丁廣宇, 潘綿立, 胡 寒, 劉 藝, 沈龍海

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院,上海市生物物質(zhì)成藥性評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺, 上海 200437)

三種飼料建立大鼠缺鐵性貧血模型的比較

丁廣宇, 潘綿立, 胡 寒, 劉 藝, 沈龍海

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院,上海市生物物質(zhì)成藥性評價專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺, 上海 200437)

目的 探討三種不同飼料配方對建立Wistar大鼠缺鐵性貧血模型的影響。方法 將3～4周齡Wistar大鼠分為4組，即A、B、C和正常對照組， A、B、C組分別飼喂3種不同配方飼料,正常對照組飼喂正常飼料。實(shí)驗(yàn)持續(xù)35 d, 實(shí)驗(yàn)期間每周稱量各組大鼠體質(zhì)量及攝食量同時觀察大鼠行為、外觀體征等變化。35 d后取血, 檢測相關(guān)血常規(guī)指標(biāo)包括血紅蛋白(Hb)含量、紅細(xì)胞壓積等。結(jié)果 A組大鼠Hb含量降到90 g/L以下, 且行為和體態(tài)表現(xiàn)也符合缺鐵貧血特征, 達(dá)到造模要求; B組大鼠Hb含量沒有降低; C組大鼠Hb含量有所降低, 但未達(dá)到90 g/L以下。結(jié)論 A組飼料配方可以成功建立大鼠缺鐵性貧血模型，B、C組配方均不適用于缺鐵性模型的建立。

缺鐵性貧血; Wistar大鼠; 血紅蛋白(Hb)

鐵是機(jī)體內(nèi)多種重要活性大分子的組成部分,尤其是紅細(xì)胞中的血紅蛋白, 當(dāng)機(jī)體對鐵的攝入失衡, 將導(dǎo)致體內(nèi)(如肝臟)的貯存鐵耗盡(iron deleption, ID),隨后紅細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏(iron deficiency, IDE), 血紅蛋白合成降低, 最終引起缺鐵性貧血(iron deficiency anemia, IDA)。IDA是鐵缺乏癥(包括ID, IDE和IDA)的最終階段，表現(xiàn)為細(xì)胞中含鐵酶和鐵依賴酶的活性降低，進(jìn)而影響患者的精神、行為、體力、免疫功能，其發(fā)病率在發(fā)展中國家、經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)偏高，常見于嬰幼兒和育齡婦女[1]。

目前針對這一疾病的藥理學(xué)研究, 多采用大鼠構(gòu)建IDA模型。建模方法有定期放血或者飼喂低鐵飼料，這兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn): 剪尾放血成本低，但方法操作煩雜，而且建立的模型容易產(chǎn)生失血反應(yīng)，不易成模，且非單純的缺鐵性貧血。后者雖方法簡單，但對飼料質(zhì)控要求嚴(yán)，成本較高，且大鼠容易產(chǎn)生排斥[2]。因此開發(fā)簡單易行的造模方法，對于該疾病的研究及藥物篩選具有重要意義。

缺鐵性貧血形成的主要原因是鐵的攝入量不足、吸收障礙和丟失過多。草酸存在于很多植物中，攝入的草酸在腸胃道與可溶性鐵離子形成難溶性絡(luò)合物，從造成鐵的吸收障礙[3]，與其相似，四環(huán)素與鐵離子相互作用時也能形成復(fù)雜的難溶性復(fù)合物從而影響鐵的吸收。本試驗(yàn)用A配方即缺鐵飼料和添加了草酸(B配方)和四環(huán)素(C配方)的正常飼料，考察不同飼料對于IDA造模的影響。通過比較三組飼料配方的大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果，旨在尋找簡易、有效的建立大鼠貧血模型方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

3～4周齡清潔級雌性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量70～75 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供[SCXK(滬)2012-0002]，飼養(yǎng)于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施[SYXK(滬)2014-0018]。

1.2 生化試劑和儀器

草酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號: 20150708; 四環(huán)素，北京賽孚制藥股份有限公司，批號獸藥字(2012)010281345; 飼料顆粒機(jī)/SKJ-120，上海漢丁機(jī)械科技有限公司; 動物血液分析儀/HEMAVET 950，英國Drew Scientific公司。

1.3 飼料

飼料配方A，由江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供[4]; 基礎(chǔ)粉料和顆粒料，由上海普路騰生物科技有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將40只Wistar大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為飼喂相對應(yīng)配方飼料的A、B、C組，以及飼喂正常飼料的正常對照組D。用苦味酸標(biāo)記編號放入籠內(nèi)，每籠5只。

配方A: 玉米淀粉(529.5 g/kg)、蛋清蛋白(200.0 g/kg)、蔗糖(100.0 g/kg)、玉米油(70.0 g/kg)、纖維素(50.0 g/kg)、混合礦物鹽(AIN-93G-MX) (35.0 g/kg)、混合維生素(AIN-93G-VX)(10.0 g/kg)、L-胱氨酸(3.0 g/kg)、氯化膽堿(2.5 g/kg)，配方來自SFDA有關(guān)大鼠缺鐵性貧血實(shí)驗(yàn)方案[4]。

配方B: 標(biāo)準(zhǔn)飼料粉料, 添加草酸(850 mg/kg)。設(shè)計(jì)依據(jù)為: 草酸的大鼠LD50為7 500 mg/kg, 根據(jù)蘭州大學(xué)化工學(xué)院分析測試中心用火焰法測得一般正常清潔級大鼠飼料中鐵的含量為0.05%左右[5]，草酸和鐵離子等摩爾數(shù)絡(luò)合，根據(jù)大鼠每日攝食量約20 g換算，每只大鼠每日需要17 mg草酸，該數(shù)值低于其LD50，混合添加于粉狀飼料中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥深w粒飼料機(jī)制粒。

配方C: 標(biāo)準(zhǔn)飼料粉料, 添加四環(huán)素(800 mg/kg),劑量設(shè)計(jì)依據(jù)為: 四環(huán)素的大鼠LD50為800 mg/kg,成人口服劑量0.2～0.5 g/d, 6 h一次, 約每日30 mg/kg,折算成大鼠以200 mg/kg計(jì)，實(shí)驗(yàn)時大鼠體質(zhì)量為80 g，給藥總量為16 mg，經(jīng)過換算足夠絡(luò)合飼料中的鐵離子，且低于LD50，混合入粉狀飼料中，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥娠暳项w粒劑制粒。

所有大鼠都飲用滅菌自來水, 實(shí)驗(yàn)持續(xù)35 d，每日觀察大鼠毛色、活動和消化狀況，每周一測量每組大鼠體質(zhì)量計(jì)算平均每只大鼠體質(zhì)量，每周加入一定量飼料，通過稱量飼料剩余量，來計(jì)算該周(7 d)平均每只大鼠每日的攝食量。

同時觀察大鼠行為體態(tài)變化。35 d后取血，用全自動血清分析儀測定血清中的血紅蛋白含量(Hb)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、 紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)、 紅細(xì)胞平均容積(MCV)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外觀體征、活動狀態(tài)、糞便形狀

A組大鼠飼喂低鐵飼料1～2周后大鼠活動減少，2～3周后，毛色粗糙失去光澤，有稀疏感，耳部和四肢皮膚相對于正常大鼠顯青色。個別大鼠見頸部毛發(fā)脫落。糞便與正常大鼠相比顯黃色，較稀，有惡臭。造模3周后體質(zhì)量減輕，飲食未見減少。B組大鼠第1周對飼料排斥，好動狂躁，第2周后逐漸穩(wěn)定。毛色和糞便正常。C組大鼠未見異常，活動狀態(tài)和正常對照組大鼠相似。

2.2 各組大鼠攝食量比較

實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠攝食量呈上升趨勢，但是各組上升趨勢不同。A配方組大鼠攝食量低于正常組且在第3周后有顯著差異(P＜0.05)。B配方組大鼠攝食量從第1周開始就明顯低于正常組和C配方組(P＜0.05)。C配方組大鼠攝食量與正常組近似，與A、B兩組差異顯著(P＜0.05)(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠平均每日飼料攝食量 g /d

2.3 各組大鼠體質(zhì)量比較

各組的體質(zhì)量增長趨勢不同。正常組體質(zhì)量增長最快, 5周后體質(zhì)量也高于其它3組。A組大鼠體質(zhì)量低于正常組大鼠在第3周后有顯著差異(P＜0.05)。第4周起，B配方組大鼠體質(zhì)量增長明顯低于正常組(P＜0.05)。C組體質(zhì)量增長與正常組近似，與A、B組有顯著差異(P＜0.05)(表2)。

2.4 血液指標(biāo)

A組大鼠Hb、HCT、MCH含量均明顯降低，其中Hb值30 d后降低到78.6 g/L左右，與正常組有顯著差異(P＜0.05)。B組Hb值以及其它指標(biāo)與正常組比較近似。C組大鼠Hb為128.6 g/L,低于正常組，但高于A組(P＜0.05)(表3)。

表2 大鼠體質(zhì)量變化 g

表3 各組大鼠部分血液指標(biāo) g/L

3 討論

A組大鼠在造模3周后出現(xiàn)貧血癥狀，主要表現(xiàn)為體型瘦小，被毛粗糙，失去光澤，有稀疏感，耳部和四肢皮膚相對于正常大鼠顯青色。部分大鼠脖頸部皮毛出現(xiàn)脫落現(xiàn)象, 這可能是貧血造成的皮膚潰瘍。A配方組大鼠Hb值降低到78.6 g/L左右，相對于正常組有顯著性差異, 且低于90 g/L, 大鼠表現(xiàn)的行為體態(tài)特征也有助于判斷為IDA，兩個特征均與原文獻(xiàn)報(bào)道[3,6]相符即A組造模成功，提示A配方低鐵飼料能夠快速建立大鼠缺鐵性貧血模型; B配方組大鼠Hb值為169.6 g/L，與正常組的172. 3 g/L差異不顯著，表明草酸并不能實(shí)質(zhì)性減少鐵吸收，影響血紅蛋白的含量?？赡茉蚴遣菟犭m然降低二價鐵的吸收，但是會同時促進(jìn)三價鐵的吸收，因此并不會影響鐵元素的攝入量, 導(dǎo)致造模失敗[7]。C組大鼠與正常組大鼠比較，各項(xiàng)活動體征相似, 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠平均Hb值為128 g/L，較正常組有所降低，但未降低到100 g/L以下，達(dá)不到造模的要求。這可能是因?yàn)樘砑铀沫h(huán)素的劑量不足，有待進(jìn)一步研究。缺鐵時，紅細(xì)胞合成血紅蛋白量減少，致使紅細(xì)胞體積變小，所以營養(yǎng)性貧血大鼠的Hb減少，同時HCT值也降低，紅細(xì)胞數(shù)量并沒有變化。而A配方組大鼠Hb和HCT遠(yuǎn)低于正常對照組(P＜0.05), 符合缺鐵性貧血特征。此外, 有文獻(xiàn)報(bào)道[8], 在進(jìn)行貧血大鼠造模時, 應(yīng)該飼喂去離子水, 以防止外界鐵離子干擾。本實(shí)驗(yàn)造模過程中使用的是滅菌后的自來水，對造模結(jié)果影響不明顯，這是因?yàn)榈丸F飼料中的鐵離子含量大約8.01 mg/kg, 而自來水中的鐵離子含量為0.3 mg/L,低鐵飼料中的鐵含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于自來水中鐵離子含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明滅菌后的自來水對于單純造模沒有影響。

綜上所述，經(jīng)典的缺鐵性貧血模型造模方法不論是在造模時間，還是造模效果上都表現(xiàn)非常出色，但是由于對它的飼料配方有嚴(yán)格要求，所以模型不易制備，此外單一的造模方法對于一種疾病而言并不具有說服力，因此，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了不同飼料配方的研究，盡管結(jié)果不甚滿意，但是獲得了一些經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，為下一步建立新的貧血模型打下了一定基礎(chǔ)。

[1] Xiao C, Lei X, Wang Q, et al. Effects of a tripeptide iron on iron-deficiency anemia in rats[J]. Biol Trace Elem Res, 2016, 169(2):211-217.

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[3] 張琪, 徐達(dá)道. 膳食中鐵吸收及其影響因素[J]. 國外醫(yī)學(xué):衛(wèi)生學(xué)分冊, 1986, 13(3):149-151.

[4] 國食藥監(jiān)?；痆2012]107號. SFDA改善缺鐵性貧血功能評價方法[S], 2012.

[5] 葛可佑. 中國營養(yǎng)科學(xué)全書[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2004:665- 668.

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Comparative Study on Iron Deficiency Anemia Rats Model by Three Different Formula Feeds

DING Guang-yu, PAN Mian-li, HU Han, LIU Yi, SHEN Long-hai
(China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai Professional and Technical Service Center for Biological Material Druggability Evaluation, Shanghai 200437, China)

Objective To explore the effect on iron deficiency anemia rat model induced by 3 different formula feeds.MethodWistar rats at age of 3～4 weeks were randomly divided into 4 groups: group A, group B, group C and control group. The groups A, B, C were fed with 3 different formula feeds respectively, and control group was fed with normal feed. Experiment lasts for 35 days, the body weight and food intake of rats in each group were measured every week. Meanwhile, behavior and appearance sign was noted during the experiment. Rat’s blood was collected and tested after 35 days, including hemoglobin, hematocrit, etc. ResultsHemoglobin(Hb) concentration of group A decreased to 90 g/L and morphological features met the requirments. Hb in group B did not decrease; Hb in group C decreased a little but no less than 90 g/L. ConclusionThe formular A feed can establish iron deficiency anemia model successfully, formula B and C are not applicable for the model building.

Iron deficiency anemia; Wistar rats; Hemoglobin(Hb)

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0433-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.006

2016-08-02

丁廣宇(1992-), 男, 碩士研究生, 研究方向: 方向?yàn)槊庖咚幚韺W(xué)。E-mail: 1293032013@qq.com

沈龍海(1963-), 男, 碩士生導(dǎo)師, 研究方向: 免疫藥理學(xué)與腫瘤藥理。E-mail: shenlh28@163.com