徐 娟，汪 滔，付雪薇，劉蘭萍，李 靜

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

桑葉水提液體外清除亞硝酸鹽作用研究

徐 娟，汪 滔，付雪薇，劉蘭萍，李 靜*

(安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100)

目的:對(duì)桑葉水提液的降低亞硝酸鹽作用進(jìn)行研究，確定清除的最佳條件。方法:采用水浸提法，考察提取溫度、提取時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)用量4個(gè)因素對(duì)桑葉水提液的降低亞硝酸鹽作用的影響，用正交試驗(yàn)法優(yōu)化最佳清除條件。結(jié)果:4個(gè)因素的影響的次序?yàn)樘崛囟?反應(yīng)用量>反應(yīng)時(shí)間>提取時(shí)間，最佳清除條件為提取溫度30 ℃，提取時(shí)間1.5 h，反應(yīng)時(shí)間15 min，反應(yīng)用量15 mL，清除率可達(dá)49.71 %。結(jié)論:桑葉水提液在體外對(duì)亞硝酸鹽具用一定的消除作用，可作為桑葉新功效加以開(kāi)發(fā)。

正交試驗(yàn)；桑葉；鹽酸萘乙二胺法；亞硝酸鹽；清除率

XU Juan, WANG Tao, FU Xue-wei, LIU Lan-ping, LI Jing*

(College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

亞硝酸鹽具有一定的毒性，一方面，大劑量的亞硝酸鹽進(jìn)入機(jī)體內(nèi)會(huì)造成中毒，另一方面，部分亞硝酸鹽在一定條件下會(huì)轉(zhuǎn)化為亞硝胺，而亞硝胺是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)[1]。在蔬菜、肉類食品中常含有亞硝酸鹽[2]，由于氮肥施用的增加、設(shè)施技術(shù)應(yīng)用及環(huán)境污染的影響，使亞硝酸鹽的含量呈增加趨勢(shì)[3]，成為影響食品安全的重要因素，將食品和膳食中的亞硝酸鹽的含量降低到安全水平是保證人體安全的重要舉措。據(jù)悉，食用各種新鮮水果和蔬菜可以一定程度地抑制亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝胺。果蔬中還原性成分的種類、含量及其氧化還原特性是果蔬對(duì)亞硝酸鹽的消除能力的關(guān)鍵。桑葉是?？浦参锷５母稍锶~，具有散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目等功效，可治療頭暈頭痛，目赤昏花等病癥，其富含黃酮、多糖和生物堿等生物活性成分[4]，桑葉總黃酮含量較多[5]，可以作為食品中黃酮來(lái)源的主要方面。桑葉的抗衰老，抗突變的作用與含有大量的黃酮有密切關(guān)系。研究證明，植物黃酮能有效抑制亞硝化反應(yīng)[6]。桑葉在中國(guó)擁有藥物使用的悠久歷史，且資源豐富，是國(guó)家認(rèn)證的藥食同源的食品，可長(zhǎng)期代茶飲用。桑葉在生活中的應(yīng)用主要是用水沖泡代茶飲，所以本試驗(yàn)中采用水提法進(jìn)行研究。目前在桑葉提取物對(duì)清除亞硝酸的研究報(bào)道很少，本試驗(yàn)從提取溫度，提取時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)量四個(gè)方面，確定桑葉提取液在清除亞硝酸鹽過(guò)程中的影響因素，用正交試驗(yàn)確定清除亞硝酸鹽的最佳條件，可作為對(duì)今后桑葉功效的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葉(MorusalbaL)，生產(chǎn)許可證號(hào)：皖Y20050050，桑葉產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：151227，生產(chǎn)日期：2015.12.27，生產(chǎn)廠家：亳州市永剛飲片廠有限公司，經(jīng)安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院時(shí)維靜教授鑒定為正品；氨基苯磺酸，分析純，國(guó)營(yíng)上海第一制藥廠，批號(hào) H41023771；鹽酸萘乙二胺，分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：H31021689；鹽酸，分析純，蚌埠化學(xué)試劑廠，批號(hào)：H41020227；亞硝酸鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：H41020228。

1.2 試驗(yàn)儀器與器材

L-16C臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；紫外、可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司生產(chǎn)，(蘇)制(05000111)號(hào)；HH-S恒溫水浴鍋，江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；YD-6000電子分析天平，上海精科天平生產(chǎn)；FA-1004電子天平，上海精密科學(xué)儀器科學(xué)有限公司生產(chǎn)；XW-80A微型漩渦混合儀，上海分析儀器廠有限公司生產(chǎn)；可調(diào)移液器等。

1.3 藥品的制備

桑葉，去除雜質(zhì)后，放入粉碎機(jī)中1800 r/min進(jìn)行3 min的粉碎。每份提取液均用10 g桑葉，加入100 mL蒸餾水，在不同條件(溫度、時(shí)間)下提取，然后用3000 r/min離心10 min，取上清液備用。

亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.1 g的亞硝酸鈉，移入250 mL容量瓶中進(jìn)行加水溶解，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為亞硝酸鈉儲(chǔ)備液(400 μg/mL)。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用前，吸取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液1.25 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液為亞硝酸鹽使用液(5 μg/mL)。

準(zhǔn)確吸取5 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL量瓶中，加入0.4 %的對(duì)氨基苯磺酸溶液1 mL，搖勻靜置5 min。再加入0.2 %的鹽酸萘乙二胺0.5 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加NaNO2(亞硝酸鈉)標(biāo)準(zhǔn)液作參比，在最大吸收波長(zhǎng)538 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，NaNO2濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 亞硝酸鹽清除率的測(cè)定

亞硝酸鹽含量用鹽酸萘乙二胺比色法[7]測(cè)定。準(zhǔn)確吸取5 μg/mL NaNO2兩份各2 mL分別置于10 mL試管中，其中一份加入5 mL 提取液，搖勻反應(yīng)5 min，另一份加蒸餾水作空白對(duì)照。兩份都加入0.4%對(duì)氨基苯磺酸1 mL，搖勻靜置5 min。再都加入0.2 %鹽酸萘乙二胺0.5 mL，混勻，靜置15 min，用2 cm 比色皿于538 nm 處測(cè)定吸光度，分別為A1、A2。按下式計(jì)算桑葉提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

清除率(%)=(A2-A1)/A2×100%

A1—— 加桑葉提取液測(cè)得值

A2—— 未加桑葉提取液測(cè)得值

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 桑葉的提取溫度對(duì)亞硝酸鹽的清除作用 各稱取桑葉樣品10 g于6個(gè)燒杯中，分別加入100 mL蒸餾水。分別在不同溫度(30 ℃、42 ℃、54 ℃、66 ℃、78 ℃、90 ℃)下水浴浸提0.5 h，然后用紗布過(guò)濾，靜置，取上清液3000 r/min離心10 min取上清液用濾紙過(guò)濾，取濾液5 mL，均加入5 μg/mL的亞硝酸鈉2 mL，反應(yīng)5 min，另作空白。測(cè)得對(duì)亞硝酸鹽的清除率。試驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值，確定出最佳提取溫度。

1.5.2 桑葉的提取時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的清除作用 各稱取桑葉10 g于5個(gè)燒杯中，分別加入100 mL蒸餾水。在1.5.1步驟確定的最佳浸提溫度下分別浸提(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h)，然后用紗布過(guò)濾，靜置，取上清液，3000 r/min離心10 min，取5 mL桑葉提取液于10 mL試管中，加入5 μg/mL的亞硝酸鈉2mL，反應(yīng)5 min然后均加入對(duì)氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺，顯色。測(cè)得提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，確定出最佳提取時(shí)間。

1.5.3 桑葉提取液的反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的清除作用 稱取桑葉樣品10 g于燒杯中，加入100 mL蒸餾水。在1.5.1步驟確定的最佳浸提溫度下提取，提取時(shí)間為1.5.2步驟確定的最佳提取時(shí)間，然后用紗布過(guò)濾，靜置，取上清液3000 r/min離心10 min。取上清液用濾紙過(guò)濾，取5 mL提取液，均加入5 μg/mL 的亞硝酸鈉2 mL，反應(yīng)不同的時(shí)間(1 min、5 min、15 min、25 min、35 min)。均加入對(duì)氨基苯磺酸，鹽酸萘乙二胺，顯色。測(cè)得提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5.4 桑葉提取液的用量對(duì)亞硝酸鹽的清除作用 各稱取桑葉樣品10 g于5個(gè)燒杯中，分別加入100 mL蒸餾水。在1.5.1步驟確定的最佳浸提溫度下，提取時(shí)間為1.5.2步驟確定的最佳提取時(shí)間，然后用紗布過(guò)濾，靜置，取上清液 ，3000 r/min離心10 min。取上清液用濾紙過(guò)濾，分別取不同計(jì)量(1 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL)的濾液，均加入5 μg/mL的亞硝酸鈉2 mL反應(yīng)15 min，然后均加入對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，顯色。測(cè)得提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用正交試驗(yàn)優(yōu)選提取和反應(yīng)條件，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、提取時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)用量為影響因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表 1。

表1 因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 亞硝酸鈉濃度與吸光度

圖1 亞硝酸鈉的濃度與吸光度

圖2 不同溫度浸提的桑葉提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率

由表2及圖1可知，吸光度與亞硝酸鈉的濃度呈線性關(guān)系。

2.2 桑葉的提取溫度對(duì)亞硝酸鹽的清除作用的影響

由圖2可見(jiàn)，在一定條件下，伴隨提取溫度的升高，桑葉提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率逐漸降低。清除率在30 ℃時(shí)達(dá)到最大。在溫度為90 ℃時(shí)，幾乎沒(méi)有清除率。本試驗(yàn)表明，只有較低的溫度才能促使桑葉中清除亞硝酸鹽的有效成分釋放，當(dāng)溫度過(guò)高后可能造成桑葉有效成分失活，從而無(wú)法對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行消解作用。

2.3 桑葉的提取時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的清除作用的影響

由圖3可見(jiàn)，在提取時(shí)間0.5 h到1.5 h時(shí)間段，清除率與提取時(shí)間成正比關(guān)系。在桑葉水浴提取1.5 h時(shí)，對(duì)亞硝酸鹽的清除率達(dá)到最大，在提取時(shí)間繼續(xù)增大到2.0 h到2.5 h時(shí)，其清除率反而減小。表明浸提1.5 h時(shí)，桑葉中清除亞硝酸鹽的有效成分基本上已全部溶出。在1.5 h以后消除率下降明顯，表明在長(zhǎng)時(shí)間的浸提過(guò)程中桑葉的有效成分有所減少。

圖3 不同浸提時(shí)間的桑葉提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率

圖4 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽清除作用的影響

2.4 桑葉提取液的反應(yīng)時(shí)間對(duì)亞硝酸鹽的清除作用的影響

由圖4可見(jiàn)，在30 ℃下，提取時(shí)間1.5 h下，在桑葉提取液與亞硝酸鹽的反應(yīng)時(shí)間在1 min到10 min時(shí)，清除率與反應(yīng)時(shí)間成正比，反應(yīng)10 min時(shí)達(dá)到最大，以后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，清除率與反應(yīng)時(shí)間成反比。表明此條件下桑葉提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除在10 min左右全部完成，而后在反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)過(guò)程中可能由于黃酮的水溶性較強(qiáng)造成產(chǎn)物的分解，從而使消解率下降。

2.5 桑葉提取液的用量對(duì)亞硝酸鹽的清除作用的影響

由圖5可見(jiàn)，在30 ℃下，提取時(shí)間1.5 h下，在桑葉提取液用量在1 mL到10 mL之間時(shí)，亞硝酸鹽的清除率與提取液的用量之間成正比關(guān)系，以后隨著用量的增加，清除率與提取液用量成反比，在提取液10 mL時(shí)消除率最高。表明當(dāng)桑葉提取液的用量在增加到一定量之后，桑葉類的其他物質(zhì)會(huì)對(duì)還原性物質(zhì)的還原性活性有滅活作用。

圖5 桑葉提取液用量對(duì)亞硝酸鹽的清除率的影響

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，各因素影響桑葉水提液清除亞硝酸鹽作用的主次因素為: 提取溫度>反應(yīng)用量>反應(yīng)時(shí)間>提取時(shí)間，最佳提取條件為A1B3C3D3，即提取溫度 30 ℃，提取時(shí)間1. 5 h，反應(yīng)時(shí)間 15 min，反應(yīng)用量15 mL，清除率可達(dá)49.71%。由表4方差分析可知，提取溫度、提取時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)用量均為顯著因素。

表3 L9(3)4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 方差分析

3 結(jié)論與討論

桑葉主要成分黃酮類、生物堿、桑葉多糖等[8]，因?yàn)辄S酮類是大多數(shù)氧自由基的清除劑，所以能阻斷亞硝胺的合成，達(dá)到清除亞硝酸鹽的作用[9-10]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，桑葉提取液對(duì)亞硝酸鹽具有一定的的清除作用。不同條件下如浸提溫度、浸提時(shí)間、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)用量，均對(duì)亞硝酸鹽的清除率都有一定的影響。胡利[11]的研究表明，桑葉黃酮在較高溫度下對(duì)亞硝酸鹽表現(xiàn)更大的清除作用，清除機(jī)理可能與其抗氧化活性有關(guān)。而本試驗(yàn)的結(jié)果表明在30 ℃條件下清除率最高，說(shuō)明水提方法中提取出的是多種成分，推測(cè)桑葉中除黃酮發(fā)揮分解亞硝酸鹽作用。硝酸鹽和亞硝酸鹽是自然界氮素循環(huán)的必然產(chǎn)物。正常情況下，植物將體內(nèi)的硝酸鹽和亞硝酸鹽不斷地合成蛋白質(zhì)，但當(dāng)蔬菜收獲以后，合成代謝下降，一部分硝酸鹽殘留在植物體內(nèi)[12]。自然界能使亞酸鹽還原的菌有100多種，紀(jì)淑娟[13]等對(duì)大白菜泡菜發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽消長(zhǎng)規(guī)律的研究吋，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽的含量迅速上升的同時(shí)，微生物也會(huì)大量的生長(zhǎng)繁殖。而植物本身在浸泡發(fā)酵過(guò)程中更會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽[14]。有研究表明對(duì)亞硝酸鹽的清除能力與其本身抗氧化能力密切相關(guān)[15]。桑葉可消除亞硝酸鹽的功效具有新的開(kāi)發(fā)價(jià)值，例如桑葉食品添加劑或桑葉茶等。桑葉清除亞硝酸鹽具有方便，無(wú)害，無(wú)殘留，價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)也存在一定的不足之處，例如在水提之后，未確定其中具體的物質(zhì)成分，從而在分析過(guò)程中也存在一些不到之處。

在本次試驗(yàn)中首次討論了桑葉提取液清除亞硝酸鹽的影響條件，結(jié)果表明不同提取溫度，不同提取時(shí)間，不同的反應(yīng)時(shí)間和不同的提取液用量對(duì)亞硝酸鹽的分解都會(huì)產(chǎn)生一定的影響。在溫度30 ℃，提取1.5 h ，反應(yīng)15 min，用量15 mL時(shí)清除率最高，可達(dá)49.71 %。

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(責(zé)任編輯：馬世堂)

Study on the Water Extract of Mulberry Leaf Scavenging Effect on Nitrite in Vitro

Objective: To investigate the anti-nitrosation of aqueous extract from mulberry leaf by orthogonal design, and to determine the optimum conditions for nitrite scavenging effect. Methods:The influence of temperature, soak time，reaction time and dosage on anti-nitrosation of aqueous extract of mulberry leaf, the optimum condition for nitrite scavenging effect was optimized by orthogonal test. Results: The primary and secondary were in the model of temperature > dosage >reaction time > soak time, and the optimum condition of the four factors was at 30 ℃, 1.5 h, reaction time 15 min, dosage 15 ml, and the clearance rate can reach to 49.71 %. Conclusion: Mulberry leaf aqueous extract in vitro with nitrite with a certain role in the elimination can be exploited and utilized as another new effect.

Orthogonal design; Mulberry leaf; Hydrochloride naphthyl ethylenediamine law; Nitrite; Clearance rate

2016-07-09

安徽省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(S10879CX04)；安徽科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科基金項(xiàng)目(AKXK20101-2) ；安徽科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科基金項(xiàng)目(AKZDXK2015A04)

徐娟(1994-)，女，安徽省合肥市人，在讀本科生，主要從事獸用中藥與飼料開(kāi)發(fā)。*通訊作者:李靜，副教授， E-mail：lij@ahsteu.edu.cn。

R932

A

1673-8772(2016)06-0071-06