張榮　郭彥萍　王丁丁

摘 要： 基因診斷是利用分子遺傳學(xué)技術(shù)在DNA或RNA水平上對某一基因進(jìn)行突變分析，從而對特定疾病進(jìn)行診斷?；蛟\斷具有直接診斷性、高效特異性和靈敏性等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了表型診斷的不足。本文主要綜述基因診斷技術(shù)的應(yīng)用及研究進(jìn)展，提出對基因診斷研究的展望，相信分子生物學(xué)、遺傳學(xué)的快速發(fā)展必將極大促進(jìn)基因診斷技術(shù)的進(jìn)步。

關(guān)鍵詞： 基因診斷 方法 應(yīng)用

基因診斷是在重組DNA技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)，是對受檢者的某一特定基因（DNA）或RNA進(jìn)行檢測和分析，從而診斷出相應(yīng)疾病，也就是從基因水平闡明疾病的病因。該技術(shù)的出現(xiàn)對診斷學(xué)來說是一次革命，標(biāo)志人們對疾病的認(rèn)識由傳統(tǒng)的表現(xiàn)性診斷轉(zhuǎn)為基因診斷或“逆向診斷”，成為分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)與醫(yī)學(xué)在理論、技術(shù)上相結(jié)合的典范[4]。本文主要介紹基因診斷技術(shù)的方法及應(yīng)用，以進(jìn)一步了解基因診斷技術(shù)。

1.基因診斷的概述

基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)技術(shù)，直接檢測患者體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)的表達(dá)水平，從而對疾病作出診斷或輔助診斷。

基因診斷與傳統(tǒng)診斷比較，特點(diǎn)如下[7]：（1）病因診斷：直接瞄準(zhǔn)病理基因，不僅能診斷出表型疾病，而且可發(fā)現(xiàn)隱形致病因素；（2）特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)；（3）診斷范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng)：可檢測正在生長的病原體或潛在病原體。

2.基因診斷的基本類型[2]

2.1臨癥基因診斷

醫(yī)生根據(jù)患者的病史和癥狀，為明確或排除某一疾病而進(jìn)行的檢查。

2.2癥狀前基因診斷

主要用于有遺傳病或遺傳病傾向的家族，至今未發(fā)病但有高度發(fā)病風(fēng)險人群的診斷，尤其適用于早期診斷后進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，避免嚴(yán)重后果出現(xiàn)的疾病。

2.3產(chǎn)前基因診斷

此又稱出生前診斷，主要針對一些有可能生育患兒夫婦的胎兒進(jìn)行診斷?？蓪υ\斷為某種疾病的胎兒進(jìn)行干預(yù)，對患無治愈可能疾病的胎兒實(shí)施選擇性流產(chǎn)。近年來，孕婦外周血中胎兒有核細(xì)胞或游離的胎兒DNA已被用于進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。

3.基因診斷方法

其常用方法有以下幾種[1][3][4][8]：

3.1限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLPs）與印跡雜交（Southern blot）

RFLP可用于對致病基因一無所知、未搞清基因突變位點(diǎn)，依靠基因外緊密連鎖的RFLP為遺傳標(biāo)志進(jìn)行間接分析。由于基因外或基因內(nèi)的中性突變可引起限制酶切位點(diǎn)丟失或新位點(diǎn)出現(xiàn)，根據(jù)有無酶切位點(diǎn)，結(jié)合DNA探針雜交，可直接分析。

印跡雜交法由英國人Southern創(chuàng)建于1975年，是將待檢測的DNA分子用限制性內(nèi)切酶消化后，電泳分離、變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，再與同位素標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行反應(yīng)，從而顯示出待檢的片段及其大小。

3.2聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及相關(guān)技術(shù)

PCR技術(shù)（Kary Mullis，1983）是一種靈敏的分子診斷技術(shù)，主要用于基因序列已知的檢測，目前廣泛應(yīng)用于臨床研究。近年來，多種改良PCR不斷涌現(xiàn)，如：熱啟動PCR、巢式PCR，與其他技術(shù)的結(jié)合才會真正推動PCR的進(jìn)步。

3.2.1PCR結(jié)合特異性寡核苷酸探針雜交（ASO）

這是目前廣為采用的基因直接檢測方法。大多數(shù)疾病只是單純堿基突變引起，根據(jù)常見的突變體類型，合成一系列具有正常序列和突變序列的等位基因和相應(yīng)引物，PCR產(chǎn)物能同時與正常和突變探針雜交者為雜合子，而正常人只能與正常探針雜交。

3.2.2PCR結(jié)合單鏈DNA構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）

這是較為流行的檢測DNA突變方法。單個核苷酸改變可造成DNA片段單鏈構(gòu)象改變，呈空間折疊構(gòu)象，當(dāng)一個堿基發(fā)生改變，DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻改變。因此，PCR產(chǎn)物變性后通過PAGE，可敏銳分開構(gòu)象差異分子，借以檢測突變位點(diǎn)。

3.2.3PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳（DGGE）

DGCE可以檢出幾乎所有突變。當(dāng)雙鏈DNA在梯度變性的聚丙烯酰胺凝膠中行進(jìn)到與DNA變性溫度一致的凝膠濃度時，發(fā)生變性，電泳速度迅速降低。解旋DNA鏈中有1個堿基突變，就會影響電泳速度變化的程度。

3.3DNA測序技術(shù)（DS）

當(dāng)各種篩選方法在敏感性和特異性上受限時，DS無疑是突變分析的最重要方法。1977年Sanger創(chuàng)立鏈終止反應(yīng)測序方法，放射性同位素標(biāo)記引物，雙脫氧核苷酸終止DNA鏈延伸，產(chǎn)生長度不等DNA片段，再由聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影讀取結(jié)果。DS方法有很大優(yōu)勢：四色熒光標(biāo)記替代放射性同位素，測序自動化程度高，但是費(fèi)用高限制了其應(yīng)用。

4.基因診斷的應(yīng)用

基因診斷技術(shù)目前已廣泛用于臨床疾病的體外診斷及療效評價。

4.1病原微生物感染的檢測[2][6]

目前可對病毒、細(xì)菌等多種病原微生物感染進(jìn)行基因診斷，如母嬰垂直傳播感染HIV的患兒，幽門螺桿菌感染，培養(yǎng)結(jié)果陰性的感染性心內(nèi)膜炎病原體等。

4.2腫瘤的檢測[2]

腫瘤是體內(nèi)基因突變結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)的癌基因和抑癌基因突變。用RT-PCR檢測胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移，微陣列技術(shù)分析內(nèi)分泌腫瘤的基因表達(dá)譜，都取得了很好的成果。

4.3遺傳病的檢測[2]

基因診斷適用于各種單基因疾病。例如對血友病攜帶者的基因診斷，有助于對這部分家系進(jìn)行遺傳咨詢。多基因遺傳病的發(fā)病率更高，與人群健康有密切聯(lián)系，但其發(fā)生受遺傳和環(huán)境雙重作用，而遺傳因素受多個基因位點(diǎn)控制，因此多基因遺傳病的基因診斷剛剛起步。

4.4耐藥性的檢測

由于環(huán)境變化和濫用抗生素，許多病原體具有抗藥性，甚至出現(xiàn)“超級致病菌”。浙江省基因診斷中心引用熒光定量核酸檢測方法，至今已建立10余項(xiàng)病原體的基因診斷[5]，可在極短時間內(nèi)同時鑒定、分析抗藥性，及時篩選最敏感藥物應(yīng)用于治療。

5.結(jié)語

通過以上對基因診斷技術(shù)的方法、應(yīng)用等各個方面的介紹，結(jié)合當(dāng)今科學(xué)的發(fā)展，相信更加能夠促進(jìn)基因診斷技術(shù)的進(jìn)步。以基因診斷為基礎(chǔ)的基因治療必將成為人類治療自身疾病的主流技術(shù)，并極大地促進(jìn)人類醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的進(jìn)步。

參考文獻(xiàn)：

[1]傅俊江，李麓蕓.基因診斷的方法原理及應(yīng)用[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2000，7（4）：316-317.

[2]李小強(qiáng)，曾照芳，陳宏礎(chǔ).基因診斷的新進(jìn)展[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2005，23（1）：71-72.

[3]曹瑞萍.基因診斷的應(yīng)用[J].廣州醫(yī)藥，1992，6：18～19.

[4]常虹.基因診斷方法的研究與進(jìn)展[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（37）：7355-7358.

[5]陳珍.基因診斷技術(shù)的運(yùn)用[J].醫(yī)學(xué)新技術(shù)，2001，10：19.

[6]周建光，曹海濤，楊梅.基因診斷技術(shù)臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].醫(yī)療裝備，2010，23（8）：34-35.

[7]王洪奇，王德彥，林輝.基因診斷與基因治療技術(shù)的倫理問題、基本原則與發(fā)展趨勢[J].自然辯證法通訊，2004，2（26）：104-109.

[8]楊桂萍，崔秀華，張艷.淺談疾病的基因診斷與基因治療[J].中國醫(yī)療前沿，2010，12（5）：10.