陳 光，高嘉良，劉詠梅，王 階△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

【綜述】

冠心病血瘀證表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展?

陳 光1,2，高嘉良1，劉詠梅1，王 階1△

(1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

從表觀遺傳學(xué)研究探討冠心病血瘀證的證候?qū)嵸|(zhì)，主要包括DNA甲基化修飾和非編碼RNA調(diào)控兩個(gè)方面。DNA甲基化的調(diào)控方式具有整體、可逆、間接的特點(diǎn)，而非編碼RNA的調(diào)節(jié)方式具有廣泛、多樣、復(fù)雜的特點(diǎn)?？傮w而言，表觀遺傳學(xué)調(diào)控的時(shí)間特異性和組織特異性明顯，調(diào)節(jié)方式相對(duì)間接，充分體現(xiàn)基因遺傳與環(huán)境的相互作用，其中滲透著中醫(yī)天人相應(yīng)、整體觀的思想，為研究中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)與中藥作用機(jī)制提供了合作平臺(tái)。

冠心??；血瘀證；表觀遺傳學(xué)；DNA甲基化；mircoRNA；綜述

血瘀證是中醫(yī)理論傳統(tǒng)證候的重要組成部分，是中醫(yī)臨床各科常見的一種證候，也是冠心病(coronary heart disease, CHD)最常見的證型之一。而表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列在不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳變化，是后基因組時(shí)代生命科學(xué)領(lǐng)域的重要組成部分。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的進(jìn)程，近年來(lái)一些學(xué)者從表觀遺傳學(xué)水平研究探討CHD血瘀證的證候?qū)嵸|(zhì)，主要涉及DNA甲基化修飾、非編碼RNA(noncoding RNA, ncRNA)調(diào)控與組蛋白修飾[1]等層面，為研究中醫(yī)學(xué)證候本質(zhì)提供了新的思路與方法，已成為目前研究的熱點(diǎn)，因此本文對(duì)其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 DNA甲基化

1.1 甲基化研究基礎(chǔ)

在真核細(xì)胞中，甲基化是由甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基主要轉(zhuǎn)移到CpG雙核苷酸序列的胞嘧啶第五位碳原子上。DNA甲基化修飾使DNA結(jié)合蛋白的部位，即DNA雙螺旋凹槽的外形發(fā)生改變，從而導(dǎo)致與DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合能力降低[2]，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。在方法學(xué)上，待測(cè)樣本的DNMT水平和甲基化CpG結(jié)合蛋白水平，分別對(duì)預(yù)測(cè)基因組甲基化水平和甲基化在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用程度具有一定意義。從DNA甲基化水平研究中醫(yī)證候本質(zhì)，主要存在以下特色及優(yōu)勢(shì)。一是DNA甲基化本身是可逆的，并受環(huán)境因素改變的影響，這就使其在研究證候的時(shí)間特異性領(lǐng)域中占有一定的地位，并為中藥干預(yù)甲基化程度提供了可能性；二是在脊椎動(dòng)物中甲基化CpG在整個(gè)基因組中均有分布，這為研究中醫(yī)藥干預(yù)證候機(jī)制的整體性提供了依據(jù)；三是DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)存在影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性與甲基化結(jié)合蛋白抑制轉(zhuǎn)錄直接和間接兩種機(jī)制，為研究中醫(yī)藥對(duì)癥治療與對(duì)證治療打開了思路。

1.2 血瘀證DNA甲基化研究進(jìn)展

在DNA甲基化一系列的研究方法中，根據(jù)mRNA差異表達(dá)譜結(jié)果、生物信息學(xué)分析并結(jié)合血瘀證病理機(jī)制以及參考基因啟動(dòng)子CpG島的注釋情況，選擇性檢測(cè)甲基化水平是目前血瘀證DNA甲基化的主要研究方法。王萍等[3]采用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)家系CHD血瘀證、家系健康人KLF5和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白12基因啟動(dòng)子甲基化程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2組該基因甲基化程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。唐梅森等[4]運(yùn)用焦硫酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)16例CHD血瘀證和8例非血瘀證患者ER-α、Gp6、AGTRAP基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)2組Gp6、AGTRAP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。向忠軍等[5]運(yùn)用高通量芯片技術(shù)檢測(cè)3例CHD血瘀證和3例非血瘀證患者DES和CTNNB1啟動(dòng)子甲基化程度，發(fā)現(xiàn)該基因可能是CHD血瘀證的危險(xiǎn)因素。黃海波等[6]運(yùn)用芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)20例CHD血瘀證、20例非血瘀證ZEB2和CHL1啟動(dòng)子甲基化水平，結(jié)果顯示ZEB2與CHD血瘀證存在相關(guān)性，而CHL1則無(wú)相關(guān)性。

1.3 甲基化研究思路展望

由于甲基化本身的特點(diǎn)與中醫(yī)特色有著一種天然而隱約的聯(lián)系，其研究思路較為廣泛，以下僅談兩點(diǎn)展望。一是研究表明，DNA甲基化修飾的最終效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于調(diào)控基因表達(dá)，甚至可擴(kuò)展到基因組印記、X染色體失活以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾[7]。而基因印跡是一種決定是否表達(dá)由其來(lái)自父方或母方基因的現(xiàn)象，通過(guò)卵子和精子形成過(guò)程中DNA甲基化精細(xì)微妙的變化而實(shí)現(xiàn)。實(shí)際上，基因印跡是對(duì)來(lái)自父方和母方遺傳物質(zhì)的一種選擇[8]，是在先天之精形成過(guò)程中適應(yīng)性選擇的機(jī)制之一，為先天之精作用后天的研究提供了思路，從而為詮釋中醫(yī)體質(zhì)對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展及證候演變的影響提供了研究基礎(chǔ)。二是ncRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)DNMT的表達(dá)而調(diào)節(jié)DNA的甲基化，而相應(yīng)的DNA甲基化亦可調(diào)控ncRNA的轉(zhuǎn)錄水平，因此ncRNA-DNA甲基化兩個(gè)層次的相互調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，可能是中醫(yī)藥干預(yù)作用的連鎖放大效應(yīng)機(jī)制之一，也可能是中藥作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

2 ncRNA

2.1 ncRNA研究基礎(chǔ)

ncRNA是不編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA分子。其中長(zhǎng)度大于200nt的稱為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)，而長(zhǎng)度小于200nt的稱為短鏈非編碼RNA(short noncoding RNA, sncRNA)，后者分為核內(nèi)小RNA(small nuclear RNA, snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)、胞質(zhì)小RNA(small cytoplasmic RNA, scRNA)、小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和微RNA(micro RNA, miRNA)[9-11]。目前CHD血瘀證的研究主要涉及miRNA，一類含有20～24個(gè)堿基的ncRNA，可以與mRNA的3‘或5’非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，并借此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯[12]，即通過(guò)miRNA同靶mRNA中的互補(bǔ)序列配對(duì)而調(diào)控基因表達(dá)[13]。其相關(guān)研究可以利用芯片或測(cè)序技術(shù)對(duì)不同組樣本進(jìn)行差異miRNA篩選，并可通過(guò)熱圖、散點(diǎn)圖、火山圖直觀的表示，再利用TargetScan或miRanda軟件(Linux操作系統(tǒng))或相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異miRNA調(diào)節(jié)的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)靶基因富集分析，分析其調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。另外，還可以通過(guò)分析相關(guān)mRNA差異表達(dá)譜結(jié)果，利用相關(guān)軟件預(yù)測(cè)可能對(duì)差異mRNA有調(diào)節(jié)作用的miRNA，再對(duì)預(yù)測(cè)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，從而進(jìn)一步明確調(diào)節(jié)mRNA差異的相關(guān)機(jī)制。

2.2 ncRNA研究進(jìn)展

虞桂等[14-15]利用miRNA高通量芯片技術(shù)，對(duì)5例CHD不穩(wěn)定心絞痛血瘀證及5例健康對(duì)照患者進(jìn)行差異miRNA表達(dá)譜分析。結(jié)果顯示，23個(gè)miRNA上調(diào)，2個(gè)miRNA下調(diào)，并與mRNA差異表達(dá)譜結(jié)合進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOD樣受體信號(hào)通路、凋亡通路、細(xì)胞因子和受體相互作用通路與不穩(wěn)定心絞痛血瘀證密切相關(guān)。鮑巖巖[16]則使用TaqMan低密度芯片技術(shù)，對(duì)CHD血瘀證24 h大鼠模型的心臟組織進(jìn)行差異表達(dá)miRNA的篩選，結(jié)果顯示模型大鼠心臟組織中表達(dá)變化差異顯著的有16個(gè)miRNA，其中12個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)；通過(guò)生物信息學(xué)方法構(gòu)建調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合RT-PCR驗(yàn)證的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PIK3CD、PPP3CA、PPP3R1、CASP3、IL1A顯著上調(diào)；構(gòu)建miR-384-5p過(guò)表達(dá)和抑制的H9c2細(xì)胞模型，檢測(cè)PIK3CD蛋白水平，發(fā)現(xiàn)miR-384-5p下調(diào)，PIK3CD蛋白表達(dá)上調(diào)；通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-384-5p靶基因，并從細(xì)胞水平驗(yàn)證miR-384-5p對(duì)靶基因的影響，結(jié)果顯示miR-384-5p可與PIK3CD的3’非編碼區(qū)結(jié)合，驗(yàn)證了二者的靶基因關(guān)系。白瑞娜[17]利用高通量芯片技術(shù)，對(duì)CHD血瘀證、瘀毒輕證、瘀毒重證以及健康對(duì)照組患者各5例，篩選差異miRNA表達(dá)譜和差異lncRNA，結(jié)果顯示has-miR-1228-3p、has-miR-3157-3p組間差異顯著；血瘀證組差異表達(dá)的lncRNA為FR066195、TCONS_00017783等211條。功能學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，差異miRNA參與免疫炎癥反應(yīng)、血小板活化等病理過(guò)程，差異lncRNA與炎癥、免疫、細(xì)胞黏附等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，提示miRNA與lncRNA均參與了CHD血瘀證的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

2.3 ncRNA研究思路展望

miRNA具有明顯的表達(dá)階段特異性和組織特異性，且以多種形式存在于基因組中，但大多位于基因間隔區(qū)，其廣泛性、多樣性和復(fù)雜性提示其與中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)的關(guān)系密切。其在進(jìn)化中高度保守，且血液中相對(duì)穩(wěn)定，是其有望成為證候生物標(biāo)志物的基礎(chǔ)。在動(dòng)物細(xì)胞中，miRNA也是先由DNA轉(zhuǎn)錄成原miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)，經(jīng)過(guò)Drosha酶切加工后形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的miRNA前體(miRNA precursor，pre-miRNA)，再經(jīng)過(guò)Dicer酶環(huán)切后才形成miRNA成熟體，其后不翻譯成蛋白，其作用機(jī)制包括翻譯抑制、介導(dǎo)完全配對(duì)mRNA的降解、介導(dǎo)不完全配對(duì)的mRNA衰退、靶mRNA的翻譯抑制以及正調(diào)控和去抑制。因此，其調(diào)節(jié)的下游作用包括通過(guò)mRNA而影響蛋白表達(dá)代謝通路，通過(guò)調(diào)節(jié)DNA甲基化而影響DNA轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)組蛋白構(gòu)象而影響染色質(zhì)狀態(tài)等。由此可見，雖然調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)涉及多個(gè)分子層次，但miRNA可能成為藥物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)與其他調(diào)節(jié)方式的相互作用實(shí)現(xiàn)“杠桿效應(yīng)”。相比miRNA、lncRNA調(diào)控機(jī)制更為復(fù)雜和廣泛[18]，其通過(guò)與miRNA、轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳修飾因子相互作用，以及誘餌、支架、向?qū)?、增?qiáng)等作用機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄前水平[19]、轉(zhuǎn)錄水平[20]、轉(zhuǎn)錄后水平[21]多種層面上調(diào)控基因表達(dá)水平。而新興的環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)，是通過(guò)外顯子環(huán)化或內(nèi)含子環(huán)化將3′和5′末端連接起來(lái)而形成閉合的共價(jià)環(huán)形結(jié)構(gòu)，具有高度穩(wěn)定性、高度保守性以及組織特異性以及時(shí)空表達(dá)特異性等特點(diǎn)，可與相應(yīng)的miRNA發(fā)揮海綿作用，也可直接與相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)果發(fā)揮調(diào)控作用，被研究者視為有望成為用于臨床診斷、治療敏感性預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷的新型生物標(biāo)志物。在內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)假說(shuō)中，lncRNA與circRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合共有的miRNA結(jié)合位點(diǎn)彼此制約。可見，ceRNA網(wǎng)絡(luò)更適合作為作用機(jī)制研究的切入角度。

3 表觀遺傳學(xué)研究展望

3.1 表觀遺傳學(xué)與中醫(yī)藥學(xué)

表觀遺傳學(xué)的某些特性與中醫(yī)學(xué)的一些特點(diǎn)比較吻合，因此表觀遺傳學(xué)的研究方法對(duì)證候本質(zhì)研究和中藥治療機(jī)制研究在思路上有很多啟示。一是環(huán)境可以影響表觀遺傳標(biāo)記，從而影響基因功能[22]。表觀遺傳學(xué)的研究思路體現(xiàn)在環(huán)境與自身的相互作用而導(dǎo)致基因表型的變化，這與中醫(yī)證候發(fā)生發(fā)展時(shí)間特異性的理論基礎(chǔ)一致，所以從表觀遺傳學(xué)層面闡釋證候發(fā)生發(fā)展的機(jī)制前景良好；二是表觀遺傳學(xué)調(diào)控不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動(dòng)，而且能夠在有絲分裂中遺傳給子細(xì)胞，其遺傳特性為研究中醫(yī)治本和療效持續(xù)的特點(diǎn)提供了新思路；三是相對(duì)于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)直接相互作用而言，表觀遺傳學(xué)的調(diào)控相對(duì)間接，而表觀遺傳學(xué)調(diào)控最重要的作用特點(diǎn)之一就是可逆轉(zhuǎn)[23]，這符合中醫(yī)治療雙向緩和的特色，為研究中藥作用機(jī)制提供新角度；四是在中藥作用機(jī)理研究方面。HSIEH等[24]對(duì)3294種中藥材中48 491個(gè)化合物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中29.8%的中藥處方作用機(jī)制與表觀遺傳調(diào)控和miRNA有關(guān)。在政府批準(zhǔn)的200種中藥復(fù)方中，99%的中藥復(fù)方與表觀遺傳調(diào)控和miRNA相關(guān)，而君藥最為顯著。另外，中藥的有效成分作為外源性miRNA也受到重視，其通過(guò)消化道進(jìn)入血液，這些調(diào)控信息也許能夠作用于人體的基因調(diào)控過(guò)程，可能成為中藥的新作用機(jī)制；五是所有復(fù)雜生物的基因組是病毒和轉(zhuǎn)座子入侵的潛在目標(biāo)，人類基因組45%是由遠(yuǎn)古進(jìn)入人體病毒DNA的遺留部分所演變[8]，基因組通過(guò)表觀遺傳相關(guān)的RNA沉默機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)入侵者特異性的免疫應(yīng)答，而人體這個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)與外界環(huán)境在基因水平交融中相互篩選、實(shí)現(xiàn)有序，與中醫(yī)天人相應(yīng)理論關(guān)系密切。

3.2 表觀遺傳方法學(xué)展望

復(fù)雜性疾病是多基因遺傳和環(huán)境等因素相互作用的結(jié)果，而表觀遺傳學(xué)機(jī)制則能很好地體現(xiàn)環(huán)境和基因的交互作用[25]。但目前的相關(guān)研究尚存在數(shù)量和質(zhì)量上的不足。首先，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)與以分子生物學(xué)技術(shù)為支持是進(jìn)行中醫(yī)表觀遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。其次，作為證候生物標(biāo)記物的研究，在考慮時(shí)間特異性和組織特異性的前提下，在獲得大樣本量標(biāo)本的基礎(chǔ)上，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法將樣本分為訓(xùn)練組與測(cè)試組，通過(guò)單變量Cox回歸方法，利用訓(xùn)練組數(shù)據(jù)分析血瘀證高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)基因，建立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型，再利用測(cè)試組進(jìn)行驗(yàn)證模型的特異性和靈敏度。另外，作為機(jī)制研究，通過(guò)生物信息學(xué)方法構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并設(shè)計(jì)細(xì)胞和動(dòng)物層面的功能學(xué)驗(yàn)證必不可少，從而試圖捕捉網(wǎng)絡(luò)中調(diào)節(jié)的關(guān)鍵點(diǎn)即“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”[26]，為進(jìn)一步闡釋“表型網(wǎng)絡(luò)-生物分子網(wǎng)絡(luò)-藥物網(wǎng)絡(luò)”的病證方關(guān)系[27]和基因治療提供依據(jù)。同時(shí)，中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論對(duì)于表觀遺傳學(xué)的研究也有重要的啟示意義。中醫(yī)理論經(jīng)過(guò)數(shù)千年療效的驗(yàn)證而積累了大量的客觀“結(jié)果”，若借此“反推”表觀遺傳學(xué)規(guī)律與本質(zhì)，也許更容易接近真實(shí)。而陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)則提示表觀遺傳學(xué)研究中更應(yīng)注意“失衡”的分子機(jī)制，而并非單一靶點(diǎn)的研究。挖掘中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論，為表觀遺傳學(xué)研究提供新思路，探索表觀遺傳調(diào)控的核心規(guī)律，這樣可以使兩個(gè)學(xué)科在更深層次上實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一。

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ResearchProgressonBloodStasiswithCoronaryHeartDiseaseinTermsofEpigenetics

CHEN Guang1,2, GAO Jia-liang1, LIU Yong-mei1, WANG Jie1△

(1.Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100053,China; 2.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Researching the essence of Blood Stasis Syndrome in Coronary Heart Disease in the field of epigenetics mainly involves DNA methylation and non-coding RNA. The mechanism of DNA methylation regulation is integral, reversible and indirect, while the mechanism of non-coding RNA regulation is comprehensive, sundry and complicated. Overall, the regulation in epigenetics has obvious specificity in time and space and it is relatively indirect. It reflects the interaction between genes and environment and the thought ofcorrespondencebetweenheavenandhumankindandconceptofholism, which provides a chance for studying the essence of TCM syndrome and mechanism of Chinese medicinal.

Coronary heart disease; Blood Stasis Syndrome; epigenetics; DNA methylation; microRNA; Review

R541.4

A

1006-3250(2017)09-1336-04

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473561)-冠心病血瘀證相關(guān)miRNA表達(dá)的甲基化調(diào)控機(jī)制研究；國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”重大科技專項(xiàng)(2013ZX09301307)-宣痹安痛方藥物研發(fā)

陳 光(1991-)，男，住院醫(yī)師，在讀博士，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病的臨床與研究。

王 階，男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師， 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院首席研究員，Tel:010-88001817,E-mail:wangjie0103@126.com。

2017-03-17