，*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室；湖南 衡陽 421001；2.湖南省分子靶標新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心)

·小專論·

環(huán)二鳥苷酸調(diào)控細菌生物膜形成的研究進展

胡繼宏1,2，朱翠明1,2*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點實驗室；湖南 衡陽 421001；2.湖南省分子靶標新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心)

生物膜(BF)是細菌附著到接觸物表面形成的多細胞群體，生物膜的形成不僅有利于細菌的生存，同時也增強了感染性。環(huán)二鳥苷酸(C-di-GMP)是群體感應(yīng)系統(tǒng)中的一種重要的胞內(nèi)信號分子。包含GGDEF結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶(DGCs)可將兩分子的GTP合成C-di-GMP，并在含有EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二酯酶(PDEs)作用下水解。C-di-GMP的水平在這兩種酶調(diào)節(jié)下發(fā)生改變，通過影響下游受體調(diào)控細菌的毒性、運動性、纖維素合成、黏附性、生物膜形成等多種功能。本文就細菌生物膜形成和C-di-GMP的調(diào)節(jié)作用的研究進展做一綜述。

生物膜； 環(huán)二鳥苷酸； 細菌感染

細菌可以通過聚集或黏附到胞外多糖基質(zhì)上形成生物膜在宿主中生存，生物膜細胞通常與游離細菌有不同的表型和生理特征。由于吞噬酶類、抗生素及抗體無法進入生物膜內(nèi)部，因此生物膜的形成顯著增強了細菌對這些抗生素的抵抗能力,有利于其在宿主內(nèi)生存而加劇宿主的損傷和慢性炎癥；同時生物膜釋放的游離菌又增加了細菌的感染性。生物膜的形成受多種因素的調(diào)節(jié)，其中C-di-GMP作為細菌中普遍存在的一種重要的信號分子，通過含量的變化參與了生物膜形成的調(diào)節(jié)過程。

1 細菌生物膜的形成和作用

生物膜(Biofilm，BF)的形成過程包括五個動態(tài)的階段：可逆的黏附、不可逆黏附、生物膜形成、成熟和消散。生物膜的形成開始于游離菌附著生長到生物或非生物表面形成的可逆性的黏附；之后細菌菌落分泌胞外多糖形成不可逆的黏附；接著菌落擴大聚集，結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜；逐漸成熟為三維的立體結(jié)構(gòu)；最終生物膜結(jié)構(gòu)中又釋放出游離菌到其它表面固著[1-2]。

生物膜是細菌包含在胞外多糖、蛋白質(zhì)和DNA網(wǎng)絡(luò)中的復(fù)雜的三維群體，在宿主組織或植入物當(dāng)中形成的生物膜與細菌的感染和抗生素抗性的增強有密切的關(guān)系[3]。Moskousitz等[4]以囊性纖維化病人中分離的銅綠假單胞菌為材料，發(fā)現(xiàn)生物膜形成后對β內(nèi)酯酰胺類抗生素的抗性較游離細菌明顯增高。生物膜的形成增加了對抗生素的抗性，其中一個重要原因是生物膜的生長、蛋白質(zhì)合成和新陳代謝活動是分層的，膜表面的細菌活動迅速，而中心的細菌生長緩慢甚至停止生長。相對于這一特性有些抗菌肽可通過穿透生物膜來起到抑制其內(nèi)部細菌存活的作用[5]。

2 C-di-GMP的作用

2.1 C-di-GMP的合成和分解調(diào)控環(huán)二鳥苷酸(cyclic-di-GMP,C-di-GMP)在鳥苷酸環(huán)化酶(guanylate cyclase，DGCs)參與下由兩分子的GTP合成，同時又在磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDEs)的作用下水解。遺傳和生化研究表明，GGDEF結(jié)構(gòu)域是DGCs的催化活性部位，EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域是PDEs的活性部位[6]。全基因組測序表明，包含GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白作為一種信號蛋白在細菌中普遍大量存在。Bharati等[7]人在分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)，同時具有GGDEF和EAL活性的DcpA蛋白能夠調(diào)節(jié)胞內(nèi)C-di-GMP的水平。

2.2 C-di-GMP的受體C-di-GMP與細胞表面的受體結(jié)合后，通過受體信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)控了細菌內(nèi)的多種功能和進程，包括轉(zhuǎn)錄[8]、翻譯[9]、蛋白質(zhì)活性[9]、蛋白質(zhì)分泌和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[6]。最終通過影響胞外蛋白、胞外多糖的分泌來改變細菌的表型，從而調(diào)控生物膜的形成。C-di-GMP的一些不同特異性受體的分子結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)得到了充分的研究，這些受體包括PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白、退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。

2.2.1 PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白 PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白是Amikam和Galperin在2006年用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的第一個胞內(nèi)C-di-GMP受體，在生物發(fā)生上與GGDEF和EAL相近[10]。PilZ的功能包括調(diào)節(jié)生物毒性、細胞運動型和胞外多糖(如纖維素，藻酸鹽)的分泌等[11]。C-di-GMP如何結(jié)合不同的PilZ結(jié)構(gòu)域蛋白并影響下游信號尚不清楚，但C-di-GMP與PilZ之間存在著很強的親和性，這與胞內(nèi)C-di-GMP的含量低相吻合。

2.2.2 退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白 C-di-GMP與一些失去活性的退化的GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合，改變了這些蛋白亞基間的交聯(lián)。如銅綠假單胞菌中的PelD蛋白[12]，以及霍亂弧菌中的CdgG蛋白[13]，都能與C-di-GMP結(jié)合，但對其功能和結(jié)構(gòu)均無作用，所以這一分子特性可用于研制C-di-GMP的特異性抑制劑。熒光假單胞菌中包含退化的EAL結(jié)構(gòu)域的LapD蛋白可以通過與C-di-GMP的結(jié)合，將C-di-GMP的胞內(nèi)水平傳遞到胞外來控制生物膜的合成[14]。

2.2.3 轉(zhuǎn)錄因子 C-di-GMP還可與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控基因的表達。例如銅綠假單胞菌中的FleQ蛋白作為C-di-GMP的受體，通過控制轉(zhuǎn)錄過程可以調(diào)節(jié)鞭毛基因的表達。與C-di-GMP結(jié)合后的FleQ蛋白失去與pel啟動子的聯(lián)系，導(dǎo)致pel操縱子啟動表達，而pel參與了胞外多糖的分泌[15]。

3 C-di-GMP與生物膜的形成

C-di-GMP作為一種細菌普遍存在的第二信使分子，通過DGCs，PDEs兩種酶對其量的調(diào)節(jié)，影響下游信號，從而調(diào)控細菌的多種生理活動。如在銅綠假單胞菌當(dāng)中外界信號被跨膜受體蛋白接受傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子AlgR與DGC mucR的基因啟動子結(jié)合增加了mucR的表達，從而提高胞內(nèi)C-di-GMP的水平。

3.1 C-di-GMP促進胞外多糖的形成C-di-GMP可以調(diào)節(jié)胞外多糖的產(chǎn)生、細菌的定植和生物膜的形成等過程。胞外多糖分泌的增加和細菌的定植是生物膜形成的先決條件。在銅綠假單胞菌中，胞內(nèi)高水平的C-di-GMP與PelD和Alg44蛋白的結(jié)合過程促進了多糖和藻酸鹽的合成，目前研究較為清楚的是合成酶依賴的合成途徑，在這種途徑中，多糖鏈的聚合是通過多亞基酶的催化來完成的。纖維素是細菌生物膜的重要組成部分，纖維素合成復(fù)合物中的糖基轉(zhuǎn)移酶可以通過與C-di-GMP結(jié)合被激活，促進了聚合物的延長，進而合成纖維素單鏈分子。胞內(nèi)C-di-GMP量的增加最終導(dǎo)致胞外多糖的增多，從而促進了生物膜的形成和聚集。

3.2不同來源C-di-GMP對生物膜影響不同高水平的內(nèi)源性C-di-GMP促進了細菌的運動，加強了鞭毛的形成和細菌的消散。Nakhamchik等[16]用質(zhì)粒過表達C-di-GMP的方法在創(chuàng)傷弧菌中發(fā)現(xiàn)了這樣的調(diào)節(jié)過程。此外，外源性的C-di-GMP能抑制細菌生物膜的形成，Yan等[17]發(fā)現(xiàn)，在變形鏈球菌中，外源性的C-di-GMP有明顯的抑制細菌黏附的作用，并且一定濃度的外源C-di-GMP能顯著降低生物膜的形成，而且抑制呈劑量依賴性關(guān)系?？偟膩碚f，胞內(nèi)C-di-GMP的增多能夠增強細菌生物膜的形成能力，而一定量的外源C-di-GMP卻能夠抑制細菌生物膜的形成。

4 結(jié) 語

自然界中絕大多數(shù)的細菌均能以生物膜的形式生存，它是細菌為了適應(yīng)環(huán)境所形成的細胞聚集狀態(tài)。生物膜形成后的抗藥，引起慢性炎癥等特性為感染性疾病的治療帶來了巨大的困難，同時造成的反復(fù)感染也增加了病人的痛苦。近年來，對C-di-GMP的調(diào)節(jié)功能的研究不斷發(fā)展，對其參與的信號調(diào)節(jié)通路的研究也將更加完善。同時，C-di-GMP作為生物膜形成的調(diào)節(jié)分子，為生物膜研究提供了新的靶標，并為抗生物膜感染研究提供了方向。

[1] Rasamiravaka T,Labtani Q,Duez P,et al.The formation of biofilms by Pseudomonas aeruginosa:a review of the natural and synthetic compounds interfering with control mechanisms[J].Biomed Res Int,2015,2015:759348.DOI:10.1155/2015/759348.

[2] Steenackers HP,Parijs I,Foster KR,et al.Experimental evolution in biofilm populations[J].FEMS Microbiol Rev,2016,40(3):373-397.DOI:10.1093/femsre/fuw002.

[3] Venkatesan N,Perumal G,Doble M.Bacterial resistance in biofilm-associated bacteria[J].Future Microbiol,2015,10(11):1743-50.

[4] Moskowitz SM,Foster JM,Emerson J,et al.Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis[J].J Clin Microbiol,2004,42(5):1915-1922.

[5] Stewart PS.Prospects for Anti-Biofilm Pharmaceuticals[J].Pharmaceuticals (Basel),2015,8(3):504-511.DOI:10.3390/ph8030504.

[6] Hengge R.Trigger phosphodiesterases as a novel class of C-di-GMP effector proteins[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2016,371(1707)DOI:10.1098/rstb.2015.0498.

[7] Bharati BK,Sharma IM,Kasetty S,et al.A full-length bifunctional protein involved in C-di-GMP turnover is required for long-term survival under nutrient starvation in Mycobacterium smegmatis[J].Microbiology,2012,158(Pt 6):1415-1427.DOI:10.1099/mic.0.053892-0.

[8] Reinders A,Hee CS,Ozaki S,et al.Expression and genetic activation of cyclic Di-GMP-Specific phosphodiesterases in escherichia coli[J].J Bacteriol,2015,198(3):448-462.DOI:10.1128/JB.00604-15.

[9] Nelson JW,Sudarsan N,Furukawa K,et al.Riboswitches in eubacteria sense the second messenger c-di-AMP[J].Nat Chem Biol,2013,9(12):834-839.DOI:10.1038/nchembio.1363.

[10] Fujiwara T,Komoda K,Sakurai N,et al.The C-di-GMP recognition mechanism of the PilZ domain of bacterial cellulose synthase subunit A[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,431(4):802-807.DOI:10.1016/j.bbrc.2012.12.103.

[11] Purcell EB,Tamayo R.Cyclic diguanylate signaling in Gram-positive bacteria[J].FEMS Microbiol Rev,2016,40(5):753-773.DOI:10.1093/femsre/fuw013.

[12] Merighi M,Lee VT,Hyodo M,et al.The second messenger bis-(3′-5′)-cyclic-GMP and its PilZ domain-containing receptor Alg44 are required for alginate biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa[J].Mol Microbiol,2007,65(4):876-895.DOI:10.1111/j.1365-2958.2007.05817.x.

[13] Silva AJ,Benitez JA.Vibrio cholerae Biofilms and Cholera Pathogenesis[J].PLoS Negl Trop Dis,2016,10(2):e0004330.DOI:10.1371/journal.pntd.0004330.

[14] Ambrosis N,Boyd CD,O TGA,et al.Homologs of the LapD-LapG C-di-GMP Effector System Control Biofilm Formation by Bordetella bronchiseptica[J].PLoS One,2016,11(7):e0158752.DOI:10.1371/journal.pone.0158752.

[15] Jiménez-Fernández A,López-Sánchez A,Jiménez-Díaz L,et al.Complex Interplay between FleQ,Cyclic Diguanylate and Multiple σ Factors Coordinately Regulates Flagellar Motility and Biofilm Development in Pseudomonas putida[J].PLoS One,2016,11(9):e0163142.DOI:10.1371/journal.pone.0163142.

[16] Nakhamchik A,Wilde C,Rowe-Magnus DA.CycliC-di-GMP regulates extracellular polysaccharide production,biofilm formation,and rugose colony development by Vibrio vulnificus[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(13):4199-4209.DOI:10.1128/AEM.00176-08.

[17] Yan W,Qu T,Zhao H,et al.The effect of C-di-GMP (3′-5′-cyclic diguanylic acid) on the biofilm formation and adherence of Streptococcus mutans[J].Microbiol Res,2010,165(2):87-96.DOI:10.1016/j.micres.2008.10.001.

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.026

2017-01-04；

2017-04-14

湖南省分子靶標新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心資助項目(湘教通[2015]351號).

*通訊作者，E-mail：nhzhucuiming@126.com.

R37

A

蔣湘蓮)