元小紅, 賀 豐, 江澤輝, 趙 赫, 葉 超, 伍紹明, 于海川, 李春根

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨二科，北京100700;

2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，天津 300073)

大鼠脊髓全橫斷損傷后神經(jīng)源性膀胱模型的建立及評估

元小紅1, 賀 豐2, 江澤輝1, 趙 赫1, 葉 超1, 伍紹明1, 于海川1, 李春根1

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨二科，北京100700;

2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，天津 300073)

目的 建立理想的脊髓損傷(SCI)后神經(jīng)源性膀胱(NB)動物模型并評估脊髓及膀胱狀態(tài)。方法 16只SD大鼠分為對照組(假手術(shù))6只，實驗組(T9脊髓全橫斷損傷大鼠模型)10只，記錄每日實驗組大鼠手法排尿量等情況以評估SCI后NB恢復(fù)情況，術(shù)后2周使用尿流動力學(xué)方法檢測并比較兩組大鼠膀胱內(nèi)壓以評估大鼠膀胱狀態(tài)。結(jié)果 實驗組大鼠術(shù)后1 d、5 d、10 d、13 d、14 d時尿量均明顯高于對照組大鼠(P＜0.05)，術(shù)后16 d實驗組大鼠尿量與對照組無差異(P＞0.05)。術(shù)后一周內(nèi), 大鼠手法輔助排尿量逐漸增加并達到最大。術(shù)后一周后, 大鼠輔助排尿量逐漸減低并于兩周時漸漸穩(wěn)定。對照組及實驗組大鼠在最大膀胱壓、膀胱基礎(chǔ)壓、排尿閾、收縮間隔、膀胱容量、排尿效率的參數(shù)值分別為26.60±4.31 mmH2O、21.66±2.56 mmH2O; 11.66±1.33 mmH2O、14.72±2.65 mmH2O; 20.46±0.52 mmH2O、16.99±0.81 mmH2O; 1.36±1.58 min、2.02±0.36 min; 0.82±0.15 mL、2.20±0.24 mL; 92.67%±1.97%、25.33%±4.46%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 采用T9水平脊髓全橫斷損傷制作的NB大鼠模型可操作性強，易量化、可重復(fù)，在正確積極的術(shù)后護理下并發(fā)癥少、死亡率低。使用術(shù)后SCI大鼠手法排尿量的變化判斷脊髓恢復(fù)情況，并以尿流動力學(xué)方法檢測大鼠在膀胱連續(xù)灌注下的膀胱壓力變化來評價其膀胱狀態(tài)客觀可行。

神經(jīng)源性膀胱(NB); 脊髓損傷(SCI); 動物模型; SD大鼠; 膀胱內(nèi)壓

神經(jīng)源性膀胱(neurogenic bladder，NB)是指控制排尿的中樞神經(jīng)(腦或脊髓)或周圍神經(jīng)受到損害后引起的排尿功能障礙, 它是脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后的常見并發(fā)癥, 易導(dǎo)致SCI患者低下的生活質(zhì)量和較高的病死率[1,2]。SCI后NB是臨床治療難點, 因此建立理想的SCI后NB動物模型，對探索該病病理機制, 探求有效干預(yù)措施，防治尿失禁、腎損傷、尿路感染、結(jié)石等并發(fā)癥發(fā)生的基礎(chǔ), 對提高SCI患者的生活質(zhì)量具有十分重要作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級7周齡雌性SD大鼠16只，體質(zhì)量200～220 g。由維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[SCXK(京)2012-0001], 飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[SYXK(京)2011-0024]。所有大鼠實驗前均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有大鼠脊髓橫斷損傷模型制備均在北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心無菌操作下完成。

1.2 分組及造模方法

對照組6只, 假手術(shù)，僅作背部皮膚肌肉切開并咬開椎板后縫合; 實驗組10只, T9脊髓全橫斷損傷大鼠模型，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9 g/kg烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后，俯臥位固定于平板上，常規(guī)備皮，體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒背部手術(shù)區(qū)域，根據(jù)解剖學(xué)標(biāo)志定位T10椎體。以T10棘突為中心沿背側(cè)正中線做長約2 cm的縱行切口，依次切開皮膚及皮下組織，緊貼椎板切開豎脊肌并向兩邊鈍性剝離，用撐開器撐開肌肉組織，顯露相鄰上下胸椎的棘突和椎板。用手術(shù)刀切開T9～T10棘間韌帶，用微型咬骨鉗自T9～T10椎板間隙緊貼椎板與脊髓平行進鉗，輕輕向上小心咬除椎板，逐漸咬除整個T9椎板及兩側(cè)關(guān)節(jié)突，避免損傷脊髓硬脊膜、血管和神經(jīng)根。尖刀片在顯露的脊髓一端橫向切斷脊髓，刀尖要觸及椎管前壁和側(cè)壁骨面，反復(fù)切割脊髓，即可見大鼠雙下肢抽搐，尾巴甩動并松馳，后以彎頭顯微鑷輕輕抬起脊髓斷端用顯微剪剪斷取出約1～2 mm長的脊髓組織，脊髓內(nèi)縮形成一個空洞，以明膠海綿充分止血并清理切口后填充空洞，逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚。

1.3 術(shù)后護理

術(shù)后大鼠在加熱毯上至蘇醒后放回單籠飼養(yǎng)，每2日更換清潔、干燥墊料，保持籠內(nèi)干燥。術(shù)后1周每日腹腔注射青霉素鈉8萬單位預(yù)防感染。實驗組大鼠每日2次以手法對大鼠進行人工輔助排尿、排便，若大鼠下腹部毛發(fā)潮濕、臟色則以安爾碘擦拭以防褥瘡和自噬。

1.4 膀胱功能評價

1.4.1 術(shù)后輔助排尿量 左手拇指與食指、中指形成環(huán), 自上肢腋窩下水平稍用力抓住大鼠胸部, 使大鼠面向操作者, 右手握住大鼠盆部，右手拇指按壓下腹部, 手法應(yīng)輕柔, 用力合理, 以防擠爆膀胱。在此過程, 下方放置廣口接尿杯, 手法擠壓結(jié)束后，視具體情況分別倒入適應(yīng)大小如5 mL、15 mL離心管以計量大鼠手法輔助排尿量(mL)(圖1)。

圖1 SCI大鼠手法排尿Figure 1 Manual urination of SCI rats

圖2 SCI大鼠膀胱測壓Figure 2 SCI rat cystometry

1.4.2 膀胱壓力測定 造模2周后, 烏拉坦(0.9 g/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠后, 在下腹部中間縱行切開皮膚肌肉暴露膀胱, 在膀胱頂部避開血管以2.5 mL注射器針頭扎1孔, 插入硬膜外導(dǎo)管用4-0針帶線做荷包縫合固定, 導(dǎo)管從腹部引出并固定、以生理鹽水浸潤的紗布覆蓋傷口讓大鼠休息30 min左右。導(dǎo)管經(jīng)三通管分別連接壓力換能器、微量注射泵及注射器(圖2)。將所有連接的管腔及壓力換能器注滿生理鹽水, 保證其中沒有任何氣泡后壓力換能器大氣壓調(diào)零。微量注射泵以0.1 mL/min的速度持續(xù)灌注生理鹽水并使用配套數(shù)據(jù)采集軟件(BIOPAC MP150 AcqKnowledge4.2)記錄膀胱內(nèi)壓力變化曲線, 記錄具體參數(shù): 最大膀胱壓(MP), 膀胱基礎(chǔ)壓(BP), 排尿閾(TP), 收縮間隔(ICI), 膀胱容量(BC)和排尿效率(VE)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

將所有數(shù)據(jù)輸入Excel表格中, 運用 SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，組內(nèi)、組間均數(shù)比較應(yīng)用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

對照組情況良好。實驗組大鼠在造模術(shù)后1 d死亡2只，其余全部存活。麻醉清醒后，其余實驗大鼠均只能以前肢行走，后肢屬于拖行狀態(tài)不能參與行走，說明SCI大鼠造模成功。術(shù)后第1周實驗組大鼠膀胱明顯脹大，不能自行排尿, 給大鼠手法排尿時，有的大鼠剛被抓提即開始排尿，同時伴隨排便障礙，有些可出現(xiàn)腸脹氣; 活動減少，不思飲食，體質(zhì)量明顯減輕，部分大鼠后肢可出現(xiàn)嚴(yán)重紅腫及褥瘡。術(shù)后第2周實驗組大鼠膀胱脹大不明顯，可見下腹部及籠內(nèi)墊料潮濕; 約2周后，大鼠后肢運動功能逐漸恢復(fù)。

2.2 排尿量

實驗組大鼠術(shù)后1 d、5 d、10 d、13 d、14 d時尿量均明顯高于對照組大鼠(P＜0.05), 術(shù)后16 d實驗組大鼠尿量與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)(表1)。

2.3 膀胱壓力測定檢查

與對照組相比，實驗組大鼠的最大膀胱壓(MP)、排尿閾(TP)較低，膀胱基礎(chǔ)壓(BP)較高，膀胱容量(BC)較大，收縮間隔(ICI)較長，排尿效率(VE)降低(均P＜0.05)(表2)。

表1 兩組實驗動物術(shù)后尿量Table 1 Comparison of manual urination output in the two groups of rats mL

表2 兩組大鼠膀胱壓力測定結(jié)果Table 2 Comparison of cystometric parameters in the two groups of rats

3 討論

臨床上，造成NB的病因繁多，包括脊髓與顱腦外傷、先天性疾病如神經(jīng)管閉合不全、其他疾病或藥物作用等，其中SCI是最常見的病因[3]。目前，SCI模型大致可分為脊髓挫傷、脊髓壓迫損傷、缺血再灌注損傷、橫斷損傷、化學(xué)損傷和脊髓火器傷等。而1911年由Allen首次提出的重物墜擊挫傷模型是制作大鼠SCI的主要方法。此方法的優(yōu)點為較接近臨床實際，然而此種方法損傷區(qū)域不恒定，癱瘓程度和持續(xù)時間不統(tǒng)一，并且存在部分動物術(shù)后脊髓功能恢復(fù)的情況，因此損傷后對于膀胱的影響不夠穩(wěn)定。根據(jù)SCI后NB的研究目的來看，本實驗采用的脊髓橫斷損傷較為適宜。該方法將脊髓全部橫斷，手術(shù)操作簡單、傷口整齊直觀、損傷穩(wěn)定、其癱瘓癥狀直接歸因于脊髓橫斷損傷。本結(jié)果尚有不足之處，當(dāng)大鼠脊髓被完全破壞后，繼發(fā)性脊髓感染等并發(fā)癥也隨之增多，使得動物的術(shù)后護理更加困難。因此，脊髓全橫斷損傷后模型動物的護理成為降低模型動物死亡率的關(guān)鍵。在預(yù)實驗的反復(fù)摸索中，作者認(rèn)為術(shù)中應(yīng)嚴(yán)格加強無菌操作，以可吸收性明膠海綿充分止血后留置明膠海綿填充脊髓缺損處，牢固縫合切口，術(shù)后1周每日注射青霉素鈉，每日按時定點手法按摩排尿，經(jīng)常更換墊料，保持臥處干燥柔軟防褥瘡等術(shù)后護理措施，都能增加SCI后NB動物模型的成功率。

本實驗采取T9水平脊髓完全橫斷，既中斷了上位排尿中樞對于膀胱的調(diào)控，又保留了骶髓排尿中樞及相應(yīng)支配器官間神經(jīng)反射的完整性。若損傷平面過高則可影響心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，增加動物術(shù)中死亡率; 若損傷平面過低可能會損傷骶髓的相關(guān)排尿中樞, 則影響因素較復(fù)雜不易控制。這與大多文獻報道中，胸位脊髓橫斷法選用T8～T10節(jié)段相符，但本實驗中采取直接切除T9節(jié)段約1～2 mm不同于大部分報道中為提高成活率以尖刀直接切斷而不移除。本實驗移除脊髓組織能夠保證損傷的完全，并且在脊髓缺失的空洞處填充明膠海綿能夠阻斷脊髓一定的自愈。因此，大鼠T9水平完全橫斷損傷模型，手術(shù)操作簡易，重復(fù)性好，損傷程度較恒定，解剖定位準(zhǔn)確，成模率較高，適于研究上位排尿中樞損傷后的膀胱功能障礙的康復(fù)治療。

SCI后NB主要存在三個問題: ①逼尿肌機能低下;②逼尿肌亢進; ③逼尿肌-括約肌協(xié)同失調(diào)(DSD)[4]。SCI后脊髓即進入休克期，橫斷面以下的神經(jīng)活動消失，膀胱出現(xiàn)前兩個問題，處于無反射、無收縮狀態(tài)，尿液充盈，主要表現(xiàn)為尿潴留，有時出現(xiàn)嚴(yán)重的過度充盈而發(fā)生充盈性尿失禁[5,6]。同時當(dāng)脊髓反射逐漸恢復(fù)，脊髓內(nèi)控制膀胱的神經(jīng)開始恢復(fù)活動，由于失去了橫斷面以上的神經(jīng)控制，故此時膀胱的脊髓內(nèi)神經(jīng)控制出現(xiàn)紊亂，表現(xiàn)為逼尿肌-尿道括約肌失調(diào)，膀胱呈痙攣性，出現(xiàn)貯尿和排尿功能的雙重障礙。實驗組大鼠在術(shù)后立即出現(xiàn)尿潴留，大鼠的尿量變化符合SCI后NB脊髓休克期及休克恢復(fù)期膀胱排尿功能變化的趨勢。而本實驗中未觀測到脊髓休克恢復(fù)期后典型的反射性尿失禁，這說明對于膀胱支配神經(jīng)的破壞已完全。因此，據(jù)術(shù)后大鼠尿量的變化及統(tǒng)計結(jié)果表明，術(shù)后7 d內(nèi)為脊髓休克期，術(shù)后7-14 d為脊髓休克恢復(fù)期，并且術(shù)后14 d后宜開始干預(yù)措施。這將為進一步研究介入治療的干預(yù)時間選擇提供依據(jù)。

尿動力學(xué)檢查是膀胱和尿道疾病診斷中一個非常重要的方法[7]，被國際尿控協(xié)會定義為“是對下尿路的生理和尿液運動流體力學(xué)的研究”[8]。小動物(如大鼠)的尿動力學(xué)檢查，是研究排尿期障礙病理生理學(xué)及下尿路藥物作用的基礎(chǔ)。鑒于條件的限制及動物生理特點等原因，本實驗只選取膀胱內(nèi)壓測定用于評價膀胱功能的變化。實驗顯示, 術(shù)后2周時，膀胱基礎(chǔ)壓高而排尿閾及最大膀胱壓下降，表明SCI大鼠儲尿和排尿功能均出現(xiàn)了障礙，造成較低的排尿效率。如前所述，術(shù)后2周則SCI大鼠主要表現(xiàn)為DSD，痙攣性膀胱; 而長期的尿潴留引起膀胱壁充血、水腫等炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致膀胱壁增生，膀胱容量增大。這與SCI后NB的生理病理過程相符合的,也與報道中相關(guān)尿動力學(xué)檢查結(jié)果相一致[9,10]。

綜上所述，本研究參考大量國內(nèi)外文獻，并經(jīng)過反復(fù)的預(yù)實驗，采取的脊髓全橫斷損傷制作NB模型，重復(fù)性好，損傷恒定，定位明確。而且總結(jié)出較完備的動物術(shù)后護理，降低死亡率及并發(fā)癥的發(fā)生率，提高了動物的成模率。通過術(shù)后SCI大鼠手法排尿量的變化判斷出術(shù)后7 d內(nèi)為脊髓休克期，術(shù)后7～14 d為脊髓休克恢復(fù)期，為進一步研究介入治療的干預(yù)時間選擇提供依據(jù)。通過比較兩組大鼠的尿流動力學(xué)參數(shù)評估其膀胱狀態(tài)證實模型成功，為膀胱重建的研究提供了一定的基礎(chǔ)。

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Establishment and Evaluation of Rat Model of Neurogenic Bladder after Spinal Cord Transection Injury

YUAN Xiao-hong1, HE Feng2, JIANG Ze-hui1, ZHAO He1, YE Chao1, WU Shao-ming1, YU Hai-chuan1, LI Chun-gen1
(1. Second Department of Orthopaedics, Dongzhimen Hospital Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2. Department of Orthopaedics, The First Hospital Affiliated to Tianjin University of Chinese Medicine, Tianjin 300073, China)

ObjectiveTo establish the ideal animal model of neurogenic bladder (NB) after spinal cord injury (SCI) and evaluate and the state of the bladder.MethodsSixteen female SD rats were divided into control group and the experimental group (T9 spinal cord transection injury model), according to the record of the daily manual urination output to evaluate the NB recovery after SCI. After two weeks the simultaneous recording of the intravesical pressure were used to detect, compare and assess the state of bladders in two groups.ResultsThe urine output of experimental rats at first day, 5thday, 10thday, 13thday, 14thday after operation were significantly higher than thoes of control group rats (P＜0.05), and the urine output of experimental rats at 16thday after operation was no statistically significant difference with control group (P＞0.05). During a week postoperation, the daily manual urination output increased and reached maximum. One week later postoperation, the daily manual urination output was on the gradually decrease and stable for two weeks. The values of the parameters of the maximum bladder pressure, the basis bladder pressure, voiding threshold, bladder capacity, voiding efficiency in control group and experimental group respectively were 26.60±4.31 mmH2O and 21.66±2.56 mmH2O, 11.66±2.33 mmH2O and 14.72±2.56 mmH2O, 20.46±0.52 mmH2O and 16.99±0.81 mmH2O, 1.36±1.58 min and 2.02±0.36 min, 0.82±0.15 mL and 2.20±0.24 mL, 92.67%±1.97% and 25.33%±4.46%, the differences were statistically significant (P＜0.05).ConclusionThe NB rat model of T9 level spinal cord transection injury with a strong maneuverability and easy to quantify, repeatable. With the correct postoperative nursing care, there were fewer complications and low mortality. The recording of daily manual urination output and the intravesical pressure can be the good ways to detect the spinal cord recovery and evaluate the status of the bladder.

Neurogenic bladder (NB); Spinal cord injury (SCI); Animal models; Sprague-Dawley rats; Cystometric

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0423-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.004

2016-07-06

元小紅(1987-), 女, 博士研究生, 研究方向: 脊髓損傷與關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)。E-mail: zhenjiuyuan@126.com

李春根, 主任醫(yī)師。E-mail:leechungen@126.com