李赫宇，趙 玲

(1. 天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457； 2. 武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023)

HPLC法測定阿法替尼片中主藥和有關(guān)物質(zhì)的含量

李赫宇1，趙 玲2*

(1. 天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津 300457； 2. 武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢 430023)

目的：建立以高效液相色譜法測定阿法替尼片中主藥和有關(guān)物質(zhì)含量的方法，以控制該制劑的質(zhì)量。方法：色譜柱為Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙酸銨水溶液(30 mmol/L)-甲醇(25∶75)，流速為1.0 ml/min，紫外檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，進樣量為20 μl。結(jié)果：阿法替尼檢測濃度的線性范圍為60.13～600.45 μg/ml(r=0.999 6)；平均回收率為99.41%,RSD為0.86%。結(jié)論：建立的檢測方法簡單，結(jié)果準確可靠，可用于阿法替尼片的質(zhì)量控制。

阿法替尼，含量測定，高效液相色譜法，有關(guān)物質(zhì)

阿法替尼是由德國勃林格殷格翰公司研發(fā)的多靶點抗癌新藥，于2013年通過美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的審批，用以治療非小細胞肺癌、大腸癌、乳腺癌和頭頸癌的分子靶向制劑，商品名為Tovok/Gilotrif[1]。肺癌是臨床上最常見的惡性腫瘤，且肺癌患者里約85%為非小細胞肺癌，嚴重危害人類的生命健康，因此該藥一經(jīng)問世很快成為晚期非小細胞肺癌的一線治療新藥[2]。阿法替尼屬于多靶點酪氨酸激酶(TK) 抑制劑，是TK的不可逆性抑制劑，也是人類表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑[包括人類表皮生長因子受體2(HER2)、HER4兩個亞族]。阿法替尼片劑的主藥以阿法替尼馬來酸鹽的形式存在?！睹绹幍洹分猩形词蛰d阿法替尼的含量測定方法，為此，本文嘗試建立高效液相色譜(HPLC)法測定阿法替尼馬來酸鹽和有關(guān)物質(zhì)含量測定的方法，為阿法替尼片的質(zhì)量控制，以及評價其質(zhì)量的一致性提供可參考的依據(jù)。

1 儀器與試藥

美國agilent1260高效液相色譜系統(tǒng)；甲醇(美國Tedia公司產(chǎn)品，色譜純)；乙酸銨(天津市天力化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純)。阿法替尼片(武漢輕工大學(xué)制劑室，批號150801、150802、150803，規(guī)格：每片含阿法替尼馬來酸鹽59.12 mg，相當(dāng)于每片含阿法替尼40 mg)；阿法替尼對照品(武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，批號150922，質(zhì)量分數(shù)：99.82%)； 阿法替尼合成方法參考文獻完成[3]。

2 方法與結(jié)果

因阿法替尼馬來酸鹽在含水溶液中解離成馬來酸和阿法替尼，馬來酸為不飽和烯酸，極性較強，在ODS柱上保留時間短，先出峰，阿法替尼為有機堿，極性相對較弱，后出峰。本實驗按外標法以阿法替尼來計算含量。

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙酸銨水溶液(30 mmol/L)-甲醇(25∶75)，體積流量1.0 ml/min，紫外檢測波長為254 nm，柱溫25 ℃，進樣量20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取阿法替尼對照品，用流動相溶解,并制成阿法替尼質(zhì)量濃度為505.75 μg/ml的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取阿法替尼片劑研細為粉末適量，約相當(dāng)于阿法替尼12.643 75 mg，精密稱定，放置于25 ml量瓶中，用流動相乙酸銨水溶液-甲醇溶解并稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 有關(guān)物質(zhì)溶液制備 取阿法替尼片粉末適量，用流動相配制成質(zhì)量濃度為20 μg/ml的溶液作為供試液。再用流動相稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.2 μg/ml的對照液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液、供試品溶液各20 μl，按照“2.1”項下色譜條件注入液相色譜儀，記錄峰面積，并以流動相溶液乙酸銨水溶液(30 mmol/L)-甲醇(25∶75)作為參照。以阿法替尼峰面積計算，理論塔板數(shù)為8 478，保留時間為11.784 min，峰形對稱，見圖1。

2.4 線性關(guān)系與檢測限考查 精密稱取阿法替尼對照品適量，用流動相溶解并稀釋成阿法替尼質(zhì)量濃度分別為60.13、149.89、300.19、451.09和600.45 μg/ml的系列溶液，精密量取各溶液20 μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以進樣的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程A=1.018 5C+4.1315(r=0.999 6)。結(jié)果表明，阿法替尼質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系良好，線性范圍為60.13～600.45 μg/ml。以信噪比S/N=3計算，阿法替尼檢測限為0.4 ng。

1.阿法替尼

2.5 精密度試驗 取阿法替尼對照品適量，按照“2.2.1”項下方法制備對照品溶液，精密量取20 μl按照“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進樣5次進行測定。結(jié)果顯示峰面積積分值的RSD為0.68%，表明本方法精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一批號(批號為150802)的阿法替尼樣品6份，分別按照“2.2”項下的方法制備供試品溶液和對照品溶液，分別量取20 μl注入液相色譜儀，依“2.1”項下色譜條件下進行測定。結(jié)果顯示阿法替尼的平均質(zhì)量分數(shù)為99.18%，RSD為0.24%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取制備的供試品溶液1份，分別在0、1、2、4和8 h量取20 μl注入液相色譜儀，依“2.1”項下色譜條件測定，峰面積積分值的RSD為0.58%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗 取同一批號的樣品(批號150801)，按測試濃度的80%、100%和120% 3個梯度制備供試品溶液，分別加入一定質(zhì)量的阿法替尼對照品，每個濃度各取20 μl的3份樣品注入液相色譜儀，按照 “2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果平均回收率為99.41%，RSD為0.86%，見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=9)

2.9 中間體分離試驗及破壞性試驗 取阿法替尼對照品及中間體6-氨基-4-[(3-氯-4-氟-苯基)氨基]-7-[(S)-(四氫呋喃-3-基)氧基]喹唑啉(中間體Ⅰ)適量，用流動相配制成阿法替尼質(zhì)量濃度為20 μg/ml,中間體Ⅰ質(zhì)量濃度為2 μg/ml的溶液，作為中間體分離試驗的供試溶液。另取阿法替尼片劑粉末(約相當(dāng)于阿法替尼200 μg)5份，分別放置于10 ml的量瓶中。第1份量瓶里加入1 ml物質(zhì)的量為0.1 mol/L的鹽酸溶液；第2份量瓶里加入1 ml物質(zhì)的量為0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液；第3份量瓶里加入1 ml 3%的H2O2溶液。靜置2 h后，第1份量瓶里加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 ml酸堿中和后，加流動相稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為酸破壞的供試品溶液；第2份量瓶里加入0.1 mol/L的鹽酸1 ml酸堿中和后，加流動相稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為堿破壞的供試品溶液；第3份量瓶里加流動相稀釋至刻度，濾過，取續(xù)濾液作為氧化破壞的供試品溶液；第4份量瓶置于4 000 lx的光下照射6 h；第5份量瓶置于60 ℃水浴中加熱2 h。分別量取上述各量瓶里的供試品溶液20 μl注入液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。結(jié)果中間體化合物Ⅰ的峰與阿法替尼峰能完全分離；5種極端條件下(酸、堿、氧化、光照和高溫破壞)均有降解產(chǎn)物產(chǎn)生，而且5種降解產(chǎn)物都能與阿法替尼峰完全完分離。中間體分離試驗與5種極端條件破壞后的色譜見圖2。

1.馬來酸 2.雜質(zhì)Ⅰ 3.中間體Ⅰ 4.雜質(zhì)Ⅱ 5.阿法替尼

2.10 樣品含量測定 取阿法替尼片粉末、阿法替尼對照品適量，按“2.2”項下方法分別制備供試品溶液和對照品溶液。分別精密量取20 μl注入液相色譜儀，按照 “2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法以阿法替尼和阿法替尼馬來酸鹽的峰面積，計算含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測定 取阿法替尼片粉末適量，按“2.2”項下方法制備成供試液和對照液，量取對照液20 μl進樣，調(diào)節(jié)儀器檢測靈敏度，使阿法替尼峰峰高為滿量程的10%～30%；再量取供試液20 μl進樣，記錄色譜至主峰保留時間的3 倍，記錄主峰和有關(guān)物質(zhì)的峰面積，按1%自身對照法計算有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果3批樣品中有關(guān)物質(zhì)含量分別為0.19%、0.21%和0.20%。

3 討論

阿法替尼是FDA繼吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼批準上市的第4個分子靶向EGFR抑制劑，其是可逆性ATP競爭性抑制劑，已經(jīng)被確認為治療具有19和21位EGFR突變的晚期非小細胞肺癌最有效的手段，可提高腫瘤患者的生存期的生活質(zhì)量。但是，對其主藥的含量和有關(guān)物質(zhì)測定方法還鮮有報道。探討其主要成分的質(zhì)量控制方法，可以提高進口藥與國產(chǎn)藥的質(zhì)量一致性，為提高制劑水平提供依據(jù)。

3.1 檢測波長的選擇 前期進行了預(yù)實驗，分別稱取阿法替尼對照品和阿法替尼片劑粉末適量，用流動相乙酸銨水溶液-甲醇配制成質(zhì)量濃度約505.75 μg/ml的對照品溶液、供試品溶液，按照最新版《中國藥典》規(guī)定的紫外分光-光度法[5]操作，于200～400 nm波長內(nèi)進行檢測。結(jié)果顯示對照品溶液、供試品溶液均于254 nm處有最大吸收，且輔料溶液在此處無吸收，故檢測波長選為254 nm。

3.2 流動相的選擇 通過反復(fù)配制不同濃度、不同pH的乙酸銨溶液，同時不斷改變甲醇與乙酸銨溶液的比例，經(jīng)過多次調(diào)整，最后發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙酸銨水溶液濃度為30 mmol/L，與甲醇的比例為25∶75時，阿法替尼的主峰保留時間合適，峰形比較對稱，其與中間體、有關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物均能得到比較好的分離，該方法具有較強的專屬性，良好的準確度和精密度，溶液在8 h內(nèi)也穩(wěn)定。因此，最終確定使用75∶25的甲醇-30 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相。

1 劉丹，欒天，袁瑩，等. 多靶點酪氨酸激酶抑制劑阿法替尼及其類似物的研究進展[J]. 中國藥學(xué)雜志，2014，49(24)：2145-2149

2 安富榮，王淑萍，歸小龍. 晚期非小細胞肺癌一線治療新藥阿法替尼[J] .中國藥師，2015，18(1)：136-138

3 李晴晴，張慶文. 阿法替尼的合成路線圖解 [J] .中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2015，46(4)：422-425

4 Singer T, Colbatzky F, Platz S. Utilization of inhibitors of EGFR-mediated signal transduction for the treatment of benign prostatic hyperplasia (bph)/prostatic hypertrophy: WO, 2003094921A2 [P]. 2003-11-20

5 中國藥典[S]．二部.2010：附錄38

藥物與臨床

Quantitative determination of main component and related substances in afatinib tablets by HPLC

Li Heyu1, Zhao Ling2

(1.Tianjin Ubasic Health Nutrition Co Ltd，Tianjin 300457；2. College of Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023)

Objective： To establish an HPLC method for the determination of the main component and related substances in afatinib tablets．Methods： The determination was performed on Kormasil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with mobile phase composed of ammonium acetate solution(30 mmol/L)-methanol(25∶75) at a flow rate of 1.0 ml/min. The detection wavelength was set at 254 nm at 30 ℃. The injection size was at 20 μl．Results： The calibration curve of afatinib was linear in the range of 60.13～600.45 μg/ml(n=5，r=0.999 6)，and the average recovery of afatinib was 99.41%(RSD was 0.86%)．Conclusions： This method is rapid，accurate and reliable，and applicable for the quality control of afatinib tablets．

afatinib，content determination，HPLC，related substances

2016-05-27

*通訊作者：趙玲，E-mail：zhaolingcpu@126.com。

R927.2

A

1006-5687(2016)04-0022-04