邵勇鋼，李鳳鳴，王旭光，王彥欽

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052)

A-FABP基因表達與拜城油雞公雞肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性研究

邵勇鋼，李鳳鳴，王旭光，王彥欽

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830052)

[目的]研究拜城油雞公雞A-FABP基因的表達與肌內(nèi)脂肪含量之間的相關(guān)性。[方法]隨機選取拜城油雞公雞90只，隨機分為3組，每組30只。采用索氏抽提法和熒光定量PCR方法分別在12、18和24周齡測定胸肌和腿肌中肌內(nèi)脂肪含量和A-FABP基因的相對表達量。[結(jié)果]隨著周齡的增長，肌內(nèi)脂肪含量顯著增加，相同周齡拜城油雞公雞腿肌中肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于胸肌中肌內(nèi)脂肪含量(P<0.01)。不同周齡間、胸肌和腿肌間A-FABP基因的相對表達量差異不顯著(P>0.05)。[結(jié)論]拜城油雞公雞A-FABP基因的表達水平與肌內(nèi)脂肪含量沒有顯著相關(guān)。

拜城油雞；A-FABP基因；基因表達；肌內(nèi)脂肪

拜城油雞是新疆阿克蘇地區(qū)拜城縣特有的地方優(yōu)良品種，有人認為，該雞種在秋季育肥后胸部迅速沉積大量脂肪，所以被稱為油雞；也有人認為，該雞種皮膚和肌肉間有一層散發(fā)出特殊香味的很薄的脂肪層，所以被稱為油雞[1]；此外，還有人認為該雞種全身皮下脂肪分布均勻，在禽類中較為特別，因此稱為油雞[2]。肌內(nèi)脂肪(Intramuscular fat，IMF)含量是影響雞肉肉質(zhì)和風味的重要因素之一。研究表明，拜城油雞胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于地方土雞[3]，拜城油雞雞肉中不飽和脂肪酸比例顯著高于市售肉雞[4]，這可能是形成拜城油雞優(yōu)良風味的重要原因之一。脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(Adipocyte fatty acid binding protein，A-FABP)是一種與細胞內(nèi)的脂肪酸轉(zhuǎn)運與代謝密切相關(guān)的蛋白[5]。Wang等[6]研究表明編碼該蛋白的A-FABP基因的表達與肌內(nèi)脂肪含量存在相關(guān)性。筆者利用熒光定量PCR技術(shù)檢測不同生長發(fā)育階段拜城油雞公雞A-FABP基因的相對表達量，并結(jié)合肌內(nèi)脂肪含量的測定結(jié)果，分析二者之間的相關(guān)性，旨在為進一步深入研究A-FABP基因影響肌內(nèi)脂肪含量的作用機理及拜城油雞的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗隨機選取健康拜城油雞公雞90只，隨機分為3組，分別在12(性成熟前)、18(性成熟)、24(上市)周齡分批屠宰，每批拜城油雞公雞屠宰采樣測定各30只。屠宰后迅速剝開胸部和腿部的皮膚，分別采取胸肌和腿肌組織放入預(yù)先裝入RNA保存液的無RNA酶的凍存管中(樣品與RNA保存液的體積比約為1∶10)，于4 ℃冰箱中平衡過夜后，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。采取完整的左側(cè)胸肌和腿肌放入自封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存。

依據(jù)GB/T 9695.7—2008，采用索氏抽提法測定胸肌和腿肌中粗脂肪的百分含量，以肌肉中的粗脂肪占鮮樣中的百分比表示。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑。RNA樣品儲存液(北京匯天東方科技有限公司)、RNA提取試劑盒(Qiagen公司)、無RNA酶的DNA酶試劑盒(Qiagen公司)、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Promega公司)、Oligo(dT)18引物(Takara公司)、超純dNTP mix(Takara公司)、RNA酶抑制劑(Takara公司)、熒光定量試劑盒(Takara公司)。

1.2.2 主要儀器。Retsch MM400球磨儀(德國)、Eppendorf Centrifuge 5810R 低溫高速離心機(德國)、NanoDrop ND-1000分光光度計(美國)、Eppendorf Mastercycler gradient 梯度PCR儀(德國)、DYCZ-24F型電泳槽(北京市六一儀器廠)、DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、CFX96TMReal-time system熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)。

1.3 胸肌和腿肌中RNA的提取 使用Retsch MM400球磨儀分別進行拜城油雞公雞胸肌和腿肌肌肉組織勻漿，采用Qiagen公司RNeasy Mini Kit試劑盒提取胸肌和腿肌雞肉組織中的RNA，采用Qiagen公司的無RNA酶的DNA酶試劑盒去除提取的RNA中可能存在的基因組DNA，純化RNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并檢測RNA濃度。將提取的RNA置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.4 反轉(zhuǎn)錄 采用20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：每管加入1 μg RNA模板，2 μL Oligo(dT)18(50 pmol/μL)，加無RNA酶的滅菌超純水至總體積5 μL，70 ℃ 5 min，4 ℃快速制冷，冰浴5 min。然后，每管中加入無RNA酶的滅菌超純水6.1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液4 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.4 μL，超純dNTP mix (10 mmol/L)1 μL，RNA酶抑制劑(40 U/μL)0.5 μL，ImProm-ⅡTMReverse Transcriptase 1 μL。RT-PCR反應(yīng)程序為25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，快速冷卻至4 ℃。將獲得的cDNA在-20 ℃冰箱中保存。

1.5 引物設(shè)計 參考雞的A-FABP(Fatty acid binding protein 4，adipocyte)基因的mRNA序列(登錄號為NM_204290.1)跨內(nèi)含子設(shè)計引物，內(nèi)參持家基因β-actin基因的引物設(shè)計參考Zhang等[7]的方法。引物信息具體見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物

1.6 熒光定量PCR 熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR Premix ExTaqTM10 μL，上、下游引物各1 μL(4 μmol/L)，ddH2O 7 μL，cDNA模板1 μL。整個反應(yīng)在Bio-Rad CFX96TMReal-time system熒光定量PCR儀中進行，采用兩步法，熒光定量PCR反應(yīng)程序為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s。熒光定量PCR結(jié)束后，繪制熔解曲線。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達量[8]，以胸肌作為對照。試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤

表示。采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對相同周齡胸肌和腿肌間的肌內(nèi)脂肪含量及A-FABP基因的相對表達量進行t檢驗；采用單因素方差分析對不同周齡間胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量及A-FABP基因的相對表達量進行分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胸肌和腿肌中RNA的提取結(jié)果 從圖1可以看出，提取的胸肌和腿肌中的RNA條帶清晰完整，可用于進一步試驗。

注：M.Marker；1～10.RNA樣品。 Note：M.Marker；1-10.RNA samples.圖1 RNA提取檢測結(jié)果 Fig.1 The detection results of extracted RNA

2.2 肌內(nèi)脂肪含量與A-FABP基因表達量的測定結(jié)果 由表2可知，隨著周齡的增長，拜城油雞公雞胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量逐漸增加，18周齡和24周齡胸肌中的肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于12周齡胸肌中的肌內(nèi)脂肪含量(P<0.01)，18周齡和24周齡胸肌中的肌內(nèi)脂肪含量差異不顯著(P>0.05)；不同周齡腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量從高到低依次為24、18、12周齡，差異極顯著(P<0.01)；相同周齡的拜城油雞公雞腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于胸肌中的肌內(nèi)脂肪含量(P<0.01)。不同周齡的拜城油雞公雞胸肌和腿肌中的A-FABP基因的相對表達量之間差異不顯著(P>0.05)。

表2 肌內(nèi)脂肪含量與A-FABP基因相對表達量

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；*表示與相同周齡的胸肌肌內(nèi)脂肪含量相比差異顯著(P<0.05)；**表示與相同周齡的胸肌肌內(nèi)脂肪含量相比差異極顯著(P<0.01)。

Note：Different small letters in the same column indicated significant difference(P<0.05)；Different capital letters in the same column indicated extremely significant difference(P<0.01)；*indicated significant difference with intramuscular fat content in breast muscle of male chicken with the same week-age(P<0.05)；**indicated extremely significant difference with intramuscular fat content in breast muscle of male chicken with the same week-age(P<0.01).

3 討論

李文娟等[9]分別在56、90、120日齡對北京油雞、矮腳雞、白來航雞和AA肉雞胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量進行測定，結(jié)果表明肌內(nèi)脂肪含量隨著日齡的增長而增加，腿肌肌內(nèi)脂肪含量顯著高于胸肌肌內(nèi)脂肪含量，存在顯著的品種效應(yīng)；在清遠麻雞中，120日齡胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于56日齡[10]；在56日齡和120日齡的鹿苑雞和如皋雞中胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量隨日齡的增加而顯著增加，鹿苑雞胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于如皋雞，存在品種差異[11]。該試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，肌內(nèi)脂肪含量隨日齡增加而增加，胸肌中的肌內(nèi)脂肪含量顯著低于腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量，說明肌內(nèi)脂肪的沉積在不同品種、不同生長發(fā)育階段和不同部位之間存在差異。12周齡如皋雞胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于安卡紅雞，存在品種差異，但同一品種內(nèi)胸肌和腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量差異不顯著[12]，這與該試驗結(jié)果不同，推測可能是由于受到品種和采樣時間等因素的影響所致。

研究表明，在不同雞種的胸肌和腿肌中未能檢測到A-FABP基因的表達，A-FABP基因主要在腹脂和肝臟中表達[10-11]。據(jù)報道，在不同年齡和不同雞種中A-FABP基因表達量隨著日齡的增長而增加，存在顯著的性別差異[9]；在北京油雞中，A-FABP基因表達量隨周齡的增長而增加，8周齡與13周齡間無顯著差異，17周齡顯著增加，存在品種和性別差異[13]；如皋雞A-FABP基因的表達不存在性別差異，胸肌中A-FABP基因表達量在2周齡較低，4周齡最高，6周齡至12周齡緩慢降低[14]；在和田黑雞腿肌中A-FABP基因表達量顯著高于三黃雞，在和田黑雞和三黃雞中A-FABP基因的相對表達量與肌內(nèi)脂肪含量呈顯著正相關(guān)[6]；也有研究認為，A-FABP基因表達水平與肌內(nèi)脂肪含量之間沒有顯著的相關(guān)性[9，11]。該研究結(jié)果表明，在不同周齡的拜城油雞公雞胸肌和腿肌中A-FABP基因的相對表達量未檢測到顯著差異，推測A-FABP基因的表達受到不同品種、不同性別、不同年齡和不同組織等因素的影響，在拜城油雞公雞中肌內(nèi)脂肪含量和A-FABP基因的相對表達量間可能沒有顯著的相關(guān)性。

在東北農(nóng)業(yè)大學肉雞高脂系公雞中，腹脂中A-FABP基因的表達量顯著低于低脂系公雞腹脂中的表達量，推測A-FABP基因表達量對脂肪沉積影響的機理可能是該基因的高表達量水平導(dǎo)致脂解率增加，從而導(dǎo)致腹脂減少[15]。Navidshad等[16]和Shi等[17]研究表明A-FABP基因有可能通過影響PPARγ基因的表達進而影響脂肪細胞的增殖與分化。在拜城油雞中A-FABP基因的表達對肌內(nèi)脂肪沉積的影響，還有待于進一步研究。

4 結(jié)論

隨著拜城油雞公雞周齡的增長，肌內(nèi)脂肪含量顯著增加，相同周齡胸肌中的肌內(nèi)脂肪含量極顯著低于腿肌中的肌內(nèi)脂肪含量，胸肌和腿肌中A-FABP基因的相對表達量在不同時期未檢測到顯著差異，推測在拜城油雞公雞中A-FABP基因的表達水平可能與肌內(nèi)脂肪含量沒有顯著相關(guān)。

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Study on the Correlation between the Expression ofA-FABPGene and Intramuscular Fat in Male Baicheng Fatty Chicken

SHAO Yong-gang, LI Feng-ming, WANG Xu-guang et al

(College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi, Xinjiang 830052)

[Objective] To study the correlation between the expression ofA-FABPgene and intramuscular fat in male Baicheng Fatty Chicken. [Method] Ninety male Baicheng Fatty Chicken were randomly selected and divided into three groups. There were thirty chicken in each group. The content of intramuscular fat in breast muscle and leg muscle of male chicken and the relative expression level ofA-FABPgene were determined by using Soxhlet extraction method and fluorescence quantitative PCR. [Result] The content of intramuscular fat significantly increased with the prolonging of week-age. The content of intramuscular fat in leg muscle was significantly higher than that in breast muscle at the same week-age (P<0.01). The relative expression level ofA-FABPgene had no significant difference between the breast muscle and leg muscle, among different week-ages (P>0.05). [Conclusion] The relative expression level ofA-FABPgene in male Baicheng Fatty Chicken might have no significant correlation with the content of intramuscular fat.

Baicheng Fatty Chicken;A-FABPgene; Gene expression; Intramuscular fat

國家自然科學基金項目(31260550)。

邵勇鋼(1974- )，男，新疆烏魯木齊人，副教授，博士，從事動物遺傳育種研究。

2016-11-01

S 879.2

A

0517-6611(2016)34-0147-03