王勇，王釗

（1.漳河上游管理局水文水環(huán)境中心，河北邯鄲056006；2.海河流域水資源保護(hù)局水環(huán)境監(jiān)測中心，天津300170）

固相萃取-高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法在北方河流水體氯霉素類抗生素測定中的應(yīng)用

王勇1，王釗2

（1.漳河上游管理局水文水環(huán)境中心，河北邯鄲056006；2.海河流域水資源保護(hù)局水環(huán)境監(jiān)測中心，天津300170）

建立了固相萃取-高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法，同時測定水中的4種氯霉素類抗生素（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺）殘留，采用MRM掃描方式在正/負(fù)模式下，在10 min內(nèi)完成對氯霉素類抗生素的分析，該方法線性范圍為1～100μg/L，相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，實際水樣加標(biāo)回收率為92.8%～117.48%。利用該方法對北方河流水樣進(jìn)行采樣調(diào)查，其中氟苯尼考檢出率較高為26%，達(dá)526.36 ng/L。該方法操作簡便，靈敏度高，重現(xiàn)性好，具有一定的推廣價值。

固相萃取；質(zhì)譜；氯霉素；水質(zhì)監(jiān)測；北方河流

氯霉素類（CAPs）藥物包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，這類藥物具有廣譜抗菌能力，常用于預(yù)防與治療動物疾病[1]，其中氯霉素曾在動物和人體上大量使用，但它會抑制人體骨髓造血功能從而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病[2]，已被禁止使用。歐盟、美國等均在食品法規(guī)中規(guī)定CAP殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為“零容許量”（Zero tolerance），即不得檢出[3]。

甲砜霉素和氟苯尼考屬于新型氯霉素類廣譜抗菌藥物，為氯霉素的替代藥物，因其極佳的治療效果正越來越廣泛地被應(yīng)用于治療包括水產(chǎn)養(yǎng)殖在內(nèi)的動物疾病。同時，其對動物有胚胎毒性，用藥后還會出現(xiàn)厭食、腹瀉等不良反應(yīng)，對消費者的危害也逐漸被人們發(fā)現(xiàn)。目前，國內(nèi)外檢測該類藥物殘留的方法主要有微生物法、免疫分析方法和儀器分析方法、高效液相色譜法[4-6]，其中LC/MS成為確證氯霉素殘留分析方法的發(fā)展趨勢。

針對這些情況，建立了固相萃取-高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法以測定水中的4種氯霉素類抗生素（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺），優(yōu)化了前處理條件和分離檢測條件，并應(yīng)用于實際水樣的檢測分析。該方法具有操作簡單，試劑少，靈敏度高、定量準(zhǔn)確，線性范圍寬等優(yōu)點。

1 試驗材料和條件

1.1 材料

甲醇購自賽默飛世爾公司，色譜純，純度＞99.9%；乙腈購自J.T.baker公司，色譜純，純度＞99.9%；甲酸購自J.T.baker公司，色譜純，純度＞98.0%；氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr. Ehrenstorfer公司；標(biāo)準(zhǔn)儲備液取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇為溶劑，配置濃度為100 mg/L。

1.2 條件

（1）液相條件。柱溫為35℃，流動相為乙腈和0.01%甲酸/水，流動梯度洗脫程序見表1。

表1 流動梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源（ESI），檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測，干燥氣為氮氣，干燥氣溫度為350℃，干燥氣流速為10 L/min。氯霉素類抗生素質(zhì)譜分析的條件參數(shù)，見表2。

表2 氯霉素類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

依次用10 mL甲醇和10 mL純水，以3 mL/min流速活化HLB固相萃取小柱，取400 mL水樣調(diào)節(jié)pH為3～4，以10 mL/L的流速上樣，用6 mL甲醇分3次洗脫小柱，洗脫液在40℃由氮吹至近干，用乙腈/水（2∶8體積比）定容至1 mL，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取方法優(yōu)化

（1）固相萃取柱選擇。C18為反相萃取柱，以十八烷基鍵合硅膠為填料，通過加標(biāo)回收率試驗發(fā)現(xiàn)，C18小柱對4種目標(biāo)物質(zhì)的回收率均較低，約為35%～55%。而Oasis HLB固相萃取小柱以N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯苯共聚物為填料，通過加標(biāo)回收率試驗發(fā)現(xiàn)，HLB小柱對4種目標(biāo)物質(zhì)的回收率均在90%以上，因此選用HLB小柱作為固相萃取柱。

（2）洗脫溶劑和體積選擇。研究了4種甲醇∶水配比（分別為100∶0、90∶10、80∶20、70∶30）與4種洗脫體積（依次為2×2、3×2、4×2和5×2 mL）組合對目標(biāo)物質(zhì)的洗脫效果。其中，洗脫溶液為100%甲醇且體積為3×2 mL時洗脫效果最佳，各目標(biāo)物質(zhì)的回收率最高。

2.2 HPLC-MS/MS條件優(yōu)化

氯霉素類化合物因含有酚羥基而適合在ESI源負(fù)離子模式下離子化，其產(chǎn)生的母離子為［M-H]－，代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺則適合在ESI源正離子模式下離子化。

試驗在干燥氣氮氣溫度為350℃、流速為10L/min的條件下，在電噴霧正離子模式下，對100 μg/mL的氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其質(zhì)子化分子離子[M+H]+；在電噴霧負(fù)離子模式下，再分別對100 μg/mL的甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其質(zhì)子化分子離子[M-H]－，然后以這些分子離子作為母離子對其子離子進(jìn)行全掃描，最后選取豐度較強(qiáng)的兩對離子，優(yōu)化其錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。

采用正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜采集時，通常需在溶液中加入甲酸使分析物容易質(zhì)子化而帶上正電荷，但是使用甲酸后甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素的負(fù)離子模式采集會受到抑制。本試驗發(fā)現(xiàn)，以乙腈和水作為流動相，各組分均能得到較好的分離，在質(zhì)譜上均有較強(qiáng)的響應(yīng)，并且峰形好看，與已有報道現(xiàn)象相同[7，8]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以乙腈/水（2∶8體積比）逐級（0.1、1、10、50、75、100 μg/L）稀釋的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在試驗條件下進(jìn)樣（10 μL），結(jié)果經(jīng)線性回歸，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)液濃度（x）為橫坐標(biāo)繪圖，獲得氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的線性方程。4種氯霉素類抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及回收率，見表3。

表34種氯霉素類抗生素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及回收率

2.4 實際水樣分析

采用SPE-HPLC/MS/MS方法對北方河流150個站點河水進(jìn)行了采樣調(diào)查，實際水體加標(biāo)回收率為92.8%～117.48%。試驗結(jié)果顯示，河水中氟苯尼考檢出率最高為26%，濃度為0～526.36 ng/L。

氟苯尼考被應(yīng)用于治療包括水產(chǎn)養(yǎng)殖在內(nèi)的動物疾病。檢出濃度較高的地點，附近可能有養(yǎng)殖場的存在，由于下雨沖刷隨地表徑流進(jìn)入河道。從季節(jié)來看，8和11月檢出率較高，可能由于養(yǎng)殖場的管理不善和正值投藥時間。

3 結(jié)語

氯霉素類抗生素的監(jiān)測多為高效液相色譜檢測。在試驗過程中，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜只是依靠保留時間定性，對于多種物質(zhì)的檢測需要通過對各個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時間分離；對于復(fù)雜的水樣來說，其有可能出現(xiàn)重疊峰，進(jìn)而會影響定量。而高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用法，是通過物質(zhì)的母離子和子離子來定性，每種物質(zhì)都有特定的組合，能更好地適應(yīng)復(fù)雜的水樣定量監(jiān)測。

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X832

B

1004-7328（2016）06-0065-03

10.3969/j.issn.1004-7328.2016.06.021

2016—07—21

王勇（1966—），男，高級工程師，主要從事水文水資源管理、水質(zhì)監(jiān)測工作。