孔慶柱, 楊佳寧, 王賀龍, 趙勝軍, 孔素紅, 趙佳林, 金 宇(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷小兒骨科, 承德 067000)

三種處理方法對兔慢性骨髓炎病灶骨殺菌效果初探

孔慶柱, 楊佳寧, 王賀龍, 趙勝軍, 孔素紅, 趙佳林, 金 宇
(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷小兒骨科, 承德 067000)

目的 研究蒸餾水煮沸、碘伏沖洗及抗生素沖洗三種方法對感染金黃色葡萄球菌兔脛骨慢性骨髓炎的殺菌效果。方法 建立兔脛骨慢性骨髓炎模型，將模型兔隨機分成3組，分別截取病骨，然后編號，做不同處理。A組: 用碘伏原液沖洗30 min; B組: 蒸餾水煮沸30 min; C組: 抗生素(對金葡菌敏感)沖洗，隨機取部分處理后的病骨分別進行細菌學(xué)培養(yǎng), 放置于標準培養(yǎng)皿培養(yǎng)48 h，綜合兩者結(jié)果，以髓腔內(nèi)容物病理學(xué)檢測及培養(yǎng)后菌落數(shù)為金標準，比較3種方法的殺菌效果。結(jié)果 1)3組處理方法均不會對病骨造成質(zhì)破壞，均能保持良好的形態(tài)相容性; 2)高倍鏡下觀察3組培養(yǎng)基平均菌落數(shù): 蒸餾水組＜碘伏組＜抗生素組; 3)病理學(xué)檢測，蒸餾水煮沸組無明顯成骨細胞，處理后幾乎成為死骨組織。結(jié)論 3種不同方法對兔脛骨慢性骨髓炎都有滅菌效果，碘伏浸泡方法更具優(yōu)勢。

慢性骨髓炎; 兔; 煮沸; 碘伏; 抗生素

慢性骨髓炎(chronic osteomyelitis, CO)是骨組織的慢性感染, 可源于血液細菌種植、局部軟組織感染, 也可源于創(chuàng)傷時細菌直接種植導(dǎo)致的急性骨組織感染, 特別是現(xiàn)代社會節(jié)奏快, 外傷、交通事故傷等高能量損傷較以前更為常見[1], 導(dǎo)致CO的發(fā)生率有所上升，且治療難度更是居高不下。另一方面，在偏遠地區(qū)或地方小醫(yī)院, 通常因急救意識缺乏或薄弱、清創(chuàng)不徹底而形成死骨、竇道、死腔及病變?nèi)庋拷M織易導(dǎo)致CO反復(fù)發(fā)作。目前臨床上普遍公認對于CO治療方法為徹底清創(chuàng)、髓腔含抗生素液體灌洗療法以及全身靜點抗生素4～6周, 但這種方法需要高的血藥濃度為基礎(chǔ); 其他改良方案包括病灶清除+置管持續(xù)沖洗及徹底病灶骨清除后, 抗生素鏈骨髓泥填塞。但臨床上結(jié)果往往是由急性骨髓炎轉(zhuǎn)變?yōu)镃O或CO反復(fù)發(fā)展, 遷延不愈, 病程時間可以持續(xù)數(shù)月甚至數(shù)年, 且反復(fù)發(fā)作。有報道[2,3]復(fù)發(fā)率達20%～30%, 且容易伴隨致病菌反復(fù)感染及細菌耐藥[4]。對個人及家庭造成嚴重的心理及經(jīng)濟負擔(dān)以及醫(yī)療資源的大量浪費。本實驗在確診為兔CO脛骨模型成功的條件下, 比較碘伏浸泡、蒸餾水煮沸及抗生素沖洗3種不同的滅菌效果, 為臨床上對治療CO尤其是在徹底清創(chuàng)后滅菌方法的選擇上提供可靠根據(jù)[5], 從而可減少CO漫長治療時間。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級新西蘭白兔100只，2～3月齡，體質(zhì)量2～2.5 kg, 雄性44只，雌性56只，由承德醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供[SCXK(冀)2015-0100], 飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境下(承德醫(yī)學(xué)院動物實驗中心)[SCXK(冀) 20014-0012]。

1.2 菌株、試劑和儀器

金黃色葡萄球菌，菌株ATCC29523， 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科室提供; 5%魚肝油酸鈉，上海金珠藥業(yè)有限公司; 解剖常規(guī)器械，河北承德附屬醫(yī)院動物中心實驗室; 標準比濁管等。

1.3 兔脛骨骨髓炎模型制作

參考聞一新等[6]方法制備兔脛骨慢性骨髓炎模型: 新西蘭白兔術(shù)前適應(yīng)性飼養(yǎng)2周，用3%戊巴比妥液按1 mL/kg在耳緣靜脈注入, 麻醉滿意后, 右側(cè)脛骨備皮后, 取內(nèi)側(cè)縱長約4 cm切口, 鈍性剝離約2 cm×2 cm大小的骨膜，制成一個約1 cm× 1 cm的圓形的骨缺損即骨窗; 取培養(yǎng)完畢后的金黃色葡萄球菌用接種環(huán)將菌體刮下，選取標準比濁管作為濃度標準參考物, 參考6號標準管(106cfu/mL),用滴定管吸取質(zhì)量分數(shù)0.9%生理鹽水予以滴定，制成濃度為1×106cfu/mL金黃色葡萄球菌液1 mL,用一次性滴定管吸取0.5 mL金黃色葡萄球菌液從骨窗內(nèi)向髓腔內(nèi)沿遠近端注入，再向骨窗內(nèi)沿遠近端注射0.5 mL的5%魚肝油酸鈉，逐層縫合皮膚。待麻醉效果消失后回籠常規(guī)喂飼養(yǎng)。此整個過程中因麻醉致死2只，術(shù)后細菌感染死亡3只，術(shù)后4周均出現(xiàn)不同程度發(fā)熱, 精神差, 進食少等骨髓炎后的臨床表現(xiàn), 依據(jù): ①拍X線片觀察到90只兔右脛骨手術(shù)部位有慢性化膿性骨髓炎表現(xiàn): 骨質(zhì)破壞，增生的骨痂，且有死骨形成(圖1A)與未成功造模有明顯區(qū)別(圖1B); ②肉眼觀察均呈現(xiàn)出局部軟組織腫脹，可伴有破潰; 檢測表明90只兔均滿足要求, 可作為兔脛骨骨髓炎模型做下一步實驗。

1.4 模型兔分組及處理

將造模成功的90只兔隨機分為隨機標90個號碼，應(yīng)用空氣栓塞法處死兔后分別取出右脛骨骨髓炎病骨, 每段都包含著病變脛骨及肉眼觀察無明顯改變的脛骨0.5 cm，總共90例，采用隨機數(shù)表法,分為A、B、C三組, 每組30例。整個過程嚴格遵守隨機分配原則。A處理組: 取1個100 mL燒杯倒入50 mL蒸餾水, 蒸餾水達到沸點, 接著將A組的30例CO兔脛骨截取2 cm, 要求完整包含病骨的脛骨且要部分正常骨組織, 分別置于50 mL蒸餾水的燒杯中30 min。依照此法重復(fù)B處理組: 取30個無菌換藥包, 將新啟碘伏原液倒?jié)M無菌彎盤內(nèi), 按上訴方法截取病骨, 置入無菌彎盤內(nèi), 反復(fù)充分沖洗約30 min, 完畢后用質(zhì)量分數(shù)0.9%生理鹽水100 mL徹底沖洗, 立即取標本做細菌學(xué)培養(yǎng)實驗; C處理組:取出病骨后, 使用8萬單位慶大霉素溶于500 mL生理鹽水制成抗生素溶液, 1～3 d每日沖洗6 L, 3～9 d沖洗3 L, 10～14 d沖洗1.5 L, 充分灌洗病骨, 取最后一次沖洗完后病骨應(yīng)用0.9%生理鹽水沖洗，各取標本，與其他2組一樣行細菌培養(yǎng)及病理學(xué)檢查。

1.6 細菌培養(yǎng)

標本取自病變局部滲出物、膿液或處理后病灶骨碎屑, 無菌技術(shù)取材后立即送細菌室( 間隔時間不超過2 h)。常規(guī)培養(yǎng)皿35 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

1.7 病理學(xué)檢查

處理后的標本制成切片后立即做病理學(xué)檢查。

圖1 兔脛骨X線片

1.8 觀測指標

大致觀測: 觀察三組處理完后兔脛骨有無破損、皮質(zhì)斷裂等，確定3種處理方法對其有無物理破壞; 細菌學(xué)培養(yǎng): 3個組實驗兔病骨周圍組織于標準培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)48 h，在單位面積下觀察菌落數(shù)，以此為金標準; 病理學(xué)檢測: 3組實驗兔病骨周圍組織進行病理學(xué)檢測，根據(jù)各組病理檢查結(jié)果比較3種不同方法滅菌效果。

1.9 統(tǒng)計方法

采用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件, 計量數(shù)據(jù)以均數(shù)，標準差±s描述, 組間比較采用t檢驗, P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

三組方法處理后, 均未出現(xiàn)骨質(zhì)破壞, 均能保持較好的形態(tài), 與原脛骨均有很好的形態(tài)相容性。

2.2 細菌學(xué)培養(yǎng)

A組骨缺損周圍組織細菌培養(yǎng)結(jié)果都為陰性，陽性率為0%，B組細菌培養(yǎng)結(jié)果4例陽性，陽性率為13.33%(4/30)。C組11例為陽性，其余均為陰性，陽性率為36.67%(11/30)，兩兩比較差異均有顯著性(t 值分別為4.29, 13.47和4.35, P＜0.05)。

圖2 兔脛骨病理學(xué)觀察

2.3 病理學(xué)觀察

A處理組在HE染色下(圖2A)顯示全為死骨形成, 個別標本可見少量成骨細胞，未見嗜酸性粒細胞等炎癥細胞存在，死骨形成區(qū)域呈片狀或條帶狀，成骨細胞呈零星點狀分布，未見明顯分布規(guī)律; B處理組在HE染色下(圖2B)有4例標本表現(xiàn)為大塊區(qū)域的嗜酸性粒細胞浸潤，面積較大, 組織輕度水腫，其余標本中未見明顯炎癥細胞浸潤, 且成骨細胞較多且密; C處理組在HE染色下(圖2C), 其中11例可見大面積中性粒細胞及炎癥細胞浸潤，面積較B組大，覆蓋區(qū)域更廣伴部分死骨形成，少量成骨細胞呈點狀存在。正常骨組織未見明顯炎細胞浸潤影, 組織間無水腫(圖2D)。

3 討論

臨床上因CO遷延難愈、反復(fù)發(fā)作、易于耐藥，被人稱作“不死癌癥”，近年來發(fā)病率有上升趨勢[7], 清創(chuàng)后抗生素灌洗是此病的經(jīng)典治療方法，國內(nèi)外專家對CO開展了很多研究，提出過許多治療思路及方式: 從全身用藥到局部應(yīng)用，藥物治療和沖洗、肌瓣填塞、骨搬移等特殊手段的聯(lián)合應(yīng)用，到目前為止效果均欠佳[7]。目前臨床應(yīng)用抗生素沖洗已趨于淘汰[8]，人們逐漸關(guān)注使用碘伏，因為碘伏灌洗可在短時間內(nèi)滲入死腔、病骨及周圍瘢痕組織，快速、徹底殺滅殘存其中的細菌，更能突破應(yīng)用抗生素治療所不能破壞的“細菌保護傘”，形成殺菌膜，通過產(chǎn)生游離碘，進而細胞膜被氧化而失活。此外碘伏對局部組織如神經(jīng)、肌肉、血管等無明顯刺激和破壞，但碘伏對正常生物組織仍有一定的毒性作用[9]。本實驗結(jié)果顯示碘伏具有良好的殺菌效果，且病灶骨依然具有良好的成骨能力，特別是CO的中后期往往病灶骨較大，CO病骨殺菌原位移植技術(shù)可以發(fā)揮巨大作用。貝朝涌等[10]在研究感染骨滅活原位移植治療CO中，提到感染骨滅活原位移植后移植骨與截骨斷面間隙有血管長入，散在發(fā)育骨小梁和大量軟骨細胞團形成。上述學(xué)者結(jié)論再結(jié)合本次實驗，可知煮沸殺菌法固然具備極強的殺菌能力，但不可避免造成大量死骨，不利于后期骨折愈合，從而不能達到治療目的；碘伏浸泡殺菌雖比不上煮沸，但是較應(yīng)用抗生素效果明顯，細菌陽性率明顯降低，而且HE染色下觀察骨組織依舊能有較強的成骨能力，無明顯組織水腫表現(xiàn)。

本實驗通過對比煮沸、碘伏浸泡及抗生素沖洗3種方法殺菌效果，綜合處理后病灶骨成骨能力及對軟組織損傷程度等因素，得出碘伏浸泡可以達到滿意殺菌效果同時盡可能保留骨組織成骨能力，對治療骨髓炎具有良好的應(yīng)用潛力。故而碘伏浸泡殺菌法在臨床上有較大的發(fā)展空間及應(yīng)用價值。

[1] 陳東旭, 薄占東. 骨髓炎的治療現(xiàn)狀及進展[J]. 中國矯形外科雜志, 2012, 20(3):224-227.

[2] Conterno LO. da silva filho CR[J]. Antibiotics for treating chronic osteomyelitis in adults[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2009, (3):CD004439.

[3] Jeong JJ, Lee HS, Choi YR, et al. Surgical treatment of nondiabetic chronic osteomyelitis involving the foot and ankle [J]. Foot & Ankle International, 2012, 33(2):128-132.

[4] Yaroslavskiy BB, Zhang Y, Kalla SE, et al. NO-dependent osteoclast motility: reliance on cGMP-dependent protein kinase I and VASP[J]. J Cell Sci, 2005, 118(Pt 23):5479-5487.

[5] Stengel D, Bauwens K, Sehouli J, et al. Systematic review and meta-analysis of antibiotic therapy for bone and joint infections[J]. Lancet Infect Dis, 2001, 1(3):175-188.

[6] 聞一新, 周田華. 兔脛骨金黃色葡萄球菌慢性骨髓炎模型的制備[J]. 實用骨科雜志, 2013, 11(19):1001-1003.

[7] 李安明, 韓曉強. 抗生素灌洗與碘伏灌洗療法治療慢性骨髓炎的對比研究[J]. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 15(2): 132-134.

[8] 魯玉來, 張喜善. 骨髓炎臨床感染類型的變化及其對策[J]. 中國矯形外科雜志, 2014, 22(23):2189-2194.

[9] 徐建強, 周密, 樊麗潔, 等. 抗生素骨水泥填塞治療慢性跟骨骨髓炎[J]. 中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志, 2014, 29(10):1070-1071.

[10] 貝朝涌, 唐際存, 王銳英, 等. 感染骨滅活原位移植自體富血小板血漿復(fù)合骨髓治療慢性骨髓炎[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 28(4):558-561.

Q95-33

B

1674-5817(2016)06-0447-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.009

2016-07-22

河北省承德市科技局支撐項目(201422036): 病灶灌洗聯(lián)合自體病骨滅菌原位移植治療慢性骨髓炎的實驗研究

孔慶柱(1981-), 男, 碩士, 主治醫(yī)師。E-mail: kongqingzhu0314@163.com

金 宇, 男, 碩士, 主任醫(yī)師E-mail: 158336871@qq.com