姬小利，王敏，李玲玲，周君梅

人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化及其應(yīng)用于臨床治療的研究進(jìn)展

姬小利，王敏，李玲玲，周君梅

視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細(xì)胞是位于視網(wǎng)膜最外層的單層細(xì)胞，呈六角形，胞內(nèi)富含黑色素。其功能主要包括：①吞噬感光細(xì)胞外節(jié)段；②代謝視紫紅質(zhì)；③參與構(gòu)成血-視網(wǎng)膜屏障；④合成黑色素等。RPE細(xì)胞的功能喪失會引起多種視網(wǎng)膜疾病，如年齡相關(guān)黃斑變性、Stargardt 病等[1]。RPE 細(xì)胞已經(jīng)到達(dá)終末分化階段，損傷后無法再生，因此細(xì)胞移植成為治療其病變的理想方法。具有多向分化潛能的干細(xì)胞可作為 RPE 細(xì)胞的種子來源。研究者們曾利用胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）[2]、成體干細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[3]，定向誘導(dǎo)分化為 RPE 細(xì)胞進(jìn)行移植治療。但由于 ESCs 存在倫理學(xué)和免疫排斥等問題[4]、成體干細(xì)胞存在增殖能力和分化潛能有限等問題[5]，阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）的出現(xiàn)為 RPE 細(xì)胞的移植治療帶來了新的希望。

ESCs 的研究是 iPSCs 研究的重要前期基礎(chǔ)。ESCs 來源于早期囊胚的內(nèi)細(xì)胞團，其在體外合適的培養(yǎng)環(huán)境下可自我更新、定向分化。ESCs 的獲取需破壞早期胚胎，故其來源受限，且分化后的細(xì)胞用于異體移植治療時會發(fā)生免疫排斥。因此，研究者通過向成體細(xì)胞中導(dǎo)入和 ESCs 多能性密切相關(guān)的基因，以起始的成體細(xì)胞為種子細(xì)胞，通過誘導(dǎo)重編程建立了具有 ESCs 特性的自體來源的 iPSCs。iPSCs最初于 2006年由日本科學(xué)家 Takahashi 和 Yamanaka[6]通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將 4 種轉(zhuǎn)錄因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和c-Myc）導(dǎo)入小鼠的成纖維細(xì)胞使其重編程而獲得。2007年，Takahashi 等[7]和 Yu 等[8]分別將人的皮膚成纖維細(xì)胞重編程為 iPSCs，為其臨床應(yīng)用提供了可能。近年來，iPSCs重編程技術(shù)已經(jīng)從最初的 DNA 途徑[6]、RNA 途徑[9]拓展到蛋白[10]以及目前的小分子化合物途徑[11]。隨著定向誘導(dǎo)分化方案的不斷優(yōu)化，其誘導(dǎo)效率及安全性也進(jìn)一步得到了提高。人 iPSCs 是將患者自身來源的體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞，避開了人 ESCs 建系時需要破壞早期胚胎的倫理問題；其在體外可被誘導(dǎo)分化為特定類型的細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞[12]、心肌細(xì)胞[13]、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及色素上皮細(xì)胞[14-15]等用于自體的細(xì)胞移植治療，解決了免疫排斥和細(xì)胞來源受限的問題。由于其具有重大意義，iPSCs 建系僅 6年即獲得 2012年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。近十年來，iPSCs 誘導(dǎo)分化及細(xì)胞移植治療，一直是研究者們關(guān)注的焦點。

本文擬就人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化、利用人 iPSCs來源的 RPE 細(xì)胞進(jìn)行臨床移植治療以及治療中所面臨的問題等進(jìn)行綜述。

1 人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞的分化

1.1 自發(fā)分化法

自發(fā)分化法即不添加任何外源因子，使 iPSCs 自發(fā)分化，這是研究者最先嘗試的一種誘導(dǎo)分化方法。即通過將iPSCs 培養(yǎng)液中維持其干細(xì)胞特性所需的堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）撤去，后續(xù)通過不斷的培養(yǎng)、分選，即可獲得含有色素的小克隆，與人ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞及流產(chǎn)胎兒來源 RPE 細(xì)胞進(jìn)行比較，iPSCs 自發(fā)分化得到的 RPE 細(xì)胞在形態(tài)、特異性標(biāo)志物及功能方面均與前兩者十分相似[16-18]。自發(fā)分化不需要添加外源因子、操作簡單，是相對簡單的一種分化方法。但由于分化效率低下（＜ 1%）、細(xì)胞分化不同步，獲得的 RPE 細(xì)胞需要長時間分選和純化后才能用于后續(xù)研究。因此，研究者嘗試了更高效率的共培養(yǎng)，如根據(jù)其發(fā)育特點循序添加誘導(dǎo)因子等定向誘導(dǎo)分化方法。

1.2 共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化法

2002年，Kawasaki 等[19]在誘導(dǎo)靈長類動物 ESCs 向外胚層細(xì)胞分化的過程中，發(fā)現(xiàn) ESCs 與基質(zhì)細(xì)胞 PA6共培養(yǎng) 3 周后可觀察到 RPE 細(xì)胞的出現(xiàn)。隨后，Haruta等[20]和 Hirano 等[21]通過同樣的共培養(yǎng)方式，均獲得了ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞。在此研究基礎(chǔ)上，Okamoto 和Takahashi[22]將食蟹猴來源的 iPSCs 與 PA6 細(xì)胞共培養(yǎng)，得到的 PRE 細(xì)胞不僅具有典型的六邊形形態(tài)，并且表達(dá)其特異性標(biāo)志物如 RPE65、CRALBP 等。共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化體系中，用于共培養(yǎng)的各種細(xì)胞通過分泌因子釋放到培養(yǎng)液中，提高了 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞的分化效率，但是具體發(fā)揮作用的因子及其機制目前并不清楚。雖然共培養(yǎng)可以在一定程度上提高 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化的效率，但是其潛在的異源細(xì)胞污染為臨床應(yīng)用帶來了隱患。因此，該誘導(dǎo)方法更多用于研究 RPE 細(xì)胞分化的機制，但在分化后的移植治療研究中并不常用。

1.3 外源因子誘導(dǎo)分化法

根據(jù)特定類型細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)育特點，定向誘導(dǎo)分化法可通過循序添加決定細(xì)胞命運的外源因子來縮短誘導(dǎo)時間、提高誘導(dǎo)效率、促進(jìn)同步分化。目前人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的外源因子主要包括一些轉(zhuǎn)錄因子、重組蛋白和小分子化合物等。

1.3.1 細(xì)胞因子或重組蛋白誘導(dǎo)法 基于在前期研究中發(fā)現(xiàn)的 Dkk-1、Lefty 和 Noggin 等與外胚層分化的相關(guān)性，這些外源性的細(xì)胞因子或重組蛋白被應(yīng)用于多能干細(xì)胞向RPE 細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化。2008年，Osakada 等[23]使用Dkk-1 聯(lián)合 Lefty 將人的 ESCs 誘導(dǎo)分化為 RPE 細(xì)胞。在此研究基礎(chǔ)之上，2009年，該課題組使用同樣的方案誘導(dǎo)人來源的 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化，第 35 天觀察到約有 30% 的克隆表達(dá) PRE 細(xì)胞特異性標(biāo)記物，第 40 天約有 39% 的克隆有色素形成，隨后又觀察到 RPE 細(xì)胞典型形態(tài)的出現(xiàn)。該研究不僅得到了 iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞，而且其誘導(dǎo)效率及時間與 ESCs 向 RPE 細(xì)胞的誘導(dǎo)十分接近。2011年，Meyer 等[24]在誘導(dǎo)人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化的過程中，首先加入 Noggin 和 Dkk-1，在第 20 天，觀察到約有 20% 的視泡樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團出現(xiàn)，將這些細(xì)胞團挑選出來繼續(xù)分化培養(yǎng)，并在誘導(dǎo)體系中加入 TGF-β 超家族成員 Activin A，培養(yǎng) 40～60 d 后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素加深、RPE 細(xì)胞特異性基因表達(dá)水平明顯增高。2012年，Zahabi等[25]聯(lián)合使用 bFGF、Noggin、RA 以及 Shh，誘導(dǎo) 4 周后可以看到分化的細(xì)胞團，35 d后可以觀察到鵝卵石樣色素細(xì)胞出現(xiàn)。2016年，Lidgerwood 等[26]通過使用雞尾酒誘導(dǎo)法（同時加入 IGF1、Dkk-1、Noggin、bFGF、B27 和 N2）誘導(dǎo) 20 d，初步觀察到色素克隆的出現(xiàn)，第 40～60 天獲得了大量的色素克隆，除了形態(tài)學(xué)、功能學(xué)等方面的鑒定，該團隊通過 RNA-seq 對第 60 天獲得的 RPE 細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)果表明人 iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞與成人來源的 RPE 細(xì)胞在基因表達(dá)上具有高度的相似性。在誘導(dǎo)的適當(dāng)時機循序加入細(xì)胞因子或者重組蛋白，縮短了誘導(dǎo)時間、提高了誘導(dǎo)效率，但這些外源性細(xì)胞因子或重組蛋白大多是動物源性或者細(xì)菌源性，存在著免疫排斥及跨物種污染等風(fēng)險，且不同批次之間的差異性也可能導(dǎo)致誘導(dǎo)效果的巨大差異，因而也是亟待解決的問題?；瘜W(xué)小分子也因其穩(wěn)定性好、批次差異小以及不存在跨物種間污染等優(yōu)勢而被用于定向誘導(dǎo)分化研究。

1.3.2 小分子化合物誘導(dǎo)法 小分子化合物以其獨特的優(yōu)勢在干細(xì)胞研究中的應(yīng)用越來越廣泛，其選擇也是基于前期研究中發(fā)現(xiàn)的小分子的作用通路和 RPE 細(xì)胞的體內(nèi)發(fā)育特征。Osakada 等[27]在其前期用重組蛋白（Dkk-1、Lefty）誘導(dǎo) ESCs 分化為 RPE 細(xì)胞的研究基礎(chǔ)上，利用兩種分別可以阻斷 Wnt、Nodal 信號通路的小分子化合物抑制劑CKI-7 和 SB-431542，誘導(dǎo)人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化，40 d 后觀察到約有 29.1% 的色素克隆出現(xiàn)，第 60 天，約有 29% 的細(xì)胞表現(xiàn)出了 RPE 細(xì)胞典型的六邊形形態(tài)。Westenskow 等[28]在誘導(dǎo)人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化的過程中，對比 Nicotinamide + Activin A 及 Nicotinamide +IDE-1 兩種誘導(dǎo)方法，發(fā)現(xiàn)用小分子抑制劑 IDE-1 替換Activin A，不僅同樣可以在 5～7 周的時間獲得 RPE 細(xì)胞，而且大大降低了費用。此外，Maruotti 等[29]利用高通量技術(shù)篩選出兩種可以促進(jìn)人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化的小分子化合物 Chetomin（CTM）和 Nicotinamide（NIC），用 CTM + NIC 誘導(dǎo) 2 周后，轉(zhuǎn)移到 RPE 細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng) 1～2 周，即可觀察到色素克隆出現(xiàn)，5 周后，色素克隆占滿了整個培養(yǎng)基。與 Osakada 等[27]的小分子化合物結(jié)合重組蛋白的誘導(dǎo)方案相比，Maruotti 等[29]用兩種化學(xué)小分子 CTM 和 NIC，將人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化時間縮短到 35 d，其誘導(dǎo)效率也提高到了 45% ～60%。綜上，從最初的與重組蛋白聯(lián)合應(yīng)用以期增加誘導(dǎo)效率、縮短誘導(dǎo)時間，到目前單獨應(yīng)用小分子化合物進(jìn)行誘導(dǎo)分化，小分子化合物憑借其無免疫排斥和跨物種間污染等風(fēng)險、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和批次差異性小等優(yōu)點，在 iPSCs 向RPE 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究中，得到研究者們越來越多的青睞。

2 人 iPSCs 來源 RPE 細(xì)胞的移植治療

眼憑借其組織結(jié)構(gòu)小、修復(fù)需要的細(xì)胞量少、可直視下手術(shù)、定位準(zhǔn)確、免疫豁免區(qū)有利于移植細(xì)胞存活等優(yōu)點，在細(xì)胞移植治療領(lǐng)域存在較大優(yōu)勢[30]。2004年，Haruta等[20]將猴 ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞移植到 4 周齡皇家外科學(xué)院大鼠（royal college of surgeon rat，RCS）的視網(wǎng)膜下區(qū)，移植的 RPE 細(xì)胞通過提高感光細(xì)胞的存活率而改善大鼠的視功能。隨后，研究者們利用人 ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞在動物模型上進(jìn)行移植治療，結(jié)果表明，移植 ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞不僅可以在一定程度上改善其視功能，且安全性和移植效率均可得到保證[31-32]。2011年，美國食品藥品管理監(jiān)督局批準(zhǔn)了使用人 ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞治療年齡相關(guān)性黃斑變性（NCT01344993）和 Stargardt ?。∟CT01345006）的 I/II 期臨床試驗[33]，通過對接受移植治療的患者進(jìn)行為期 22 個月的評估觀察，接受移植的18 例患者中，10 例患者的視力得到明顯改善，7 例視力不變，1 例視力下降。此外，在整個過程中未發(fā)現(xiàn)免疫排斥、腫瘤發(fā)生等安全性問題。在 ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞移植的研究基礎(chǔ)上，研究者們開始嘗試用人 iPSCs 來源的 RPE細(xì)胞進(jìn)行移植治療，旨在避免使用 ESCs 進(jìn)行相關(guān)實驗所引起的免疫排斥及醫(yī)學(xué)倫理等問題。Carr 等[34]將人 iPSCs來源的 RPE 細(xì)胞移植到出生 22～23 d RCS 大鼠的視網(wǎng)膜下區(qū)，移植的 RPE 細(xì)胞可通過不斷吞噬脫落的感光細(xì)胞膜盤來幫助維持其代謝，從而改善大鼠視功能。Li 等[35]在其前期分別利用胎鼠來源 RPE 細(xì)胞[36]以及人 ESCs 來源的 RPE 細(xì)胞[37]進(jìn)行移植治療的基礎(chǔ)上，用人 iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞移植到新生 2 d 視網(wǎng)膜變性的模型鼠身上，在其存活的 6 個月內(nèi)，視網(wǎng)膜電流圖顯示其視功能有明顯的改善。為了確保人 iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞在臨床應(yīng)用中的安全性，Kanemura 等[38]和 Kamao 等[39]首先將人 iPSCs來源的 RPE 細(xì)胞移植到大鼠和猴視網(wǎng)膜下區(qū)，均未觀察到免疫排斥或腫瘤發(fā)生等安全性問題。在此基礎(chǔ)上，該團隊于2014年得到日本政府批準(zhǔn)后實施了世界上第一例自體iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞的臨床試驗[40]：研究者首先將一位患有年齡相關(guān)性黃斑變性患者的體細(xì)胞重編程為 iPSCs，再將其定向誘導(dǎo)分化為 RPE 細(xì)胞，然后將其用于自身的移植治療。自體來源的 iPSCs 雖然避免了免疫排斥等問題，但其制備時間及費用、突變位點的糾正等問題不容忽視。2017年 4月，日本實施了世界上首例異體來源 iPSCs 來源RPE 細(xì)胞的移植治療[41]：研究者為一名患有老年黃斑變性的 60 歲男性患者移植了異體來源的 RPE 細(xì)胞，移植過程順利，移植效果目前正在追蹤觀察中，該研究預(yù)計共實施5 例異體 iPSCs 移植。日本目前正在積極創(chuàng)辦一個“用于可再生醫(yī)學(xué)的 iPSCs 干細(xì)胞庫”，以此來滿足大多數(shù)日本人口的需求匹配。由不同捐獻(xiàn)者的 iPSCs 所組成的干細(xì)胞庫將有望使干細(xì)胞移植成本更低且更方便。將來，異體iPSCs 移植有望像同型輸血一樣方便。

此外，通過檢索美國臨床試驗注冊網(wǎng)站（https://www.clinicaltrials.gov），其中涉及到 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞分化及應(yīng)用的臨床試驗項目共有 4 項（NCT02162953、NCT02464956、NCT01432847 和 NCT02193724），由此可見，雖然 iPSCs 在臨床應(yīng)用中的安全性問題有待進(jìn)一步考察，但是其憑借自體來源，避免了免疫排斥及醫(yī)學(xué)倫理等優(yōu)勢，在臨床應(yīng)用中具有更加廣闊的前景。

3 人 iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞用于臨床治療所面臨的問題

雖然人 iPSCs 及其向 RPE 細(xì)胞分化的研究已經(jīng)取得突破性進(jìn)展，但目前亟待解決的問題還有很多，主要包括：①如何進(jìn)一步提高移植細(xì)胞安全性；②如何解決移植細(xì)胞的流失問題；③對于遺傳所致的視網(wǎng)膜變性患者，如何規(guī)避移植 iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞的遺傳缺陷等。針對這些問題，研究者們也在不斷提出新的解決方案：針對移植細(xì)胞的安全性，通過優(yōu)化重編程方案[6-11]（重編程水平從病毒轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)誘導(dǎo)到目前的小分子化合物誘導(dǎo)）、純化誘導(dǎo)后細(xì)胞[23-24]（流式細(xì)胞分選純化、手動挑選色素克隆），可以降低 iPSCs 重編程過程及其本身定向分化不完全所致的潛在致瘤性、大大提高移植細(xì)胞的安全性；針對移植細(xì)胞流失的問題，細(xì)胞膜片[39]及支架材料[42]的應(yīng)用可提高移植細(xì)胞在視網(wǎng)膜下區(qū)的定植和存活；針對遺傳所致的視網(wǎng)膜變性患者面臨的移植細(xì)胞的遺傳缺陷，利用 CRISPR-Cas9 等新一代基因編輯技術(shù)，對患者的病變基因位點予以糾正，其用于自體移植治療的細(xì)胞不再攜帶有致病基因位點，可避免移植自體來源 RPE 細(xì)胞的再致病。目前 CRISPR-Cas9 技術(shù)在臨床上已經(jīng)開始應(yīng)用，2016年 10月，四川大學(xué)腫瘤學(xué)家盧鈾團隊，首次利用 CRISPR-Cas9 技術(shù)對免疫細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，然后將其用于肺癌患者的自體治療[43]。北京大學(xué)研究團隊也正在籌劃將該技術(shù)應(yīng)用到膀胱、前列腺以及腎臟等方面的惡性腫瘤治療上[44]。雖然目前 CRISPR-Cas9 用于臨床疾病的治療尚在起步階段，我們相信，隨著技術(shù)的成熟，將 CRISPR-Cas9 技術(shù)聯(lián)合 iPSCs 應(yīng)用于遺傳因素所致的RPE 患者的治療具有重要前景。此外，異體 iPSCs 的移植也為解決該問題開辟了一條更方便、快捷的新途徑。

綜上所述，iPSCs 技術(shù)的建立被認(rèn)為是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的重大突破，不僅因為其在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的重要性，更因其在許多難治病和罕見病的細(xì)胞移植治療方面正逐漸從基礎(chǔ)走向臨床。目前人 iPSCs 向 RPE 細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方案已經(jīng)較為成熟，相信人 iPSCs 來源的 RPE 細(xì)胞的移植可作為一種新的治療方法應(yīng)用到臨床中，以造福視網(wǎng)膜色素變性患者。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.011

國家自然科學(xué)基金（81270742、81370700、81470911）；上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉基金（YG2016MS32）；上海市衛(wèi)計委重點課題（201540389）

200040 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院中心實驗室（姬小利、王敏）；200040 上海市兒童醫(yī)院中心實驗室（李玲玲、周君梅）

周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

2017-05-08