夏皙，丁梅

（中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧沈陽 110000）

COⅠ基因微條形碼技術(shù)在毛發(fā)種屬鑒定中的應用

夏皙，丁梅

（中國醫(yī)科大學法醫(yī)學院，遼寧沈陽 110000）

目的利用COⅠ基因微條形碼技術(shù)對哺乳動物毛發(fā)進行種屬鑒定。方法設(shè)計一對哺乳動物COⅠ基因微條形碼通用引物，利用共同區(qū)PCR技術(shù)對來自于哺乳綱5個目11個種屬的實驗動物毛發(fā)DNA進行擴增，并對擴增產(chǎn)物進行雙向引物測序，將測序結(jié)果進行拼接后所得的基因序列輸入BOLD數(shù)據(jù)庫進行同源性比對。結(jié)果本研究設(shè)計的微條形碼通用引物能夠?qū)λ蟹N屬實驗動物毛發(fā)DNA進行擴增，擴增片段長度147bp。數(shù)據(jù)庫同源比對結(jié)果顯示最匹配物種與實驗動物種屬相符，除獅同源匹配度為98.99%外，其他實驗動物同源匹配度均為100%，且獅種內(nèi)遺傳距離1%，種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離十倍，可以進行種屬判定。結(jié)論建立的COⅠ基因微條形碼技術(shù)能夠快速準確地對哺乳動物毛發(fā)檢材進行種屬鑒定。

法醫(yī)遺傳學；毛發(fā)；種屬鑒定；COⅠ基因微條形碼

種屬鑒定是法醫(yī)物證鑒定的重要內(nèi)容之一，能夠為案件的偵破提供線索和依據(jù)。毛發(fā)作為一種特殊的生物檢材，具有易獲取、無創(chuàng)、耐腐蝕、不易腐敗的特點。動物和人類關(guān)系密切，因此在日常案件偵查中，動物毛發(fā)成為常見的微量物證之一，尤其是在由于非法野生動物交易造成的日益嚴重的物種多樣性危機的背景下，調(diào)查人員需要一種能夠快速、準確鑒定毛發(fā)種屬的方法。

COⅠ基因5′端650 bp DNA序列的堿基組合可保證每一個物種都有唯一的DNA條形碼基因，其DNA序列穩(wěn)定，很少存在插入和缺失，是目前用于動物分類與鑒別的最理想DNA條形碼[1]。毛發(fā)檢材由于其自身角化，DNA高度降解，無法提取出完整的條形碼基因，因此本研究利用一對微條形碼通用引物擴增哺乳動物綱5個目11個種屬動物的COⅠ基因片段（147 bp），通過對PCR產(chǎn)物測序的方法進行種屬鑒定，以達到快速、準確鑒定毛發(fā)種屬的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本與DNA提取

采集靈長目動物（人）、兔形目動物（兔）、偶蹄目動物（牛、羊）、奇蹄目動物（馬、驢）、食肉目動物（犬、狐、虎、獅、熊）共11種動物的毛發(fā)樣本，其中，虎、獅、熊毛發(fā)各1例，來自沈陽森林野生動物園，其他動物毛發(fā)各5例，分別來自志愿者（人）、養(yǎng)殖場（兔、牛、羊、馬、驢、狐）、寵物醫(yī)院（犬）。

DNA提取具體步驟如下：向裝有樣品的離心管中加入5%Chelex-100 91μL，蛋白酶（10mg/mL）5μL，1mol DTT 4μL，56℃金屬浴3h，劇烈振蕩10s，100℃金屬浴8min，劇烈振蕩10s，12000×g離心5min。取上清液30μL與300μL MA緩沖液及磁珠10 μL混勻，置于磁力架上2 min，棄去上清液，加入700 μL MLW緩沖液，振蕩混勻靜置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清液，加入70%乙醇溶液700 μL洗滌2次，振蕩混勻，磁力架上靜置，棄去上清液。開蓋15min將乙醇徹底揮干，加入TE緩沖液20μL，65℃8 min，磁力架上靜置，轉(zhuǎn)移液體至新的離心管中，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計與合成

設(shè)計哺乳動物COⅠ基因微條形碼通用引物。根據(jù)從GeneBank上獲取的實驗動物及其近緣物種已知的DNA條形碼序列，通過DNAMAN軟件進行序列比對，并應用Primer Premier 5.0軟件完成引物設(shè)計，委托寶生物工程（大連）有限公司合成。上游引物5′-CTGCCCATGCCTTTGTGATAATCTT-3′，下游引物5′-ATGGTGGAAGCAGTCAGAAGCT-3′。

1.3 PCR擴增

擴增體系總體積為20μL，其中含有10×PCR緩沖液2 μL、rTaq聚合酶1 U、dNTP Mix 1.5 μL、上下游引物各5μmol及模板100ng。用TP600型梯度PCR儀（日本TaKaRa公司）進行擴增。PCR反應條件：94℃5 min；94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，循環(huán)35次；72℃5min。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測

1.4.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳，0.1% GeneFinder染色，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳譜帶。

1.4.2 DNA測序

利用3730xl基因分析儀（美國AB公司）對11種實驗動物COⅠ基因擴增產(chǎn)物采用循環(huán)測序法進行雙向測序，測得序列用Chromas軟件讀取結(jié)果。

1.5 結(jié)果分析

1.5.1 同源性比對

將實驗結(jié)果所得COⅠ基因擴增產(chǎn)物序列輸入BOLD數(shù)據(jù)庫上進行同源性比對。查看相似度最高的動物是否與本實驗動物種屬來源一致，并根據(jù)最高匹配度判斷樣本種屬與最匹配動物親緣關(guān)系遠近。同種內(nèi)動物同源性較高，均在96%以上；隸屬同一科不同屬的物種其DNA同源性在70%～90%；而分屬不同科的物種同源性較低，65%～70%[1]。

1.5.2 遺傳距離計算

用MEGA 5.0中Kimura雙參數(shù)法計算COⅠ基因DNA測序結(jié)果和標準條形碼序列種內(nèi)和種間遺傳距離。遺傳距離根據(jù)“十倍原則”[2]（變異率小于1%為同一物種，種間距離是種內(nèi)距離10倍以上）確定樣本種屬。

2 結(jié)果

2.1 通用引物擴增有效性檢測

用通用引物擴增本研究包括靈長目、兔形目、偶蹄目、奇蹄目、食肉目在內(nèi)的11種實驗動物的DNA模板，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1所示，所有種屬動物DNA模板均能成功擴增，產(chǎn)物片段長度147bp。

2.2 DNA測序結(jié)果

每種擴增產(chǎn)物均能得到清楚的序列圖譜，用Clutsal X、MEGA 5.0軟件進行序列比對。結(jié)果顯示，11個物種均存在堿基差異，差異位點的位置如圖2所示。

2.3 同源性比對結(jié)果

將本研究所得COⅠ基因擴增產(chǎn)物序列結(jié)果錄入BOLD數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，結(jié)果顯示，各樣本與各種近緣種屬動物同源匹配度中除獅為98.99%外，其他動物均為100%（表1）。

2.4 遺傳距離分析結(jié)果

各種動物的擴增產(chǎn)物序列結(jié)果和數(shù)據(jù)庫中近緣物種數(shù)據(jù)比對后的遺傳距離見表2。結(jié)果顯示，種內(nèi)遺傳距離中獅種內(nèi)遺傳距離為1%，其他動物種內(nèi)遺傳距離均小于1%，食肉目動物種間平均遺傳距離為18.7%，種間遺傳距離為種內(nèi)10倍以上，存在明顯的條形碼間隙。進一步計算實驗動物獅COⅠ基因序列與數(shù)據(jù)庫中亞洲獅、非洲獅的遺傳距離，分別為1%、 4.2%。

表1 實驗動物COⅠ基因擴增產(chǎn)物序列同源性比對結(jié)果

表2 實驗動物和數(shù)據(jù)庫中近緣種屬動物的遺傳距離

3 討論

COⅠ基因全長1659bp，條形碼基因包括一段從COⅠ基因5′端開始的648bp長的序列[3]，片段序列高度保守，已有適合幾乎所有后生動物的通用引物，而且條形碼序列有著豐富的變異位點，在絕大多數(shù)物種中有明顯的條形碼間隙[4]。本研究對毛發(fā)進行種屬鑒定，毛發(fā)檢材由于自身角化，DNA經(jīng)歷高度降解而無法提取出完整的COⅠ基因，需要檢測更短的目的片段，而有研究[5]顯示，全長DNA條形碼鑒別準確度最高，為97%，而5′端100 bp的區(qū)域鑒別度為90%，250 bp區(qū)域為95%。

由于微條形碼序列引物擴增片段較短，在一定程度上限制了通用引物的設(shè)計，而不同于生物分類學，DNA條形碼技術(shù)在法醫(yī)領(lǐng)域中的應用多為對未知檢材的鑒定，因此微條形碼技術(shù)在法醫(yī)鑒定中多采用PCR復合擴增的方法，通過幾對引物復合擴增以獲得目的基因序列。由于檢索數(shù)據(jù)庫亦未能查到可擴增全部實驗動物樣本的微條形碼引物，因此本研究擬設(shè)計覆蓋更多種屬（目、科、屬、種）哺乳動物的COⅠ基因微條形碼引物，為適應法醫(yī)學降解檢材的需要，要求擴增產(chǎn)物片段長度在150bp左右。因此，本研究設(shè)計了擴增片段長度為147 bp的微條形碼通用引物，結(jié)果表明該COⅠ基因通用引物能夠?qū)崿F(xiàn)所有實驗動物COⅠ基因的擴增。

將11種實驗動物COⅠ基因測序結(jié)果在BOLD數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，比對結(jié)果表明，除獅同源匹配度為98.99%外，其他實驗動物均為100%，可初步判斷種屬來源。當同源性比對不能確定種屬來源時，可通過計算遺傳距離，并根據(jù)“十倍原則”[2]進行種屬鑒定。結(jié)果顯示，除獅的種內(nèi)遺傳距離為1%外，其他動物種內(nèi)遺傳距離均小于1%，食肉目動物種間平均遺傳距離為18.7%，種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離10倍，可以進行種屬認定。

實驗動物獅與數(shù)據(jù)庫信息同源匹配度未達100%（98.99%），進一步計算其COⅠ基因序列與數(shù)據(jù)庫中亞洲獅、非洲獅的遺傳距離，分別為1%、4.2%，根據(jù)“十倍原則”，可以認定其為亞洲獅。

有研究[6]表明，同一物種種內(nèi)差異較小，一般小于1%，很少大于2%，而種間差異多大于10%，有時種內(nèi)檢測到較高變異，一方面可能由于被檢個體來源于不同地理隔離的種群，遺傳距離較遠，另一方面線粒體為母系遺傳，存在品種雜交等人為干預時，也可能出現(xiàn)遺傳距離變大的情況。因此條形碼數(shù)據(jù)庫需包括同一種屬不同地域足夠個體數(shù)量的條形碼序列以確保種內(nèi)遺傳距離不被低估。

本研究結(jié)果提示，本實驗設(shè)計的哺乳動物COⅠ基因微條形碼引物能夠用于準確鑒定物種，對野生動物保護及毛皮制品鑒定具有一定應用價值。

[1]Wang ZD，Guo YS，Liu XM，et al.DNA barcoding South China Sea fishes[J].Mitochondr Dna，2012，23（5）：405-410.

[2]Ribeiro AO，Caires RA，Mariguela TC，et al.DNA barcodes identify marine fishes of Sao Paulo State，Brazil[J].Mol Ecol Resour，2012，12（6）：1012-1020.

[3]Hebert P，Ratnasingham S，DeWaard J.Barcoding animal life：Cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc Biol Sci，2003，270（S1）：S96-S99.

[4]Ramadan HA.Sequence of specific mitochondrial 16S rRNA gene fragment from Egyptian buffalo is used as a pattern for discrimination between river buffaloes，cattle，sheep and goats[J].Mol Biol Rep，2011，38（6）：3929-3934.

[5]Meusnier I，Singer GA，Landry JF，et al.A universal DNA mini-barcode for biodiversity analysis[J].Bmc Genomics，2008，9：214.

[6]Avise JC，Walker D.Pleistocene phylogeographic effects on avian populations and the speciation process[J]. Proc Biol Sci，1998，265（1395）：457-463.

Application of COⅠGene Mini-barcoding in Species Identification of Hair

XIA Xi,DING Mei
（School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110000,China）

ObjectiveTo identify the species of mammalian hair using COⅠgene mini-barcoding technology.MethodsA pair of universal primers for mammalian COⅠgene mini-barcoding were designed. The hair DNA samples of experimental animals from 11 species in 5 orders,mammalia was amplified by PCR technology with universal primers,and the PCR products were sequenced by bi-directional DNA and after the sequences splicing the results were deposited into the BOLD database to perform the homology comparison.ResultsThe DNA of hair from all experiment animal species could be totally amplified by the mini-barcoding universal primers designed in this study.The length of amplified fragment was 147 bp.The result of homology comparison in the database showed that the closest matching species were consistent with the experiment animal species.In addition to the matching degree of Panthera leo（98.99%）,all homology matching degree of the other experiment animals were 100%,and the intraspecific genetic distance of Panthera leo was 1%.The interspecific genetic distance was ten times more than the intraspecific genetic distance which could be used for species identification.ConclusionThe COⅠgene mini-barcode technology is established and can provide fast and accurate species identification for hair of mammals.

forensic genetics;hair;species identification;COⅠgene mini-barcoding

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.012

1004-5619（2016）06-0441-03

2015-05-28）

（本文編輯：李成濤）

夏皙（1988—），女，主要從事法醫(yī)遺傳學研究；E-mail：765944359@qq.com

丁梅，女，教授，主要從事法醫(yī)遺傳學研究；E-mail：dingmei1209@qq.com