶菌酶制劑主要是從雞蛋的蛋殼和蛋清中提取得來(lái)的，可以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，并已經(jīng)進(jìn)入臨床應(yīng)用。國(guó)外則以動(dòng)物和霉菌為原料進(jìn)行生產(chǎn)，在大腸桿菌、酵母菌以及動(dòng)物、植物中都有表達(dá)重組人溶菌酶的相關(guān)研究。1986年Murakam i[14]在啤酒酵母中表達(dá)出的重組人溶菌酶因?yàn)榘w形式存在而不具有活性，后又在大腸桿菌上表達(dá)生產(chǎn)人溶菌酶，但都存在產(chǎn)量小，活性低的問題。1988年Yosh imura等[15,16]學(xué)者通過(guò)接上一段雞溶菌酶信號(hào)肽，從而使啤酒酵母分泌了有活性的人溶菌酶。2001年賈向志等[17]在巴斯得畢赤酵母上得到重組人溶菌酶的表達(dá)，但低等宿主中表達(dá)的重組人溶菌酶時(shí)常會(huì)以不溶的包涵體形式存在而無(wú)活性，表達(dá)產(chǎn)量也無(wú)法達(dá)到要求。經(jīng)過(guò)近20年的研究，采用單分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，篩選出能夠高表達(dá)的人溶菌酶的工程菌，發(fā)現(xiàn)巴斯得畢赤酵母菌具有高效表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)，打破了低等生物表達(dá)產(chǎn)物活性低的瓶頸。結(jié)合巴斯得畢赤酵母營(yíng)養(yǎng)要求低、可高密度發(fā)酵、穩(wěn)定遺傳性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，重組人溶菌酶可以在臨床上廣泛應(yīng)用。可研究逐漸發(fā)現(xiàn)，從各種微生物原材料中提取人溶菌酶仍存在一些固有缺陷：(1)生物原材料無(wú)法保證每一物種都能夠高產(chǎn)量、穩(wěn)定表達(dá)；(2)物種來(lái)源也容易受到污染，是否在傳代的過(guò)程中不產(chǎn)生物種隔離；(3)生物活性不容易穩(wěn)定遺傳，持續(xù)性無(wú)法得到保證。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，現(xiàn)利用DNA重組技術(shù)動(dòng)物反應(yīng)器表達(dá)獲得產(chǎn)物就可以克服這些問題，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)表達(dá)重組人溶菌酶與天然人溶菌酶理化性質(zhì)、生物活性總體上無(wú)差別。

2006年Murray[18]小組已經(jīng)成功在山羊乳腺中得到表達(dá)并穩(wěn)定遺傳，國(guó)內(nèi)李寧院士[19]的團(tuán)隊(duì)2011年在奶牛乳腺上得到表達(dá)，并獲得高產(chǎn)和穩(wěn)定遺傳。動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組人溶菌酶與天然人體產(chǎn)生的溶菌酶并無(wú)顯著差別[20]。奶牛生物反應(yīng)器可以高表達(dá)出重組人溶菌酶，也可以減少奶牛乳腺炎的發(fā)病率，奶液更加健康，其體內(nèi)常見益生菌也未受到抑制。重組人溶菌酶還可以提高仔豬抗腹瀉的能力[21,22]。

由于重組人溶菌酶的廣譜抗菌特性，又安全無(wú)毒副作用，已用在食品加工、副食品產(chǎn)品制作中，醫(yī)療衛(wèi)生也已經(jīng)有各種溶菌酶藥物劑型，主要應(yīng)用于上呼吸道感染、口腔等疾病。人溶菌酶作為一種非特異性免疫蛋白，它能夠在自身免疫中發(fā)揮及其重要的作用，是人類機(jī)體免疫的第一道防線。對(duì)口腔內(nèi)牙周炎、齲齒、復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍、扁平苔蘚、智齒冠周炎、天皰瘡的治療均有一定作用[23]。我國(guó)復(fù)旦大學(xué)學(xué)者[24]進(jìn)行了多中心、隨機(jī)、雙盲、多劑量平行對(duì)照評(píng)價(jià)重組人溶菌酶噴霧劑治療咽炎、扁桃體炎的療效及安全性的研究，現(xiàn)提示療效及安全性均較好，但缺乏長(zhǎng)期的臨床試驗(yàn)觀察及數(shù)據(jù)分析，臨床上應(yīng)用仍需要進(jìn)一步數(shù)據(jù)支持。

4.重組人溶菌酶研發(fā)的優(yōu)勢(shì)與存在的問題

綜上，重組人溶菌酶是一種廣譜抗菌、抗病毒藥物，能夠有效殺死毒性微生物并保護(hù)自身不受損害，同時(shí)與其他藥物相互作用無(wú)交叉反應(yīng)。具有上述優(yōu)點(diǎn)，使得重組人溶菌酶可以在畜牧業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、臨床治療中得到發(fā)展。因?yàn)樗膽?yīng)用十分廣泛，也引起了世界衛(wèi)生組織、糧食農(nóng)業(yè)組織的重視，現(xiàn)已經(jīng)用來(lái)抗仔豬腹瀉病、抗山羊、奶牛乳腺炎，也可以做食品的防腐劑，已用在青稞、肉制品、以及牛奶的保質(zhì)防腐等用途上?，F(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)行藥用生產(chǎn)的主要是雞蛋蛋清溶菌酶，而它僅是重組人溶菌酶活性的1/3，同時(shí)由于異源性對(duì)人體有免疫排斥反應(yīng)，也無(wú)法對(duì)抗機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌、病毒等。人溶菌酶熱穩(wěn)定性也要遠(yuǎn)高于雞蛋清溶菌酶，蛋清溶菌酶較于人溶菌酶抗菌譜較窄，而且人溶菌酶還有多種自身獨(dú)有的藥理作用，如抗炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫力及抗腫瘤等。

目前用于商品化的人溶菌酶多從人乳汁和胎盤中提取，存在著來(lái)源受限、產(chǎn)量極低、質(zhì)量不穩(wěn)定、含有未知病原、價(jià)格高昂等問題，不能滿足于市場(chǎng)需求。對(duì)于重組人溶菌酶的大規(guī)?；a(chǎn)與臨床應(yīng)用仍存在三個(gè)主要問題。第一，由于重組人溶菌酶在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中表達(dá)穩(wěn)定性差、異位表達(dá)、整合率低以及生長(zhǎng)周期漫長(zhǎng)、風(fēng)險(xiǎn)高、資金回報(bào)率不可預(yù)測(cè)、環(huán)境安全對(duì)于是否發(fā)生水平基因漂移等問題亟待解決。第二，對(duì)于特定疾病、細(xì)菌、耐藥菌、真菌、病毒的臨床實(shí)驗(yàn)室研究還是少數(shù)。第三，轉(zhuǎn)基因生物安全性還需要進(jìn)一步研究，有待于更進(jìn)一步的完善。第四，利用動(dòng)物反應(yīng)器生產(chǎn)出來(lái)的產(chǎn)品是否會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)丨h(huán)境造成污染，周邊生態(tài)是否會(huì)產(chǎn)生破壞。第五，動(dòng)物福利問題。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)物臨床制品的開放是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，中間需要大量實(shí)驗(yàn)室研究、中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗(yàn)、安全評(píng)估、生物安全福利、倫理學(xué)審查、安全證書、臨床前研究、臨床前動(dòng)物試驗(yàn)、臨床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期試驗(yàn)，需要逐步積累經(jīng)驗(yàn)、收集數(shù)據(jù)，均要進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和安全評(píng)價(jià)，確保生物安全性。

5.重組人溶菌酶未來(lái)展望

由于重組人溶菌酶具有安全、無(wú)毒、抗菌譜廣、無(wú)殘留、生物相容性好等特點(diǎn)，具有極其廣闊的應(yīng)用前景，預(yù)測(cè)今后的重組人溶菌酶會(huì)在以下幾個(gè)方面開展：(1)人溶菌酶基因水平上進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造、研究，利用微生物作載體開發(fā)具有實(shí)際意義的工程菌，以制取出更大產(chǎn)量、性質(zhì)更加穩(wěn)定、能夠持續(xù)遺傳的產(chǎn)品；(2)進(jìn)行動(dòng)物生物反應(yīng)器的制造，并能夠得到目的、安全的表達(dá)，解決動(dòng)物福利問題，隔絕基因污染；(3)應(yīng)用于臨床、食品及工業(yè)用途；(4)技術(shù)上攻克研發(fā)瓶頸，降低研究成本。在如今耐藥性細(xì)菌泛濫的時(shí)期，能夠早日開發(fā)重組人溶菌酶產(chǎn)品，為今后的控制感染、抑制有害細(xì)菌、毒素帶來(lái)裨益，會(huì)是未來(lái)的研究方向和趨勢(shì)，相信今后的人溶菌酶一定會(huì)得到廣泛的應(yīng)用。

[1] Eichenberger A P,Gattin Z,Yalak G,et al.Molecular Dynam icsSimu lation of Ester-Linked Hen Egg W h ite Lysozyme RevealstheEffectofM issing BackboneH ydrogen Bond Donors on the Protein Structure[J].Helvetica Chim ica Acta,2010,93(10):1857-1869

[2] W u H,Cao D,Liu T,et al.Purification and Characterization of Recom binant Hum an Lysozym e from Eggs of Transgenic Chickens[J].PlosOne,2015,10(12):e0146032

[3]OliverW T,Wells JE.Lysozymeasan alternative to grow th prom oting antibiotics in sw ine production[J].Journalof AnimalScienceand Biotechnology,2015,6(1):35

[4] Xin-Xin L I,Tao J J,Long Y U.Recom binant Human Lysozym e LYZL4:Expression in Pichia pastoris and Its AntibacterialActivity[J].China Biotechnology,2014

[5] Li J,Helmerhorst E J,Trox ler R F,et al.Identification of in vivo pellicle constituents by analysis of serum immune responses[J].Journalof DentalResearch,2004,83(1):60

[6]RuizED,A lmadaM,BurboaM G,etal.Oligomers,protofibrils and amy loid fibrils from recombinant human lysozym e(rHL):fibrillation process and cytotoxicity evaluation for ARPE-19 cell line[J].Colloids&Surfaces B Biointerfaces,2014,126:335

[7] 呂秋軍,卞廣興.抗感染新藥重組人溶菌酶的臨床前評(píng)價(jià)[J].中國(guó)新藥雜志,2006,15(17):1436-1439

[8] Zhao H,Tang J,Cao L,et al.Characterization of bioactive recombinant antim icrobial peptide parasin I fused w ith human lysozyme expressed in the yeast Pichia pastoris system[J].Enzyme&M icrobial Technology,2015,77(3):61

[9] HaiW,W u H,W ang K,et al.Exp ression of recombinant human lysozyme in transgenic chicken prom otes the grow th of Bifidobacterium,in the intestine and im proves postnatal grow th of chicken[J].Amb Express,2016,6(1):110

[10]Tenovuo J,Lum ikariM,Soukka T.Salivary lysozym e,lactoferrin and peroxidases:antibacterial effects on cariogenic bacteria and clinical app lications in preventive dentistry[J].Proceedings of the Finnish Dental Society Suomen Hamm asl??k?riseuran Toim ituksia,1991,87(2):197

[11]崔 偉,王成龍.變形鏈球菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2016,14(6):352-355

[12]劉 奕,王 峰,鄂玲玲,等.牙齦卟啉單胞菌脂多糖在高糖條件下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志,2016,14(2):83-86

[13]Matano M,Nakajim a K,Kashiw agi Y,et al.Sw eetness characterization of recom binant hum an lysozym e[J].Comparative Biochem istry&Physiology Part B Biochem istry&Molecu lar Biology,2015,188:8-14

[14]Murakam i.New developments in zeolite scienceand technology[M].Kodansha,1986.

[15]Yoshimura K,Toibana A,Nakahama K.Human lysozyme:sequencing of a cDNA,and expression and secretion by Saccharom ycescerevisiae[J].Biochem ical&BiophysicalResearch Communications,1988,150(2):794

[16]李新新,陶建軍,余 龍.人源溶菌酶基因LYZL4在畢赤酵母中的重組表達(dá)及活性測(cè)定[J].中國(guó)生物工程雜志,2014,34(1):79-85

[17]賈向志,馬文煜.人溶菌酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)[M].第四軍醫(yī)大學(xué),2001

[18]Maga EA,Cu llor JS,Sm ith W,et al.Hum an lysozymeexpressed in themammary gland of transgenic dairy goats can inhibit the grow th of bacteria that cause mastitis and the cold-spoilage of m ilk[J].Foodborne Pathogens&Disease,2006,3(4):384

[19]Tong J,WeiH,Liu X,etal.Production of recombinanthuman lysozym e in them ilk of transgenic pigs[J].Transgenic Research,2011,20(2):417-419

[20]梁振鑫,尹富強(qiáng),劉慶友,等.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器相關(guān)技術(shù)及研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志,2015,35(2):92-98[21]Lu D,Liu S,Shang S,et al.H igh-level expression of recombinant human lysozyme in them ilk of transgenic pigs[J].Transgenic Research,2013,22(1):219-219

[22]Lu D,Liu S,Shang S,et al.Production of transgenic-cloned pigs expressing large quantities of recombinant human lysozym e inm ilk[J].PlosOne,2015,10(5):e0123551

[23]魏 莉,許 穎,婁兵新.溶菌酶對(duì)微小小單胞菌生物膜的影響[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2017(5)

[24]潘 玨,修清玉,吳昌歸，等.多中心、隨機(jī)、雙盲、多劑量平行對(duì)照評(píng)價(jià)重組人溶菌酶噴霧劑治療咽炎、扁桃體炎的療效及安全性[J].國(guó)際呼吸雜志,2011,31(12):890-895

Research progressof recombinanthuman lysozyme

PANG Lian-su,LIYa-nan
(Departmentofstomatology,Chinese PLAGeneralHospitaland Chinese PLAMedicalschool,Beijing 100853,China)

Recombinant Human lysozyme is a kind of protein that has antibacterial,anti-viral,anti-inflammatory and immunological properties.Recombinant human lysozyme is a natural antibacterial agent,directly acting on bacterial cell wall.Ithasno drug resistance in bacteriaand immunogenicity.Recombinanthuman lysozymenotonly has theadvantageof human lysozyme butalso has better antibacterial activity,more production,easy to prepare and stable preservation.It has very promising clinical application prospectespecially bacterial resistant strains are widespread.The research progress of recombinanthuman lysozyme is reviewed.

Lysozyme;Recombinanthuman lysozyme;Pharmacological;Biological functions

R780.1

A

1672-2973(2017)05-0306-04

企事業(yè)單位合作課題(項(xiàng)目編號(hào):HXKTLIYANAN001)

龐戀蘇 解放軍醫(yī)學(xué)院 碩士生 北京 100853

李亞男 通訊作者 解放軍總醫(yī)院口腔修復(fù)科副主任醫(yī)師 副教授 北京 100853

2017-06-10)